透明質酸對載藥角膜接觸鏡緩慢釋放的研究

單詩琪，胡海洋，陳大為

（沈陽藥科大學 藥學院，沈陽 遼寧 110016）

糖尿病性白內障是白內障中的一種病癥[1]。常見的治療方法分為藥物治療[2]和手術治療[3]兩種。隨著近年來藥學的發展，藥物治療是在早期治療糖尿病性白內障最為方便、舒適的治療方法[4]。芐達賴氨酸（Bendazac Lysine, BDZL）是意大利Angelini 公司研制的白內障治療藥物[5-6]，商品名為Bendalia。芐達賴氨酸是醛糖還原酶抑制劑，不僅對糖尿病性白內障有效，還對多種類型的早期白內障有預防和治療作用。其不良反應微輕，是目前國內外廣泛應用的一種確實有效的預防和治療白內障的藥物[7]。目前，市場上已用該藥制備成滴眼液[8]。

滴眼液為最常用的眼用藥物制劑[9]。但滴眼液因眼部淚膜屏障導致其藥物停留時間短，生物利用率低，用藥效果不明顯。為改進滴眼液的不足之處，國外研究人員提出以角膜接觸鏡作為眼用藥物載體。治療性角膜接觸鏡，其制造材料包括硬性透氣性材料、軟性非親水性材料和軟性親水性材料等[10]。軟性親水性材料即水凝膠材料[11]。因采用水凝膠材料制成的角膜接觸鏡佩戴適應期短、舒適感強，深受廣大患者歡迎。其治療途徑為[12]：藥物從角膜接觸鏡內釋放，穿過角膜，進入虹膜，經過睫狀肌，最后作用在晶狀體發揮藥效。角膜接觸鏡的加載藥物方式一般情況下分為兩種。第一種是聚合單體—藥物共聚法[13]：將配制好的藥物溶液與聚合單體（水凝膠、交聯劑與光引發劑）均勻聚合，倒入模具中，紫外固化后形成角膜接觸鏡。第二種為吸附法[14]：先制成空白角膜接觸鏡，浸泡在藥物溶液里進行吸附。

本文將采用聚合單體—藥物共聚法和吸附法制備載芐達賴氨酸角膜接觸鏡，研究制備處方、工藝對載芐達賴氨酸角膜接觸鏡的質量影響，并進一步探索透明質酸對載芐達賴氨酸型角膜接觸鏡中藥物釋放的影響。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YS304 紫外/可見分光光度計（遼寧銀生科技有限公司），ALC-110.4 電子分析天平（天津賽力斯自動化科技有限公司），KQ5200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），XW-80 A 旋渦混合器（上海精科實業有限公司），DF-101 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司），PB-10 普及型 pH 計（賽多利斯科學儀器有限公司），透析袋（MWCO=3500，上海綠鳥），DWS-51 鈉離子濃度計（上海儀電分析儀器有限公司），AP-9100A 真空無油真空/壓力泵（天津艾特塞恩斯儀器有限公司）。

1.2 試劑

甲基丙烯酸羥乙酯（C6H10O3，分子質量 130.14，HEMA，ρ = 1.073 g·mL-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），二甲基丙烯酸乙二醇酯（C10H14O4，分子質量 198.22，EGDMA，ρ = 1.051g·mL-1，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），光引發劑（C10H12O，分子質量 164.2，Photointiator1173，ρ=1.077 g·mL-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），芐達賴氨酸（C22H28N4O5，分子質量 428.48，BDZL，上海畢得醫藥科技有限公司），透明質酸（C14H22NNaO11，分子質量93000， HA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），氯化鈉（NaCl，分子質量 58.44，分析純，國藥集團化學試劑有限公司），氯化鉀（KCl，分子質量 74.55，分析純，國藥集團化學試劑有限公司），碳酸氫鈉（NaHCO3，分子質量 84.01，分析純，天津博迪化工股份有限公司），二水氯化鈣（CaCl2·2H2O，分子質量 147.01，分析純，天津博迪化工股份有限公司），磷酸氫二鈉（Na2HPO4，分子質量 141.96，分析純，國藥集團化學試劑有限公司），磷酸二氫鉀（KH2PO4，分子質量 136.086，分析純，國藥集團化學試劑有限公司），鹽酸（HCl，分子質量 36.46，分析純，天津博迪化工股份有限公司），五氧化二磷（P2O5，分子質量 141.94，分析純，國藥集團化學試劑有限公司），氯化鈣（CaCl2，分子質量 110.98，分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法

