青磚茶特色中藥茶飲的減肥作用研究

解曉敏，馬夢君，韋華琴，武 陽，晏 彪，湯 民，楊 旭，馬 萍*

1. 湖北科技學院 藥學院，湖北 咸寧 437100；2. 湖北省智慧康養產業技術研究院，湖北 咸寧 437100；3. 咸寧市農業科學院，湖北 咸寧 437100；4. 湖北科技學院 基礎醫學院/咸寧市健康環境工程技術研究中心，湖北 咸寧 437100

近年來，肥胖癥的發病率大幅度增加，然而更重要的是肥胖癥患者合并的多種其他疾病如糖尿病、高血壓、心血管疾病及心理健康等危險程度已超過肥胖本身，且亞洲人患糖尿病和高血壓的絕對風險都高于其他人群[1,2]。當患有慢性疾病如糖尿病和心血管疾病時，與僅僅患有肥胖癥相比，殘疾率和死亡率都會顯著提高。因此，肥胖癥及其相關的代謝性疾病已成為影響人類生活質量的主要因素。

氧化應激是由體內氧化與抗氧化作用之間不平衡引起的，最近越來越多的研究集中在中藥對抗氧化應激的作用上[3]。據報道，決明子的各種提取物具有很強的抗氧化潛力。一種從決明子中分離出來的蒽醌衍生物Obtusin 具有顯著的抗氧化活性[4]。有研究報道，決明子在小鼠巨噬細胞中表現出抗炎和抗氧化作用[5]。有研究確定荷葉潛在的黃酮類生物活性成分并通過細胞和動物實驗評價其抗氧化和抗炎作用，為荷葉的食用和藥用價值提供參考[6]。茯苓是一種重要的真菌，具有很高的藥用和營養價值[7]。有報道，茯苓激活肝FXR，可激活PPARa，抑制SREBP-1c，減少脂質沉積[8]。絞股藍，也被稱為“絞股蘭”，是亞洲國家的傳統藥物和涼茶[9]。決明子、荷葉、茯苓和絞股藍都具有一定的調節脂質代謝與降血脂的作用，并且決明子、荷葉及茯苓等都具有抗炎作用。

茶作為天然飲料，具有多種藥理與保健功效[10,11]。青磚茶的減肥效果已被證明[12]。青磚茶中茶多酚、茶多糖含量較多，是青磚茶發揮藥理功效的主要化學物質組分。有許多研究證明，茶多酚和茶多糖具有抗氧化及抗炎作用[13]。有研究表明，貯存年限會影響黑茶的品質，黑茶越陳越好[14]。本試驗通過將十年青磚陳茶與一年新茶作對照，研究儲存年限對青磚茶品質的影響。同時將青磚茶與決明子、荷葉、絞股藍和茯苓按3 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2（質量比）比例混勻制成青磚茶特色中藥減肥茶飲，探究青磚茶中藥特色茶飲緩解氧化應激和炎癥效果，為中藥茶飲的開發利用提供思路與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試劑

1.1.1 試驗動物

5 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠48 只，批號SCXK（遼）20200001，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，飼養于湖北科技學院基礎醫學院動物房。小鼠購入后先適應性飼養1 周，試驗期間小鼠均在室溫（24 ± 2）℃、相對濕度（50 ± 5）%、光/暗周期12 h/12 h 的環境下喂養，并按試驗動物使用的3 R原則給予人道關懷。

1.1.2 藥品與試劑

2012 年青磚茶（執行標準GB/T 9833.9—2002）、2022 年青磚茶（執行標準GB/T 9833.9—2002）、茯苓（執行標準《中國藥典》2020 年版第一部）、決明子（執行標準《中國藥典》2020 年版）、荷葉（執行標準《中國藥典》2020 年版）、絞股藍（執行標準《中國藥典》2020 年版）及高脂飼料[許可證號SCXK（京）2008—0006，小黍有泰（北京）生物科技有限公司]。硫代巴比妥酸（批號20160226）、三氯乙酸（批號20180112）、氫氧化鈉（批號C14465746）等，均購自國藥集團化學試劑有限公司；LDL 試劑盒（批號202203）、HDL試劑盒（批號202203）、TG 試劑盒（批號202203）、TC 試劑盒（批號202203）、8-OHdG 試劑盒（批號202203）、IL-6 試劑盒（批號202203）、IL-1β 試劑盒（批號202203），均購自上海酶聯生物科技有限公司；活性氧ROS檢測試劑盒（批號22192211），北京普利萊基因技術有限公司。

