微塑料對近江牡蠣免疫力的影響

牟紅莉, 王瑞旋, 王 俊, 林小植, 王江勇

微塑料對近江牡蠣免疫力的影響

牟紅莉1, 4, 王瑞旋2, 王 俊3, 林小植2, 王江勇5

(1. 上海海洋大學 海洋科學學院, 上海 201306; 2. 韓山師范學院, 廣東 潮州 521041; 3. 華南農業大學, 廣東 廣州 510642; 4. 中國水產科學研究院南海水產研究所/農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室, 廣東 廣州 510300; 5. 惠州學院, 廣東 惠州 516007)

為探究微塑料對牡蠣免疫力的影響, 該研究對近江牡蠣(平均殼長: 6.6 cm)采用殼內推注的方式注入不同濃度的聚苯乙烯微塑料(0.05、0.5、5 mg·L–1, 以無菌生理鹽水為稀釋液), 分別脅迫24 h、48 h和72 h后, 檢測分析牡蠣鰓組織的免疫指標(堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮合成酶(NOS)和乙酰膽堿酯酶(AChE))的變化。結果顯示, 在脅迫24 h后, 微塑料濃度對AKP的活力有顯著影響(<0.05)。SOD、AKP和結構型一氧化氮合成酶的活性呈現明顯的先升后降的趨勢。在脅迫48 h后, 微塑料濃度上升導致A-chE活力顯著下降(<0.05), CAT、SOD和AKP呈現先升后降的趨勢。在脅迫72 h后, 微塑料濃度的升高, AKP和AChE的活力呈現先降后升的趨勢, 而SOD、CAT和誘導型一氧化氮合成酶的活力與之呈現相反的趨勢, 顯示先升后降的趨勢。隨時間和濃度的增長, MDA處于一直上升的趨勢。以上結果表明, 微塑料可使牡蠣產生免疫應激反應, 且脅迫時間越長, 牡蠣免疫應激反應越劇烈。

近江牡蠣; 微塑料; 酶活力; 免疫指標

微塑料通常指上限為5 mm的塑料纖維、顆?；虮∧さ萚1-2]。據估計, 微塑料正以每年4.8×106～12.7× 106t的速度增長[3]。統計顯示, 2014年全球海洋環境中微塑料總量大概在7×103～35×103t之間[4], 塑料垃圾達到海洋垃圾總量的80%～85%[5]。海洋環境中的微塑料主要來自陸源塑料垃圾的輸入及海上塑料垃圾的分解[6]。陸源塑料垃圾進入海洋環境后在物理(風、環流等)、化學(光氧化、自然老化)和生物等共同作用下, 裂解成更多更小的塑料碎片, 由于塑料材質輕盈, 可以隨水流擴散到世界各地[7]。因此, 在世界各地的海岸灘涂, 表層海水及海底沉積物和海洋生物中均能發現微塑料的存在[8-9]。自然界中微塑料往往與環境污染物共存, 一方面由于微塑料具有高比表面積, 能吸附環境中的重金屬抗生素等有毒有害物質, 進一步導致生物產生氧化應激反應和能量代謝紊亂[10-11]。另一方面, 微塑料在老化過程中能釋放出其加工過程中添加的塑化劑、阻燃劑、顏料等化學物質, 海洋生物在攝入微塑料后可能直接暴露于浸出的添加劑。這種添加劑和單體可能會導致生物體內分泌紊亂, 影響生物體繁殖發育[12-14]。已有研究表明, 一次性聚乙烯塑料袋中的瀝出液可以顯著影響文蛤()的仔體發育[15]。

由于微塑料尺寸較小, 加上海洋貝類的特殊生活習性, 致使大多數海洋貝類可通過海水濾食作用直接或者間接攝入微塑料, 從而導致微塑料進入貝類消化組織[16], 而且微塑料還會通過貝類機體細胞的吞噬作用轉移到貝體內血淋巴、肌肉等組織器官中[17]。有報道顯示, 中國沿海25個沿海城市的貽貝和17個城市的養殖牡蠣體內均發現微塑料, 其中50%以上以纖維形狀存在[18-19]。在世界范圍內, 出售的養殖貝類體內均發現微塑料[20-21]。研究發現微塑料會堵塞貝類腸道(即肝胰臟), 影響貝類的生殖、免疫和神經等系統[22-23], 貝類體內的微塑料還可以發生營養級的傳遞, 可通過食物鏈的傳遞直接或間接進入人體, 從而對人類的健康造成嚴重的威脅[24]。