2.1 水凝膠角膜接觸鏡的制備

分別精密量取一定體積的甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）和光引發劑（Photointiator 1173），置于1 mL 量瓶中，置旋渦混合器上，聚合均勻，加適量水稀釋至刻度，即為聚合單體溶液。將聚合單體溶液置于超聲清洗器，超聲10 min 去除氧氣，精密量取 100 μL 聚合單體溶液注入角膜接觸鏡模具中，置紫外燈 365 nm 處固化，使單體充分反應形成水凝膠角膜接觸鏡。

2.2 水凝膠角膜接觸鏡的質量考察

根據國家《眼科光學·接觸鏡·第3 部分：軟性接觸鏡》相關要求，水凝膠角膜接觸鏡的質量參數為透光率、含水量、離子滲透率[15]。本研究以上述3 個質量參數為指標，評價水凝膠角膜接觸鏡的質量，并以此篩選水凝膠角膜接觸鏡最佳聚合單體配比與紫外固化時間[15]。

2.2.1 透光率的測定

將水凝膠角膜接觸鏡 CL-W 置于人工淚液（67.8 mg 氯化鈉、21.8 mg 碳酸氫鈉、13.8 mg 氯化鉀、0.8 mg 二水氯化鈣置于 1 000 mL 去離子水中溶解，并用 pH 計測其 pH 值為 7.4 ± 0.2）中浸泡 6 h，按照紫外—可見分光光度法測定，在 200～800 nm 的波長處測定透光率。根據國家標準《眼科光學·接觸鏡·第5 部分：光學性能試驗方法》，角膜接觸鏡透光率應不小于 92%[16]，確定水凝膠角膜接觸鏡透光率可達到 92% 以上的最佳波長。將不同聚合單體質量配比的水凝膠角膜接觸鏡 CL-1、CL-2、CL-3 在最佳波長下測定透光率。

2.2.2 含水量的測定

根據 2020 年版《中國藥典》，采用減壓干燥法測定角膜接觸鏡的含水量。

取培養皿，加入五氧化二磷干燥劑適量，使鋪成 0.5～1 cm 的厚度，放入減壓干燥器中。將制備的水凝膠角膜接觸鏡（濕體），置于已在供試品同樣條件下干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定。將加入角膜接觸鏡的稱量瓶放入減壓干燥器中，打開瓶蓋，減壓至 2.67 kpa（20 mmHg）以下持續半小時，溫室放置 24 小時。在減壓干燥器出口連接無水氯化鈣干燥管，打開活塞，待內外壓一致，關閉活塞，打開干燥器，蓋上稱量瓶瓶蓋，取出稱量瓶，迅速精密稱定重量。

含水量公式：

Water Content 為含水量，%；W1為濕體角膜接觸鏡的重量，g；W2為恒重稱量瓶的重量，g；W3為（稱量瓶+干體角膜接觸鏡）的恒重重量，g。

2.2.3 離子滲透率的測定

將制備的水凝膠角膜接觸鏡分別放于模具間的圓孔上，用不銹鋼夾將水凝膠角膜接觸鏡固定，分別放置于測量池中。在測量池中加純凈水 180 mL，在標定池中加 0.1 mol·L-1的 NaCl 溶液180 mL。將測量池置于磁力攪拌器上，并將鈉離子濃度計的電極插入被測液中，電極底部的玻璃球應距測量池底部 20 mm 以上，待讀數穩定后，讀取數據，每隔 20 min 測定一次數據, 連續測定 3 次并取平均值。通過公式計算離子滲透率。