1.1.3 儀器設備

電子天平（奧豪斯，常州）；5424R 低溫冷凍離心機（Eppendorf，德國）；Power wave XS 酶標儀、ELx800 熒光酶標儀（美國Bio-Tek儀器有限公司）；HH-42 三用電熱恒溫水箱（北京長源實驗儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠分組及處理

適應性喂養1 周后，將48 只5 周齡C57BL/6J雄性小鼠隨機分為4 組：空白對照組（Control）、肥胖模型組（Obesity）、新茶減肥組（New Tea，NT）和陳茶減肥組（Old Tea，OT），每組12 只。前5 周單純造模，給予空白對照組普通飼料喂養，其他組均給予高脂飼料喂養，期間每周測量身長和體重。從第6 周開始，NT 組給予灌胃2022 年青磚茶特色中藥茶飲（新茶），OT 組給予灌胃2012 年青磚茶特色中藥茶飲（十年陳茶）。Control 組和Obesity 組給予灌胃生理鹽水為對照，期間每天監測小鼠體重，每周監測小鼠體長。第17 周結束給藥，肥胖模型組體重達正常對照組體重的120%，小鼠肥胖模型建立成功（圖1）。

圖1 實驗流程圖Figure 1 Experimental flow chart

1.2.2 青磚茶特色中藥茶飲的配制

分別將2022 年青磚茶、2012 年青磚茶、決明子、荷葉、絞股藍和茯苓用研磨打粉機磨成粉末，按照青磚茶、決明子、荷葉、絞股藍、茯苓的質量比3 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2 混勻制作成青磚茶特色中藥茶飲配方粉末。根據人體每天能夠承受的適宜飲茶量，依據《動物與人體的每千克體重劑量折算系數表》（表1）轉換成小鼠每天最大飲茶量。具體方法為已知A 種動物每千克體重用藥量，預估算B 種動物每千克體重用藥劑量時可先通過表1 找出折算系數（W），再按下式計算：B種動物的劑量（mg/kg）=W×A 種動物的劑量（mg/kg）。已知人體可承受的青磚茶飲用量為17 g/d，需折算為小鼠量。查A 種動物為成人，B 種動物為小鼠，交叉點為折算系數W= 9.01，故小鼠每日灌胃青磚茶量應為2.56 mg/g。

表1 動物與人體體重劑量折算系數（W）表Table 1 Conversion coefficients (W) of dose per kilogram of body weight for animals and humans

1.2.3 肥胖生化指標測定

造模成功后，將小鼠放入代謝籠中，12 h后將收集的尿液1500 r/min 離心10 min，取上清液分裝放置于-80℃冰箱。留取尿液后用10%水合氯醛麻醉小鼠，剪去小鼠頸部下方皮膚，露出小鼠胸骨柄及肋間，于左側第二肋間與第三肋間且靠近胸骨柄處用1 mL 注射器緩慢抽取心臟血液0.8 ～ 1.0 mL，再緩慢放入1.5 mL 的EP 管中，室溫下靜置30 min 后，25℃、3 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液于新的EP管中放入-80℃冰箱，備用。

小鼠心臟取血結束后，取完整的肝組織，用PBS（pH 7.5）洗凈，濾紙上吸干水分，稱重，冰浴條件下根據肝組織凈重：PBS = 1 ∶9的體積比制成10%的肝組織勻漿。隨后在4℃、10 000 r/min 的條件下離心15 min，取上清液分裝放置于-80℃冰箱。使用ELISA 試劑盒檢測TG、TC、LDL 及HDL。操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.4 8-OH-dG 的測定

使用ELISA 試劑盒檢測8-OH-dG。操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.5 炎癥因子的測定

使用ELISA 試劑盒檢測IL-6 和IL-1β。操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.6 ROS 的測定

使用DCFH-DA（2,7-dichlorofluorescin diacetate）探針方法。用PBS : 肝勻漿上清 =9 ∶1 的體積比稀釋肝勻漿上清，并將熒光染料DCFA-DA 按1 ∶1 000 000 稀釋。之后再1 ∶1 加入稀釋勻漿液和稀釋后的DCFA-DA 熒光染料于酶標板中，輕微搖勻，室溫下避光靜置5 min，置于酶標儀中檢測吸光度。

