刺五加注射液對模擬失重大鼠心血管功能調節作用研究

朱元兵，徐 沖，范全春，武曉瑞，趙 爽，陳 超，盧衛紅，劉軍蓮*

（1. 哈爾濱工業大學化工與化學學院，黑龍江 哈爾濱 150000；2. 中國航天員科研訓練中心，北京 100094）

隨著我國載人航天事業的不斷發展，建立空間站的步伐越來越近，在太空停留的人員數量和時間會逐漸增加，太空惡劣的環境尤其是失重，會對心血管功能和結構造成負面影響[1]。失重會引起液體向頭部移動，誘發機體心臟體積、重量和功能等異常，航天員在長期任務中，心臟輸出量的增加，全身血管阻力顯著降低，而返回地球通常會立位耐力不良，并可能發生心肌萎縮[2]。事實上，NASA 的證據報告已經描述了在著陸后左心室重量減少持續超過 3 天的現象[3]。此外，尾懸吊 21 d 模擬失重的大鼠心室重量減少，模擬失重 8 周的大鼠心肌細胞體積減少 23%[4]，這種動物失重模型的心臟和泵血功能降低可能與立位耐力不良有關。我們在前期研究模擬失重大鼠心肌組織蛋白質組學的基礎上，發現鈣調神經磷酸酶（Calcineurin, CaN）在模擬失重大鼠心肌中的表達發生變化，CaN 在心肌和骨骼肌慢纖維中特異表達，它不僅是 Z 線組成的結構蛋白，而且在信號轉導和調節酶活性中也具有重要作用，因此該蛋白表達量變化，直接影響了心肌的收縮力[5]。刺五加（Acanthopanax senticosus(Rupr. Maxim.) Harms）含皂苷、黃酮等藥理成分，早期有刺五加用于針對失重大鼠骨流失[6]以及血脂、血糖和免疫功能的報道[7]。刺五加還可擴張血管、增加冠脈血流量，緩解冠脈痙攣，改善缺血心肌代謝，增加組織對缺血缺氧的耐受性；此外，還能降低血液粘度、活血化瘀，疏通冠脈瘀阻，緩解心絞痛[8]。其擴張血管、增加血流量、改善腦循環、降低組織耗氧量的作用優于丹參，對缺血再灌注心肌能產生適應性保護作用[9]。然而，鮮有對失重心血管的保護作用研究。因此，本課題旨在對模擬失重大鼠心血管功能進行分析及刺五加注射液（Acanthopanax senticosusinjection, ASI）在 CaN 相關信號通路 Ca2+/CaN/NFAT3 的干預機理進行研究。

1 材料與方法

1.1 動物及模擬失重

SPF 級 6 周齡的 SD 雄性大鼠 50 只，體重 180 g 左右，購自北京維通利華動物實驗動物技術有限公司，在 SPF 級動物室中適應飼養 1 周后，按體重配對原則隨機分為空白組（k）、懸吊組（m），ASI 大劑量（g）、中劑量組（z）和小劑量組（x），每組 10 只。模擬中長期失重采取尾部懸吊 4 周法[10]，在懸吊 4 周后進行心臟超聲，戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，后斷頭處死，取心臟，稱重。取左心室游離壁組織約 100 mg，于液氮中速凍10 min 后置于 -80℃ 冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：S1063S 鈣含量顯色檢測試劑盒（Beyotime）；Trizol（Invitrogen 公司）；TRANScript RT Kit 逆轉錄試劑盒（天根公司）；CAN（cell signaling）、NFAT3（cell signaling）、P-NFAT3（cell signaling）、β-actin（cell signaling）；qPCR 試劑盒：FAST qPCR Kit Master Mix (2 ×) Universal（KR0319, KAPA SYBR?）

儀器：Beckman Allgre 21R 高速冷凍離心機（Beckman 公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）；BioSens SC810B 凝膠成像儀（上海山富科學儀器有限公司）；NAS-99 分光光度計（ACTGene 公司）；ABI 7900HT 實時定量 PCR 儀（ABI 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 心臟指數