離子滲透率計算公式：

Dion 為離子滲透率，cm2·s-1；L 為膜厚度，cm；S 為膜面積，cm2；C0為 Na+初始濃度，mol·L-1；C為測量池中時間t時的 Na+濃度，mol·mL-1；V 為測量池體積，cm3。

2.3 芐達賴氨酸的體外分析方法的建立

2.3.1 配制芐達賴氨酸溶液

精密稱取 50.03 mg 芐達賴氨酸（BDZL）置于 50 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成 BDZL 貯備液（1 mg·mL-1）。

2.3.2 線性與范圍

根據 2020 年版《中國藥典》，按照紫外—可見分光光度法，芐達賴氨酸在 307 nm 的波長處有最大吸收[18]。

精密量取 BDZL 貯備液 250、375、500、625、750 μL 至 10 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得到濃度分別為 25、37.5、50、62.5、75 μg·mL-1的 BDZL 對照品溶液。以水為空白，在307 nm 波長處測定各對照品溶液的吸光度，以測得的吸光度與其相應濃度計算線性回歸方程，并繪制標準曲線。

2.3.3 溶液穩定性試驗

取濃度為 50 μg·mL-1的 BDZL 對照品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10 h 各時間點，在 307 nm波長處測其吸光度，計算 RSD%，RSD% ≤ 2.0%，判斷其溶液穩定。

2.3.4 精密度試驗

同 2.3.1 配制方法制備芐達賴氨酸貯備液，取 6 組濃度為 50 μg·mL-1芐達賴氨酸對照品溶液，在 307 nm 波長處測其吸光度。計算 RSD%，RSD% ≤ 2.0%，確定精密度符合規定。

2.3.5 聚合單體中含芐達賴氨酸準確度的試驗

分別精密量取 BDZL 貯備液（1 mg·mL-1）400、500、600 μL，置于 10 mL 量瓶中，分別加入6 mL 的聚合單體溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，作為各濃度的回收率溶液（40、50、60 μg·mL-1），每種濃度分別制備 3 組。精密量取 BDZL 貯備液（1 mg·mL-1）1 mL，置于20 mL 量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻，即得到濃度為 50 μg·mL-1的 BDZL 對照品溶液。分別取對照品溶液、回收率溶液在 307 nm 波長處測其吸光度，根據對照品比較法，計算回收率溶液的含量，組內回收率 RSD%≤ 2.0%，組間回收率 RSD% ≤ 2.0%，以確定聚合單體對芐達賴氨酸含量測定是否有干擾。

計算公式：

Cx為供試品溶液的濃度；Ax為供試品溶液的吸光度；CR為對照品溶液的濃度；AR為對照品溶液的吸光度。

2.4 載藥角膜接觸鏡的制備

2.4.1 聚合單體—藥物共聚法制備載藥角膜接觸鏡

精密稱取 50.04 mg 芐達賴氨酸，置于 10 mL 量瓶中，加水適量溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 5 mg·mL-1的芐達賴氨酸貯備液（芐達賴氨酸滴眼液標示量為 5 mg·mL-1）。

精密量取一定體積的 HEMA、EGDMA、Photointiator 1173 置于 1 mL 量瓶中，置旋渦混合器上，均勻聚合，精密量取芐達賴氨酸貯備液（5 mg·mL-1）100 μL 加入含有聚合單體溶液的量瓶中，加水稀釋至刻度，即為含芐達賴氨酸的聚合單體溶液。將聚合單體溶液置于超聲清洗器超聲 10 min 去除氧氣，精密量取 100 μL（含芐達賴氨酸 50 μg）的聚合單體注入角膜接觸鏡模具中，于紫外燈 365 nm 處固化，使單體充分反應，記作 CL-B，形成聚合單體—藥物共聚法載藥角膜接觸鏡。