1.2.7 MDA 的測定

取50 μL 肝勻漿上清及200 μL 0.6%TBA 至1.5 mL的EP管中，沸水浴煮15 min，冷水中降溫，10 000 r/min、4℃條件下離心5 min，取上清液100 μL 至酶標板上，用全波長酶標儀分別測量450 nm、532 nm 及600 nm 波長下的吸光度。MDA濃度（mol·L-1）= 6.45（A532-A600）-0.56×A450。

1.2.8 HE 及油紅O 染色肝臟組織病理學觀測

將小鼠肝臟組織分離，切大小合適的塊狀組織，用4%多聚甲醛緩沖液固定48 h，制作病理切片，進行蘇木精-伊紅（HE）和油紅O 染色，光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學變化情況。

1.3 數據統計分析

所有數據均以平均值 ± 標準誤差（SEM）表示。日期分析和圖表生成使用GraphPad Prism 9.0 軟件（Origin Lab，Berkeley，CA，USA）進行。方差比較后進行Tukey-Kramer 檢驗。p＜ 0.05被認為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 小鼠體重及身長

表2 和圖2 分別顯示各組小鼠最后一天體重及Lee’s 指數情況。與空白對照組相比，肥胖造模組的體重及Lee’s 指數明顯升高；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組的體重及Lee’s 指數均明顯下降。

表2 青磚茶特色中藥茶飲對肥胖小鼠體重的影響Table 2 Effect of Qing brick tea special Chinese herbal tea on the body weight of obese mice

圖2 不同處理組小鼠最后一天Lee’s 指數Figure 2 Lee’s index on the last day of mice in different treatment groups

2.2 小鼠血清中TC、TG 含量及勻漿中TC、TG、HDL、LDL 含量

圖3A 顯示各處理組小鼠血清中肥胖指標TC、TG 含量的測定結果。與空白對照組相比，肥胖造模組TC 和TG 含量明顯升高；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組的TC 和TG 含量均明顯下降，且OT 組下降更為顯著；與NT 組比較，OT 組血清中TG 含量下降且有顯著性差異。

圖3 小鼠TC、TG、HDL、LDL 含量Figure 3 TC, TG, HDL, LDL content in mice

圖3B 顯示各處理組勻漿中肥胖指標TC、TG、HDL 及LDL 含量的測定結果。與空白對照組相比，肥胖造模組TC、TG 及LDL 含量明顯升高；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組的TC、TG 及LDL 含量均明顯下降，且OT 組TC、TG 含量下降更為顯著；與NT 組比較，OT 組勻漿中TC 含量下降且有顯著性差異。

圖3C 為各處理組小鼠肥胖指標TC、TG、HDL 及LDL 的氣泡圖，圓圈大小及顏色深淺代表指標含量的多少。與空白對照組相比，肥胖造模組TC、TG 及LDL 的圓圈更大且顏色更深；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組TC、TG 及LDL 的圓圈更小且顏色更淺，且OT 組比NT 組更為顯著。

2.3 小鼠肝組織HE 染色及油紅O 染色

與空白對照組比較，Obesity 組、NT 及OT組小鼠肝細胞內存在大量脂質空泡、氣球樣變性（圖4A，HE 染色），且Obesity 組最為明顯，NT 組次之。

圖4 小鼠肝組織病理切片Figure 4 Histopathological section of mouse liver

與空白對照組比較，Obesity 組、NT 及OT組小鼠肝細胞內脂滴增多（圖4B，油紅O 染色）。NT 和OT 治療后，油紅染色均顯示肝細胞內脂滴顯著減少且OT 組更為明顯。

2.4 氧化應激指標

與空白對照組相比，肥胖造模組ROS 和MDA 含量升高，具有顯著性差異；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組ROS、MDA 及8-OH-dG含量均明顯下降，且OT 組ROS 和MDA 含量下降更為顯著（圖5）。

圖5 氧化應激指標的測定結果Figure 5 Measurement results of oxidative stress indicators

2.5 炎癥因子變化

如圖6 所示。與空白對照組相比，肥胖造模組IL-6 及IL-1β 均升高，且具顯著性差異；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組IL-6 含量明顯下降，且OT 組ROS 和MDA 含量下降更為顯著。

圖6 炎癥因子測定結果Figure 6 Measurement results of inflammatory factors

3 討論

本研究所建立的肥胖癥模型是指體內儲存的脂肪超過理想體重的20%以上[15]，是一種由遺傳因素、環境因素等多種原因相互作用引起的慢性代謝性疾病，其發生機制是因為能量攝入超過能量消耗導致體內脂肪過度蓄積和體重超常。有研究表明，晝夜節律改變和腸道微生物對肥胖及其復雜的相關性代謝性疾病有關[14]。在控制肥胖和肥胖相關的代謝疾病漸漸成為一種全球流行病的趨勢下，我們主要從飲食方面入手探討青磚茶特色中藥茶飲的減肥效果及機制。