心臟指數是心臟重量與體重的比值。

1.3.2 心臟超聲

采用 vevo2100 的動物心臟超聲儀，MS250 探頭進行超聲檢查。將大鼠麻醉，固定在超聲實驗臺上，分別在胸骨旁短軸切面和胸骨旁長軸切面進行測量。

1.3.3 心肌酶譜

取大鼠血清，上樣于美國貝克曼 TBA120 全自動生化分析儀，分析心肌酶譜，檢測的指標有乳酸脫氫酶（LDH）、谷草轉氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、α-羥丁酸脫氫酶（HBMB）。

1.3.4 鈣離子濃度

取大鼠血清，利用鈣含量顯色檢測試劑盒測樣本中的 Ca2+含量。

1.3.5 qPCR 檢測

a. 引物設計合成

根據基因名稱等信息到 Genebank 中查找到相應序列，使用 Primer 5 軟件設計擴增引物并合成。具體序列見表1：

Table 1 Primer sequence of mRNA related to rat myocardial tissue after four weeks of simulated weightlessness表1 模擬失重四周大鼠心肌組織相關 mRNA 的引物序列

b. RNA 提取和質檢（見表2）

c. 逆轉錄 mRNA 反轉錄體系（見表3）

Table 3 Reverse transcription mRNA reverse transcription system表3 逆轉錄 mRNA 反轉錄體系

d. real-time PCR SYBR Green Ⅰ PCR 體系（見表4）

Table 4 Real-time PCR SYBR Green Ⅰ PCR system表4 Real-time PCR SYBR Green Ⅰ PCR 體系

e. PCR 程序（見表5）

1.3.6 蛋白質提取及 Western blot 實驗

提取大鼠心肌組織總蛋白，蛋白濃度采用 BCA 法測定。SDS-PAGE 凝膠電泳，370 mA 轉膜 1 h，封閉 1 h，孵育 1 抗。具體材料及使用稀釋比例如下：CAN（CST, 1∶1 000）、NFAT3（CST, 1∶1 000）、P-NFAT3（CST, 1∶1 000）、β-actin（CST, 1∶1 000）。4℃ 孵育過夜，PBST洗膜 6 次，每次 5 min。室溫孵育相應的 2 抗 2 h。ECL 發光液發光，利用 Quantity One 軟件分析條帶灰度。

1.3.7 統計學處理

采用 SPSS 20.0 統計軟件進行數據處理，以（x?±s）表示。多組之間的比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA），進一步采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 模擬失重四周對大鼠體重、心臟指數及心臟動態超聲的影響及刺五加注射液的干預作用

如表5 所示，模擬失重四周大鼠體重明顯下降，但無統計學意義；ASI 對模擬失重導致的體重下降可能沒有明顯的改善作用，從統計結果發現，ASI 組間存在劑量依賴性，以小劑量組體重較好。心臟指數是心臟重量與體重的比值，在一定程度上反映心功能的變化，結果發現，模擬失重組與空白組未發現明顯變化，但是刺五加大中小三個劑量組的心臟指數明顯增高，且存在劑量相關性，以高劑量增加最明顯。模型組大鼠心率較空白組顯著升高（P<0.05），ASI 各個劑量組都不同程度能減慢心率，其中以中劑量組較明顯，但無統計學意義。

模擬失重四周大鼠心臟短軸超聲結果發現，模型組左室前壁舒張末期厚度（LVAW; d）、左室前壁收縮末期厚度（LVAW; s）、左室舒張末期內徑（LVID; d）、左室收縮末期內徑（LVID;s）、左室后壁舒張末期厚度（LVPW; d）和左室后壁收縮末期厚度（LVPW; s）較空白組均有減小趨勢，其中 LVAW; s 減小較顯著（P＜0.05）。對比模型ASI 小劑量組對 LVAW; d 和LVID;s 顯著增加，高劑量組顯著增加 LVID; d（P＜0.05）。模擬失重四周大鼠心臟長軸超聲結果發現，模型組大鼠左室舒張末期室間隔厚度（IVS; d）、左室收縮末期室間隔厚度（IVS; s）、左室舒張末期內徑（LVID; d）、左室收縮末期內徑（LVID; s）、左室后壁舒張末期厚度（LVPW; d）和左室后壁收縮末期厚度（LVPW; s）較空白組均減小，但僅 LVID; s 減小顯著，其余不顯著。高劑量 ASI 相比于失重模型，顯著提高了長軸 LVID; d 指標（P＜0.05），中小劑量組在心臟長軸參數的改善作用不明顯。