2.4.2 吸附法制備載藥角膜接觸鏡

按最優配比和工藝制備空白水凝膠角膜接觸鏡。將空白角膜接觸鏡置于芐達賴氨酸溶液（5 mg·mL-1）中浸泡 24 h，使芐達賴氨酸吸附在空白角膜接觸鏡的表面，記為 CL-S，為吸附法制備的載藥角膜接觸鏡。

2.4.3 聚合單體—藥物—透明質酸共聚法制備角膜接觸鏡

配制濃度為 5 mg·mL-1的芐達賴氨酸貯備液和濃度為 1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg·mL-1的透明質酸溶液。

精密量取一定體積的 HEMA、EGDMA、Photointiator 1173 置于 1 mL 量瓶中，置旋渦混合器上，均勻聚合，即為聚合單體溶液。精密量取芐達賴氨酸溶液（含芐達賴氨酸 50 μg）100 μL 和 1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg·mL-1的透明質酸溶液各 50 μL 分別注入含有聚合單體溶液的量瓶中，加水適量至刻度。將各聚合單體溶液置于超聲清洗器超聲 10 min 去除氧氣，各精密量取 100 μL 聚合單體注入角膜接觸鏡模具中，于紫外燈 365 nm 處固化，使單體充分反應，記作 CL-H1、CL-H2、CL-H3、CL-H4、CL-H5、CL-H6。形成聚合單體—藥物—透明質酸共聚法角膜接觸鏡。

2.5 載藥角膜接觸鏡體外釋放

根據 2020 年版《中國藥典》，按照紫外—可見分光光度法，用吸收系數法計算載藥角膜接觸鏡中芐達賴氨酸的釋放含量[17]。

同“2.4.1”“2.4.2”“2.4.3”制備的角膜接觸鏡放入透析袋中，置于 50 mL 燒杯中，在燒杯中加入人工淚液 35 mL，放置在磁力攪拌器上進行磁力攪拌使其藥物釋放。分別于5、6、8、24、48、72、96 h 的時間點取人工淚液 4 mL 置于比色皿中，在 307 nm 波長處測定吸光度。每次測定后再將人工淚液倒回燒杯中。通過公式 1 計算釋放濃度。所得濃度通過公式 2 計算芐達賴氨酸釋放率。

Cx為藥物的濃度，g·mL-1；Content為釋放率，%；Ax為藥物的吸光度；為藥物的吸收系數；100 為濃度換算系數；芐達賴氨酸的為 130[18]；D 為稀釋體積；在共聚法角膜接觸鏡中W為藥物取樣量，g；在吸附法角膜接觸鏡中W為空白角膜接觸鏡的吸附量，g。

3 結果

3.1 水凝膠角膜接觸鏡聚合單體配比與紫外固化時間的篩選

3.1.1 測定透光率最佳波長的確定

將制備的水凝膠角膜接觸鏡 CL-W 置于比色皿中，在 650 nm 波長處測定的透光率大于92%，可選擇在 650 nm 為透光率測定的最佳波長。結果見圖1。

Fig. 1 Transmittance of hydrogel corneal contact lens (n = 3)圖1 水凝膠角膜接觸鏡的透光率（n = 3）

3.1.2 水凝膠角膜接觸鏡含水量、透光率和離子滲透率的測定

CL-1、CL-2、CL-3 的含水量、透光率和離子滲透率結果見表1。

Table 1 Water content, light transmittance and ionic permeability of CL-1, CL-2 and CL-3 (n = 3)表1 CL-1、CL-2、CL-3 的含水量、透光率和離子滲透率（n = 3）