近江牡蠣()是中國重要經濟貝類之一, 分布廣泛, 主要生長于中國河口水域。近江牡蠣通常是固著生長, 不能自主移動, 常年通過濾食水體中的有機或無機碎屑生存, 對外界環境的變化較為敏感, 其健康水平與水體環境息息相關[25-26]。因此本研究為探究微塑料對牡蠣免疫力的影響, 選用近江牡蠣作為分析對象, 以不同濃度的聚苯乙烯微塑料進行脅迫, 檢測分析鰓組織中的免疫指標(堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮合成酶(NOS)和乙酰膽堿酯酶(AChE))的變化, 為微塑料對濾食性生物的潛在風險評估提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

受試生物: 健康的近江牡蠣(殼長: 6.6 cm), 采自廣東省惠州市惠東縣鐵涌鎮(鹽度: 15～35, pH: 7.76～7.82, 水溫: 25.8 ℃)。

養殖條件: 將牡蠣置于玻璃缸中暫養7 d, 以適應實驗室條件。暫養期間的養殖用水鹽度為20, 連續曝氣1 d后使用, 水溫控制在(24±1) ℃左右, 暫養期間在每只牡蠣側邊開一小孔以便后期推注微塑料溶液。

實驗所用微塑料(聚苯乙烯, PS)購于上海麥克林生化科技有限公司, 粒徑為4mm, 顏色為紅色, 形狀為球狀。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計

實驗設置3個聚苯乙烯成分的微塑料濃度梯度: 0.05、0.5、5 mg·L–1(以無菌生理鹽水為稀釋液), 每個濃度設置3個平行。因牡蠣殼厚且附著物較多會影響微塑料的作用效果及濃度的準確計算, 同時利用牡蠣陰干情況下數天不死亡的特性, 因此采用向殼內推注微塑料液體的方式。通過牡蠣側邊的小孔, 用5 mL一次性注射針管推注聚苯乙烯懸液到近江牡蠣體腔, 推注時勿傷及肌肉組織。實驗共有120只健康牡蠣, 聚苯乙烯微塑料的推注劑量為1 mL/只。每個實驗容器(容積為120 L的玻璃缸內)中放入10只牡蠣干露, 室溫為(25±1) ℃, 同步設對照組(3個平行), 推注無菌生理鹽水。分別在注射24 h、48 h和72 h后, 在每個缸內隨機取樣3只測定其酶活力。每隔12 h清理缸內排泄物和死亡牡蠣。

1.2.2 樣品采集

脅迫實驗結束后, 將牡蠣解剖, 取鰓組織, 用預冷的PBS緩沖液清洗后移至凍存管中, 液氮速凍后轉移到–80 ℃冰箱保存, 用于相關酶活力的檢測。

1.2.3 酶活力測定

準確稱取鰓組織重量, 按重量(g): 體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質(生理鹽水), 制成10%的勻漿, 3 500 r·min–1離心10 min取上清。采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別檢測近江牡蠣的總蛋白和AKP、MDA、SOD、CAT、NOS和AChE活力, 實驗操作均按照試劑盒說明書進行。

1.3 數據處理與分析

用SPSS 22.0對數據進行統計分析。數據以平均值±標準偏差(±SD)表示。微塑料濃度對牡蠣各指標的影響采用單因素方差(One-way ANOVA)和LSD多重比較進行統計學分析, 以0.05作為差異顯著的標志, 以0.01作為差異極顯著的標志。

2 結果

2.1 微塑料對近江牡蠣堿性磷酸酶(AKP)活力的影響

不同濃度的微塑料對近江牡蠣鰓組織的AKP活力有影響(圖1)。微塑料脅迫24 h和48 h后, 微塑料濃度升高使AKP活力呈先增加后降低的趨勢, 但仍高于對照組。當微塑料濃度增加到0.5 mg·L–1, 其AKP活力與對照組有顯著差異(<0.05)。脅迫72 h的趨勢與脅迫24 h和48 h相反, AKP活力呈先降低后增加的趨勢, 但仍顯著低于對照組(0.05)。從整體來看, AKP的活力隨時間變化呈現先增加后降低的趨勢, 對AKP活力的影響顯著(<0.05)。

2.2 微塑料對近江牡蠣超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

微塑料濃度對牡蠣鰓組織的SOD活力影響不顯著(>0.05, 圖2)。隨著微塑料濃度的升高, SOD活力呈先增加后降低的趨勢, 尤其是微塑料濃度達到5 mg·L–1時, SOD活力顯著降低(<0.05)。從脅迫時間長短來看, SOD的活力隨時間變化呈現先增加后降低的趨勢, 對SOD活力的影響顯著(0.05)。