模型組大鼠短軸和長軸的左室射血分數（EF）和左室縮短率（FS）均有升高趨勢但不顯著，其中 ASI 小劑量組升高較模型組更顯著（P＜0.05）。模型組大鼠短軸和長軸的每搏量較空白組減少，其中 ASI 小劑量組大鼠心臟短軸的每搏量增加明顯（P＜0.01），長軸每搏量也增加但無統計學意義。模型組大鼠短軸和長軸的心排量較空白組均有降低，其中ASI 小劑量組大鼠心臟短軸的心排量增加明顯（P＜0.05）。

2.2 模擬失重四周對大鼠心肌酶譜變化影響及刺五加注射液的干預作用

模擬失重四周，檢測大鼠血清中的心肌酶譜，發現乳酸脫氫酶（LDH）、谷草轉氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、α-羥丁酸脫氫酶（HBMB）均有不同程度的升高，其中模型組 CK 和 CKMB 較空白組明顯升高（P<0.05），提示模擬失重四周后大鼠心肌組織有不同程度的損傷，ASI 不同劑量組針對升高的心肌酶有降低趨勢，說明ASI 對模擬失重造成的心肌損傷具有一定程度的修復作用。

2.3 模擬失重四周對大鼠血清 Ca2+ 濃度的變化影響及刺五加注射液的干預作用

模擬失重四周，大鼠心肌受到不同程度的損傷，心肌細胞的通透性發生變化，細胞內鈣超載，相應鈣外流減少，不足以維持心肌正常的舒縮活動，損傷持續，檢測結果見表7，發現模擬失重四周大鼠血清中鈣離子濃度有下降趨勢，ASI 對鈣離子濃度的影響與模型組比較雖無統計學差異，但有升高趨勢。

Table 7 Four weeks of simulated weightlessness on the changes of serum Ca2+ concentration in rats and the effect of acanthopanax senticosus injection表7 模擬失重四周對大鼠血清 Ca2+ 濃度變化及刺五加注射液的影響

2.4 模擬失重四周大鼠心肌組織相關 mRNA 表達變化及刺五加注射液的干預作用

相對表達分析結果或樣本拷貝數見表8，模擬失重四周，分析大鼠心肌組織發現：模型組較空白組α-actin 表達量增高，ASI 高劑量組α-actin 表達具有降低趨勢，可能說明模擬失重四周對大鼠心肌沒有達到嚴重損傷的程度，同時，也說明 ASI 具有改善心功能的作用。模型組大鼠心肌組織 CaN mRNA 表達量較正常組升高，ASI 劑量組對模型組升高的CaN mRNA 有不同程度的降低作用，小劑量組降低最明顯（P<0.001）。模型組大鼠心肌組織 Myh6 mRNA 表達量較正常組降低，ASI 高中劑量組 Myh6 mRNA 表達明顯升高（P<0.01）。模型組大鼠心肌組織 Myh7 mRNA 表達量較正常組明顯降低（P<0.05），ASI 中劑量 Myh7 mRNA 表達組明顯升高（P<0.01）。模型組大鼠心肌組織 ANF mRNA 表達量較正常組升高，ASI 高中劑量組 ANF mRNA 表達升高，各劑量組間存在劑量關系。模型組大鼠心肌組織 BNP mRNA 表達量較正常組升高，ASI 中劑量組 BNP mRNA 表達明顯降低（P<0.01）。

Table 8 The effects of simulated weightlessness on mRNA expression changes in myocardial tissue of rats and the intervention effect of acanthopanax senticosus injection表8 模擬失重四周對大鼠心肌組織 mRNA 表達變化的影響及刺五加注射液的干預作用