3.1.3 水凝膠角膜接觸鏡聚合單體配比與紫外固化時間的確定

篩選出聚合單體溶液最佳處方配比：HEMA 用量 0.863 g、EGDMA 用量 0.043 g、Photointiator 1173 用量 0.015 g，在紫外燈 365 nm 處固化時間為 6 min，形成肉眼可見透明的角膜接觸鏡。將其在紫外波長 650 nm 處測得透光率為（94.3 ± 0.4）%、含水量為（57.6 ± 0.5）%、離子滲透率為（2.06 × 10-6± 0.06）cm2·s-1。根據國家標準，水凝膠角膜接觸鏡的透光率不小于 92%、含水量在 49%～70% 之間、離子滲透率不小于 9.7 × 10-10cm2·s-1。該制備出的水凝膠角膜接觸鏡的含水量、透光率和離子滲透率均符合國家標準。隨著聚合單體質量比減小，角膜接觸鏡的離子滲透率變大。紫外燈固化時間為 3 min 時，角膜接觸鏡不成膜；紫外燈固化時間為 9 min 時，角膜接觸鏡變硬易碎裂。水凝膠角膜接觸鏡外觀見圖2。

Fig. 2 Appearance of hydrogel corneal contact lens圖2 水凝膠角膜接觸鏡的外觀

3.2 芐達賴氨酸的體外分析方法的建立

3.2.1 線性與范圍

BDZL 溶液在 25～75 μg·mL-1濃度范圍，線性方程：A= 0.0105C+ 0.0384，相關系數R為0.9974，濃度與吸光度線性關系良好。結果見圖3。

Fig. 3 Linear relationship of concentration of benzyl lysine solution圖3 芐達賴氨酸溶液濃度的線性關系

3.2.2 溶液穩定性試驗

BDZL 對照品溶液（50 μg）在室溫（約 25 ℃）條件下放置 10 h，每隔 2 小時進行紫外吸光度測定，RSD% = 1.76%，小于 2.0%，說明 BDZL 對照品溶液在 10 h 內均穩定。

3.2.3 精密度試驗

6 組 BDZL 對照品溶液（50 μg）吸光度 RSD% = 0.91%，小于 2.0%，表明重復性良好。

3.2.4 聚合單體中含芐達賴氨酸準確度的試驗

組內平均回收率分別為 100.7%、101.6%、100.5%，在 80%～115% 之間；組內 RSD 為0.958%、0.248%、0.527%，均小于 2.0%；組間平均回收率為 100.9%，在 80%～115% 之間，組間 RSD為 0.58%，小于 2.0%，表明聚合單體對芐達賴氨酸含量測定無干擾。結果見表2。

Table 2 Accuracy test of bendazac lysine表2 芐達賴氨酸的準確度試驗

3.3 體外釋藥的測定

3.3.1 聚合單體—藥物共聚法與吸附法載藥角膜接觸鏡體外釋放率的比較

聚合單體—藥物共聚法角膜接觸鏡（CL-B）釋藥時間累計 96 h，釋藥率為（91.59 ±3）%；吸附法載藥角膜接觸鏡（CL-S）釋藥時間累計 48 h，釋藥率為（99.80 ± 0.2）%。聚合單體—藥物共聚法角膜接觸鏡釋放可達到 96 h 持續釋放，而吸附法載藥角膜接觸鏡只能在短短 48 h 內釋放結束，所以采用聚合單體—藥物共聚法制備角膜接觸鏡，可以使藥物持續釋放。結果見圖4。

Fig 4 Release content curves of CL-B and CL-S (n=3)圖4 CL-B、CL-S 釋藥率曲線（n=3）

3.3.2 聚合單體—藥物—透明質酸共聚法角膜接觸鏡的體外釋藥

聚合單體—藥物共聚法角膜接觸鏡 96 h 累計釋藥率為（91.59 ± 3）%。

聚合單體—藥物—透明質酸共聚法角膜接觸鏡，當 HA 濃度為 1 mg·mL-1時，96 h 累積釋藥率（68.89 ± 5）%；當 HA 濃度為 2.5 mg·mL-1時，96 h 累積釋藥率小于 50%。通過試驗確定聚合單體—藥物—透明質酸共聚法角膜接觸鏡具有緩慢釋藥的效果。結果見圖5。

Fig. 5 Cumulative release curves of CL-B, CL-H1, CL-H2, CL-H3, CL-H4, CL-H5 and CL-H6 (n = 3)圖5 CL-B、CL-H1、CL-H2、CL-H3、CL-H4、CL-H5、CL-H6 的累積釋藥曲線（n = 3）