圖1 微塑料對近江牡蠣堿性磷酸酶(AKP)活力的影響

注: 字母(a、b)表示不同微塑料濃度對酶活力(x±SD)存在的顯著性差異, 字母(A、B)表示不同時間對酶活力(x±SD)存在的顯著性差異。

圖2 微塑料對近江牡蠣中總超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

2.3 微塑料對近江牡蠣過氧化氫酶(CAT)活力的影響

微塑料濃度對牡蠣鰓組織的CAT活力影響不顯著(>0.05, 圖3)。微塑料脅迫24 h后, CAT活力無明顯變化; 脅迫48 h后, CAT活力呈現先增加后降低的趨勢, 微塑料質量濃度達到0.5 mg·L–1, CAT變化達到顯著(<0.05)。脅迫時間長短來看, CAT的活力隨時間變化呈現先增加后降低的趨勢。

2.4 微塑料對近江牡蠣丙二醛(MDA)的影響

微塑料濃度對牡蠣鰓組織的MDA濃度影響不顯著(>0.05, 圖4)。隨著微塑料濃度的升高, MDA濃度呈現遞增趨勢。當微塑料質量濃度達到5 mg·L–1時, 與對照組之間存在顯著差異(<0.05), 同時MDA達到最大值13.26 nmol·mL–1。微塑料脅迫時間的長短對牡蠣體內MDA濃度變化影響不顯著(>0.05), 隨脅迫時間的延長, MDA濃度上升。

圖3 微塑料對近江牡蠣過氧化氫酶(CAT)活力的影響

圖4 微塑料對近江牡蠣丙二醛(MDA)濃度的影響

2.5 微塑料對近江牡蠣乙酰膽堿酯酶(AChE)活力的影響

微塑料濃度對牡蠣鰓組織的AChE活力影響不顯著(>0.05, 圖5)。當微塑料脅迫牡蠣24 h后, 微塑料濃度的升高, AChE活力呈現先降低后增加的趨勢, 但仍小于對照組, 對照組的AChE活力最高為0.48U·mg–1。微塑料作用于牡蠣48 h后, 微塑料濃度上升導致AChE活力顯著下降(<0.05)。隨暴露時間的延長, A-chE的活力持續降低。

圖5 微塑料對近江牡蠣乙酰膽堿酯酶(AChE)活力的影響

2.6 微塑料對近江牡蠣一氧化氮合成酶(NOS)活力的影響

微塑料濃度對牡蠣鰓組織NOS的影響見圖6。本次實驗主要檢測誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和結構型一氧化氮合成酶(structural nitric oxide synthase, cNOS)。在微塑料作用牡蠣24 h之后, 隨著微塑料濃度的升高, iNOS活力無顯著變化(>0.05), cNOS活力均大于對照組。在微塑料作用牡蠣72 h后, 微塑料濃度升高, iNOS活力無顯著變化(>0.05), cNOS活力在微塑料濃度為5 mg·L–1有顯著變化(<0.05)。微塑料脅迫時間的長短對iNOS活力有顯著影響(0.05), 對cNOS活力無顯著影響(>0.05)。這兩種不同分型的NOS活力均符合一個趨勢, 即脅迫72 h的牡蠣具有的NOS活力更高。

圖6 微塑料對近江牡蠣一氧化氮合成酶(NOS)活力的影響

注: 誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和結構型一氧化氮合成酶(structural nitric oxide synthase, cNOS)都屬于一氧化氮合成酶(NOS)

3 討論

貝類屬于濾食性生物, 環境海域中大量海水不斷被牡蠣的鰓組織過濾, 鰓組織會多次聚集積累污染物, 因此周圍環境的任何不利變化都可在鰓組織中得以體現[27]。當微塑料作用于貝類時, 可以損傷牡蠣正常細胞結構, 尤其是牡蠣配子和胚胎[28]。此外還導致牡蠣產生氧化應激反應, 產出活性氧、自由基等有害物質, 機體調節CAT、SOD和AKP等抗氧化酶清除有害物質, 減少微塑料對牡蠣的氧化損害[29]。AChE可通過乙酰膽堿影響免疫活性因子的活性進而影響活性氧的生成, NOS控制一氧化氮活力幫助機體清除氧自由基, 降低微塑料對牡蠣的氧化損傷[30-31], 而MDA可表示微塑料對牡蠣的氧化損傷程度。