2.5 模擬失重四周大鼠心肌組織 CaN、NFAT3 和 P-NFAT3 的表達變化及刺五加注射液的干預作用

如表9 及圖1 所示，模型組大鼠心肌組織 CaN 表達量較正常組升高；與模型組比較，ASI大劑量組 CaN 表達略有降低，中小劑量組明顯升高；模型組 NFAT 3 表達與空白組比較，明顯升高；與模型組相比，ASI 三個劑量組 NFAT 3 表達量明顯降低；模型組 P-NFAT 3 表達較空白組明顯降低；同時ASI 三個劑量組也存在表達降低的現象。

Fig. 1 Simulated weightlessness on the expression changes of CaN, NFAT3 and P-NFAT3 in myocardial tissue of rats and the intervention effect of acanthopanax senticosus injection圖1 模擬失重對大鼠心肌組織 CaN、NFAT 3 和 P-NFAT 3 的表達變化及刺五加注射液的干預作用

Table 9 Expression changes of CaN, NFAT 3 and P-NFAT 3 in myocardial tissue of rats after simulated weightlessness and the intervention effect of acanthopanax senticosus injection表9 模擬失重四周大鼠心肌組織 CaN、NFAT 3 和 P-NFAT 3 的表達變化及刺五加注射液干預作用

3 討論

航天員在失重環境停留返回地球表面普遍出現心血管功能失調，嚴重影響其立位耐力及運動能力。目前對失重狀態下心血管功能失調發生機制仍不十分清楚。為保證航天員的健康與工作效率，各國都在積極研究對抗措施，對抗心臟功能失調的有效措施除了一些物理措施外，還有下體負壓、體育鍛煉、人工重力、套帶、補充鹽水等，未見有效的對抗藥物出現[11]。

3.1 傳統中藥刺五加的心血管防護作用機理

刺五加作為一種中藥在防治心血管功能失調方面發揮了一定的作用[12]。刺五加提取物能增加心肌血流量，降低冠脈阻力、減慢心率、降低血壓，同時，減少心肌耗氧量及心肌耗氧指數，降低心肌氧利用率，還能減弱病灶區域超微結構的損害，加快亞細胞結構的再生，減緩心肌梗死[13]。對小鼠血栓形成有保護作用[9]，抑制血栓形成[14]，改善紅細胞膜流動性，降低全血粘度，改善血液流變學狀況[15]，具有明顯的負性肌力作用，其作用與維拉帕米類似[16]。對于急性心肌梗塞患者，能改善左室舒張功能[17]，通過保護內源性自由基清除劑超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽（Glutathione, GSH-Px）活性，減輕心肌細胞膜脂質過氧化的損傷，增強心肌細胞的抗自由基損傷能力，保持心肌細胞膜結構的完整性，避免了心肌細胞內 Ca2+超負荷及心肌細胞不可逆性損傷，明顯改善了缺血再灌注損傷心肌的預后，具有鈣通道阻滯作用[18-19]。