3.3.3 聚合單體—藥物—透明質酸角膜接觸鏡的外觀

聚合單體—藥物—透明質酸角膜接觸鏡，CL-H 組數據表明 HA 濃度增加，含水量增加、透光率和離子滲透率降低；在 HA 濃度為 2 mg·mL-1時，透光率小于 92%。

聚合單體—藥物—透明質酸角膜接觸鏡最佳處方和工藝為：精密量取 0.863 g HEMA、0.043 g EGDMA、0.015 g Photointiator 1173，置于 1 mL 量瓶中，置旋渦混合器上，均勻聚合，即為聚合單體溶液。精密量取芐達賴氨酸溶液（含芐達賴氨酸 50 μg）100 μL 和 1 mg·mL-1的透明質酸溶液 50 μL，分別注入含有聚合單體溶液的量瓶中，加水適量至刻度。將聚合單體溶液置于超聲清洗器超聲 10 min 去除氧氣；各精密量取 100 μL 聚合單體注入角膜接觸鏡模具中，于紫外燈365 nm 處固化 6 min，使單體充分反應，形成聚合單體—藥物—透明質酸共聚法角膜接觸鏡。

聚合單體—藥物—透明質酸角膜接觸鏡的其透光率、含水量和離子滲透率見表3，外觀見圖6。

Table 3 Water content, light transmittance and ion permeability of polymeric monomer drug hyaluronic acid corneal contact lens (n=3)表3 聚合單體—藥物—透明質酸角膜接觸鏡的含水量、透光率和離子滲透率（n=3）

Fig. 6 Appearance of corneal contact lens圖6 角膜接觸鏡的外觀

4 討論

4.1 角膜接觸鏡的透光率、含水量與離子滲透率

水凝膠角膜接觸鏡，通過制備方式、藥物配比篩選確定 HEMA∶EGDMA∶Photointiator 1173的質量比 58 : 3 : 1，透光率、含水量與離子滲透率均符合國家標準。HA 濃度增大使角膜接觸鏡的含水量增大，透光率降低，說明 HA 影響角膜接觸鏡的透光率。HEMA 與EGDMA 的增多，會使角膜接觸鏡離子滲透率下降。

4.2 聚合單體—藥物—透明質酸共聚法制備的角膜接觸鏡

HA 濃度為 1 mg·mL-1時，聚合單體—藥物—透明質酸共聚法制備的角膜接觸鏡在累計 96 h釋藥率為 70%。相比于聚合單體—藥物共聚法制備的角膜接觸鏡，透明質酸具有緩慢釋藥的作用。緩慢釋放的效果能更好地提高藥物的生物利用度，使藥物在有效的時間內充分作用于病灶，藥物能起到更好的治療效果。藥物選用芐達賴氨酸，對多種類型的早期白內障有預防和治療作用。在治療眼部疾病中，加入透明質酸不僅能起到補水、緩解眼部不適癥狀的作用，還可以減輕并調節眼部炎癥問題。其在治療白內障的藥物劑型中能發揮更好的效果。

5 結論

以甲基丙烯羥乙酯為結構骨架，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑，Photointiator 1173 為光引發劑，充分混勻為聚合單體制備出軟性親水性水凝膠角膜接觸鏡。

通過共聚法和吸附法兩種制備方法制備載藥角膜接觸鏡，經釋藥率測定確定聚合單體—藥物共聚法角膜接觸鏡釋藥時間比吸附法角膜接觸鏡釋藥時間長。

對聚合單體—藥物—透明質酸共聚法制備的角膜接觸鏡與聚合單體—藥物共聚法制備的角膜接觸鏡進行了體外釋藥率和釋藥速率的測定，表明含有透明質酸的角膜接觸鏡對芐達賴氨酸有緩慢釋放的作用?？梢詫υ摻悄そ佑|鏡治療糖尿病性白內障做進一步研究。