AKP是一種磷酸單酯酶, 通常用于評估生物體免疫狀態[32]。AKP參與多種代謝過程, 如解毒、大分子的代謝和生物合成, 調節膜運輸, 參與轉磷酸作用, 促進體內的鈣磷代謝, 維持體內適宜的鈣磷比例, 同時也是海洋無脊椎動物的重要溶酶體酶[33-34]。在本實驗中, 聚苯乙烯微塑料濃度對鰓組織的AKP影響表現為“先升后降”的趨勢。陳夢玲等[35]將黑海參() 暴露在聚苯乙烯環境下也出現相同的結果。本研究中, 當脅迫時間達到72 h時, 實驗組的AKP活性均低于對照組, 初步推測是牡蠣機體降低AKP的活性以維持組織細胞正常的生理活動或因溶酶體膜受損, 使得滲透性改變, 導致AKP活性受到限制, 而目前已有研究證明微塑料能影響溶酶體膜的穩定性[36], 破壞細胞膜的完整性[37], 從而導致本研究中AKP活性隨脅迫時間和濃度的增長而呈現先增后減的趨勢。

SOD是生物體清除氧自由基的抗氧化酶, 可以催化超氧陰離子歧化為分子氧和過氧化氫, 是機體抗氧化防御的第一道防線[38]。有報道顯示, 斑馬貽貝()的SOD活性隨著微塑料濃度的增加呈現先增加后降低的趨勢[39]。同樣的, 本研究中SOD活性呈現先增加后降低的趨勢, 這表明聚苯乙烯微塑料脅迫可誘導牡蠣產生氧化應激反應, 從而刺激SOD活性提升, 有助于清除生物體內的自由基。但高濃度微塑料和長時間暴露使牡蠣體內吞噬活性、呼吸暴發活性增強而持續產生的大量活性氧自由基得不到及時有效地清除有關, 活性氧自由基對機體造成了氧化損傷, 削弱了機體內SOD的免疫應答能力[40-41], 故SOD的活力呈現先增加后降低的趨勢。

CAT是貝類氧化應激通路中防止活性氧形成必不可少的酶[42], 存在于紅細胞及某些組織內的過氧化體中, 它的主要作用是催化過氧化氫分解成氧和水, 阻止其轉化為活性更高的羥自由基(·OH)[43-45]。已有研究表明貝類CAT和SOD等抗氧化酶的表達量隨著聚苯乙烯的持續時間和微塑料濃度而增加[46], 而SOD和CAT能有效地影響活性氧濃度[31]。因此, 本研究中牡蠣鰓組織CAT活力隨著微塑料濃度的增加有上升的趨勢, 表明聚苯乙烯塑料使近江牡蠣的細胞內氧自由基增加, 機體協調CAT的活力來維持體內抗氧化系統的動態平衡。

MDA是脂質過氧化作用的產物。當生物體受到污染物脅迫時, 會誘發機體產生活性氧, 過多的活性氧將引發脂質過氧化, 產生大量脂質過氧化代謝產物[47-48]。通過本研究發現, 隨著微塑料濃度的升高, 近江牡蠣鰓組織中的MDA也逐漸增加, 這與Teng等人[30]研究長牡蠣()暴露于聚對苯二甲酸乙二醇酯和聚乙烯的結果一致。同時本研究顯示隨著暴露時間的延長, 同一濃度下的牡蠣鰓組織中的MDA濃度呈上升趨勢, 提示在微塑料的脅迫下, 近江牡蠣很可能產生大量的活性氧, 從而造成牡蠣脂質過氧化, 且暴露時間越長, 氧化損傷越嚴重。

AChE是乙酰膽堿代謝酶, 可催化分解乙酰膽堿成為膽堿和乙酸的水解反應, 也是生物神經傳導中的一種關鍵酶。乙酰膽堿一般通過與免疫細胞表面上的乙酰膽堿受體結合, 通過抑制細胞因子的合成來實現免疫調節的目的[49]。AChE活性易受到外源化合物(如有機磷、氨基甲酸酯農藥、多環芳烴、重金屬和表面活性劑)的抑制[50-52]。截形斧蛤()在聚乙烯和聚丙烯的聯合暴露下, 其鰓、消化腺以及肌肉中的AChE活力顯著下降[53]。本研究結果與之相同, 初步確定牡蠣在微塑料脅迫下, AChE活性受到抑制, 導致體內乙酰膽堿的濃度升高。