3.2 刺五加注射液通過改善心臟長軸/短軸指標抗失重心血管功能紊亂

模擬失重四周大鼠心臟超聲發現，模型組心率較空白組明顯升高（P<0.05），刺五加注射液各個劑量組都不同程度能減慢心率，其中以中劑量組較明顯，但無統計學意義；心臟短軸超聲結果發現，左室前壁舒張末期厚度（LVAW; d）、左室前壁收縮末期厚度（LVAW; s）、左室舒張末期內徑（LVID; d）、左室收縮末期內徑（LVID; s）、左室后壁舒張末期厚度（LVPW; d）和左室后壁收縮末期厚度（LVPW; s）較空白組有減小趨勢，其中刺五加注射液劑量組對 LVAW; d 和LVAW; s 對 LVPW; d 和 LVPW; s 有不同程度的改善作用；心臟長軸超聲結果發現，模型組大鼠左室舒張末期室間隔厚度（IVS; d）、左室收縮末期室間隔厚度（IVS; s）、左室舒張末期內徑（LVID; d）、左室收縮末期內徑（LVID; s）、左室后壁舒張末期厚度（LVPW; d）和左室后壁收縮末期厚度（LVPW; s）較空白組均有不同程度的減小，刺五加注射液的心臟長軸參數在一定程度上有改善作用；模型組大鼠心臟超聲短軸和長軸的左室射血分數（EF）和左室縮短率（FS）均有不同程度的升高，其中刺五加注射液劑量組升高較模型組更明顯，說明刺五加注射液能夠增加模擬失重狀態下大鼠心臟的射血分數和左室縮短率，即具有提高心臟功能的作用。模型組大鼠短軸和長軸的每搏輸出量（SV）較空白組減少，刺五加注射液小劑量組對大鼠心臟長軸的每搏量增加明顯。模型組大鼠短軸和長軸的心排量（C0）較空白組均有降低，刺五加注射液小劑量組對大鼠心臟長軸和短軸的心排量增加明顯（P<0.05）。超聲結果提示，模擬失重四周心血管功能發生了改變，刺五加注射液對模擬失重心血管功能的變化具有不同程度的調整作用。

3.3 刺五加注射液通過調節血清心肌酶水平緩解失重導致的心血管損傷

心肌酶是與心肌損傷相關的一組酶，心肌損傷后，心肌細胞膜通透性增加，使得心肌細胞內的細胞酶釋放入血，根據心肌損傷程度的不同，血清酶升高的幅度也不同。因此，以血清酶的變化可以反映心肌損傷的發生及程度[20]。模擬失重四周后，檢測大鼠血清心肌酶譜，發現 LDH、AST、CK、CKMB、HBMB 均有不同程度的升高。其中，模型組 CK 和CKMB 較空白組明顯升高（P<0.05），提示模擬失重四周后大鼠心肌組織有不同程度的損傷，刺五加劑量組對升高的心肌酶有降低趨勢，說明刺五加注射液對模擬失重造成的心肌損傷具有一定程度的修復作用。

3.4 刺五加注射液通過調節信號通路 Ca2+/CaN/NFAT 3 基因和蛋白表達保護失重下心血管系統

信號通路 Ca2+/CaN/NFAT3 中 CaN 是一種分布廣泛、功能多樣的信號酶，其介導的信號通路在心血管的形態發生中起重要作用，并參與心肌肥大及心肌調亡、血管平滑肌細胞增值和內皮細胞功能的調節，心肌細胞在心肌肥厚因素刺激下，可通過去磷酸化NFAT3 與心肌轉錄因子（GATA4）相互作用，活化多種心肌肥厚相關基因，最終導致心肌重構[21-22]，進而誘導原癌基因c-fos 等表達，繼之胎兒基因β-MHC、ANF、BNP 表達增加，結果使心肌收縮蛋白基因α-actin、MLC-2 等表達上調，蛋白合成增加，細胞體積增大，心肌肥大發生[23]。研究發現，模擬失重四周，模型組大鼠心肌組織 CaN mRNA 表達量較正常組升高，刺五加注射液劑量組對模型組的升高有不同程度的降低趨勢。結果與前期發現的模擬失重 CaN 表達量降低不一致，分析原因可能是，前期分析的是模擬失重二周 CaN 的表達變化是降低的，本課題研究的是模擬失重四周大鼠心肌組織的 CaN 表達，由此可以推斷模擬失重不同時期對 CaN 的影響是不同的，總的來說，模擬失重引起 CaN 表達量改變，有可能是模擬失重心血管失調的發生的分子基礎。