小鼠日常標準食物的脂肪含量一般在17%左右[16]。為了建立肥胖模型，本試驗使用的高脂食物脂肪含量達60%，幾乎是正常的三倍多。對野生型小鼠來說，長期食用高脂食物會使體重快速增加，導致脂肪肝。目前，肥胖癥的表觀檢測指標主要是體重和體長，處理組超過對照組20%視為肥胖，體長以Lee’s 指數判斷。Lee’s[17]越大，則肥胖程度越高。本試驗結果表明，Obesity 組的體重均超過了空白對照組平均體重的20%，即造模成功。與Obesity 組相比，NT 組和OT 組的體重及Lee’s 指數明顯下降，即均具有一定的減肥效果。

進一步的試驗結果表明，HE 染色后肝組織的細胞核和細胞質分別被染色為藍色和紅色。與空白對照組相比，Obesity 模型組的肝臟出現脂肪變性、肝細胞腫大和細胞質中大量脂肪滴空泡。顯然，NT 和OT 干預小鼠的肝臟腫大在一定程度上減輕了，細胞質中的脂肪滴液泡減少了。與空白對照組比較，油紅O 染色后Obesity 組小鼠肝細胞內脂滴增多，同時NT 組和OT 組相對不明顯，表明NT 和OT 顯著減輕了高脂飼料誘導的肝組織形態學變化且OT 組更明顯。以上病理切片表明，NT 和OT 組的中藥配方可減輕肥胖癥，且十年陳茶的效果更好。

有文獻報道，在基線時肥胖與甘油三酯、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇呈正相關，與低密度脂蛋白呈負相關[18]。研究表明，多項肥胖指標顯示出正相關的HDL-C 濃度，有文獻則表明當脂肪攝入量增加時HDL-C 濃度會相應下降，從而增加患者患上心臟病的危險性[19]。本試驗結果顯示，Obesity 組小鼠甘油三酯、總膽固醇及低密度脂蛋白顯著升高，NT 和OT 組相對Obesity 組發生明顯的下降。

從中醫的角度來看，中醫身體成分在人體成分分類中起著核心作用[20]。根據中醫理論，肥胖屬于“濁證”范疇，主要是脾臟“升降失調”所致[21]。磚茶中的茶多酚促進脂肪分解和減肥的生物活性受到了較廣泛的關注[22]。決明子、荷葉、茯苓和絞股藍等其具有的健脾、益氣、利濕作用，對于減肥有很大功效[23-26]。

在肥胖癥中，脂肪量與人類和動物的全身氧化應激有關[27]。在哺乳動物中，肥胖和肥胖相關并發癥會影響線粒體代謝，從而有利于ROS 的產生和氧化應激的發展[28]。8-羥基脫氧鳥苷（8-OH-dG）是一種氧化性DNA 損傷副產物，也是氧化應激普遍存在的標志物[29]。丙二醛（MDA）是脂質過氧化過程的終產物之一，也是最常見的氧化應激生物標志物之一[30]。肥胖會增加氧化應激引起的脂質過氧化水平[31]。本研究探討了小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲降脂是否會伴隨著氧化應激的緩解，結果表明僅進行高脂飼料喂養的小鼠ROS、MDA 及8-OHdG 含量均明顯增強。與Obesity 組相比，NT 組和OT 組的ROS、MDA 及8-OH-dG 含量顯著降低，表明小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲降脂過程中伴隨著氧化應激的緩解。有研究表明，炎癥是肥胖中氧化應激升高的一種表現[32]，同時，也是另一個重要來源[33]。本試驗同時探討了小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲在降脂過程中是否伴隨著炎癥因子的產生。試驗結果表明，與空白對照組比，Obesity 組、NT 組和OT 組的IL-6 含量顯著升高，且NT 組和OT 組相對于Obesity 組含量有明顯下降趨勢。說明小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲可以抑制氧化應激因子的產生，促進炎癥因子的釋放，達到減肥的效果，且陳茶比新茶更加明顯。

綜上，青磚茶特色中藥配方可通過促進炎癥因子的釋放，抑制氧化應激因子的產生，達到減肥的效果，且陳茶比新茶更加明顯。