NOS能專一催化L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸和一氧化氮(nitric oxide, NO)。NO是一種信號傳遞分子和活性因子, 可與體內的氧自由基結合, 生成強氧化基, 對機體起保護作用, 同時NO對許多病原體有毒, 具有抑制脂質過氧化和清除自由基的作用, 被認為是先天免疫反應的重要組成部分[54]。由于NO半衰期短, 所以體內NO的生物作用完全依賴于NOS。NOS根據不同的組織分布和催化活性可分為神經型一氧化氮合酶、內皮型一氧化氮合酶和iNOS。其中神經型和內皮型一氧化氮合酶為cNOS, 其催化活性需要高濃度的Ca2+/CaM才可合成少量的NO, 而iNOS主要由巨噬細胞在炎性因子和細胞因子的刺激下, 產生相對高濃度的NO, 發揮巨噬細胞的功能[55]。NO的作用與其濃度相關, 低濃度下發揮往往促進細胞增殖和抗凋亡作用, 而高濃度時不利于細胞生長而誘導細胞凋亡[56]。在微塑料作用24 h后, 僅cNOS的活力增加, iNOS的活力基本與對照組一致, 表明此時牡蠣機體僅產生少量的NO減弱自由基的傷害。當微塑料作用72 h后, iNOS顯著增加(<0.05), 產生了大量的NO參與貝類的免疫防御過程。

4 結論

本研究表明, 不同濃度的微塑料對近江牡蠣免疫相關指標(SOD、CAT、MDA、AKP、NOS、AChE)具有不同程度的影響, 尤其對AKP、AChE和NOS的影響顯著(<0.05), 證實了成分為聚苯乙烯的微塑料脅迫會引起近江牡蠣的免疫應答, 且微塑料脅迫時間越長, 近江牡蠣的免疫應激反應越劇烈。

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Effect of polystyrene microplastics on oyster immunity

MOU Hong-li1, 4, WANG Rui-xuan2, WANG Jun3, LIN Xiao-zhi2, WANG Jiang-yong5

(1. Shanghai Ocean University, College of Marine Science, Shanghai 201306, China; 2. Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China; 3. South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 4. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510300, China; 5. Huizhou University, Huizhou 516007, China)

We aimed to study the effect of microplastics on oyster immunity by injecting oysters (average shell length: 6.6 cm) with different concentrations of polystyrene microplastics (0.05, 0.5, and 5 mg·L-1, with sterilized saline water as diluent) via intrashell injection(without damaging the soft tissue of oyster). The gills were sampled at 24, 48, and 72 h, respectively, and the activities of six immune-related indices, including alkaline phosphatase (AKP), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), nitric oxide synthase (NOS), and acetylcholinesterase (AChE), were determined. After 24 h of treatment, the concentration of microplastics had a significant effect on gill AKP activity in the oysters (0.05). AKP, SOD, and structural NOS initially increased and subsequently decreased. After 48 h of treatment, increasing the microplastic concentration led to a significant decrease in AChE activity (0.05), and CAT, SOD, and AKP initially increased and subsequently decreased. After 72 h of microplastic exposure, the activities of AKP and AChE initially decreased and then increased with an increase in microplastic concentration, whereas the activities of SOD, CAT, and inducible NOS initially increased and subsequently decreased. TheMDA content increased with time and concentration of microplastics.These results show that microplastics induce an immune stress response in oysters, and longer stress time causes a more intense immune stress response.

oyster; microplastics; enzyme activity; immune index

Aug. 10, 2021

[National Natural Science Foundation Program, No. 31902416; Research Project on Drug Resistance Transmission Patterns and Main Mechanisms of Aquatic Bacteria, No. 2022ZDX4029; Research Project on the Transmission Mechanism of Multiple Drug Resistance in Aquatic Vibrio, No. 2021ZDJS041]

S917.4

A

1000-3096(2023)9-0053-08

10.11759/hykx20210810002

2021-08-10;

2021-11-24

國家自然科學基金項目 (31902416); 水生細菌的耐藥性傳遞規律及主要機制研究(2022ZDX4029); 水生弧菌多重耐藥性的傳遞機制研究(2021ZDJS041)

牟紅莉 (1996—), 女, 漢族, 四川眉山人, 碩士研究生, 主要從事微塑料對貝類的污染研究, E-mail: 2797678008@qq.com; 王瑞旋(1979—), 通信作者, 女, 漢族, 廣東揭陽人, 副研究員, 主要從事貝類微生態研究, E-mail: wangruixuan@scsfri.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)