信號通路 Ca2+/CaN/NFAT 3 下游表達基因包括α-MHC、β-MHC、ANF、BNP、α-actin 等，其中 ANF，即心鈉素，也稱心房利鈉因子，是一種心臟內分泌激素，具有強大的利尿、利鈉、舒張血管、降低血壓、抑制腎素—血管緊張素—醛固酮系統及交感神經系統的興奮性的作用[24-25]。BNP 即 B 型利鈉肽，主要在心室合成?？蓴U張血管，降低外周阻力，降低心臟搏出量，減慢心率，降低心輸出量；有利尿作用[26-27]；亦可抑制腎素—血管緊張素—醛固酮系統和交感神經系統，抑制內皮素和垂體加壓素釋放，從而調節水鹽平衡，改善血容量，降低心臟前后負荷，降低血壓[28-29]。α-MHC/β-MHC，即心肌肌球蛋白重鏈α和β，是心肌肌原纖維的主要成分和收縮蛋白，α-MHC 具有高 ATP 酶活性，產生快速收縮，β-MHC 具有低 ATP 酶活性，產生慢速收縮[30]。因此，研究α-MHC、β-MHC 基因表達，從本質上講與研究心肌收縮力的改變一致。α-actin 屬于肌動蛋白的一種，廣泛表達于正常心肌細胞肌漿內[32]，α-actin 在肌動蛋白的三種類型中屬于肌肉型，參與多種真核細胞的機能，如收縮、變形激化和細胞分裂，在心肌肥大、冠心病猝死、心梗、高功率微波輻照心肌、心肌炎等情況下均出現表達減弱；并且，心肌損傷越重，α-actin 的表達越少，可能與心肌損傷、缺血缺氧、炎癥等因素有關[33]。分析實驗結果，發現模擬失重四周，ANF mRNA 表達量較正常組升高，與空白組和模型組比較，刺五加注射液中劑量組 ANF mRNA 表達升高，給藥各組間存在劑量關系；BNP mRNA 表達量較正常組升高，與空白組和模型組比較，刺五加注射液中劑量組 BNP mRNA 表達明顯降低（P<0.01）。模型組心肌組織 Myh6 mRNA 表達量較正常組降低，與空白組和模型組比較，刺五加注射液中劑量組 Myh6 mRNA 表達明顯升高（P<0.01）；Myh7 mRNA 表達量較正常組明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，刺五加注射液中劑量 Myh7 mRNA 表達明顯升高（P<0.01）；模型組α-actin 表達量增高，刺五加注射液高劑量組α-actin 表達具有降低趨勢，可能說明模擬失重四周對大鼠心肌的損傷沒有達到嚴重的程度；同時，也說明刺五加注射液具有改善心功能的作用。這些結果表明信號通路 Ca2+/CaN/NFAT 3 下游表達基因α-MHC、β-MHC、ANF、BNP、α-actin，在模擬失重四周時，均發生了變化，直接影響了心肌收縮功能的改變，導致心血管功能失調，而刺五加注射液對模擬失重引起的心肌功能的改變具有不同程度的調整作用。

總之，通過心臟超聲、心肌酶譜及 Ca2+/CaN/NFAT 3 信號通路分析發現，模擬失重四周大鼠心肌在一定程度上有損傷出現，刺五加注射液對這些損傷具有一定程度上的修復作用，即刺五加注射液可能具有提高心功能的作用。

4 結論

本項目研究中藥單體刺五加注射液對模擬失重大鼠心血管功能失調的防護機制，在前期發現的模擬失重心血管功能失調相關蛋白鈣調神經磷酸酶的基礎上，研究該蛋白相關信號通路Ca2+/CaN/NFAT 3 的變化情況及刺五加注射液的干預作用。發現，刺五加注射液能夠通過增加大鼠心臟收縮和舒張末期左室厚度，提高每搏輸出量和心排量，降低心率達到調節模擬失重大鼠心血管功能失調的作用。而且，刺五加注射液能夠影響鈣調神經磷酸酶的表達，使 Ca2+/CaN/NFAT 3 信號通路發生變化，導致下游表達基因發生改變，最終影響與心肌收縮力直接相關的基因的表達，外在表現為心血管功能的失調，以高劑量作用最為明顯。這一發現將為未來研究載人航天對抗心血管功能失調的措施提供新的防護途徑，對載人航天醫監醫保具有重要的參考價值。因此，揭示航天特殊環境下心血管功能變化本質是尋找解決方案的關鍵，可能為下一步研制藥物確定靶標，或為其他醫監醫保措施研制提供參考。