健脾消渴方干預2 型糖尿病大鼠的生物學基礎研究

鄧龍飛，王 駿，高 柳，顧晶晶，潘菊香，黃珍禎，姚靜雯*

（1.上海市浦東新區中醫醫院 藥劑科，上海 200120；2.上海中醫藥大學 科技實驗中心，上海 200120）

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種全球普遍性的代謝性疾病，主要臨床指征為胰島素分泌的絕對或相對不足，最終導致糖脂代謝功能的紊亂，呈現高血糖狀態[1]。T2DM 后期伴隨眾多慢性嚴重性并發癥，已成為危害人類健康的世界性問題[2]。中藥方劑在治療糖尿病上有著自身獨特的中醫理論基礎和較好的臨床療效，因此開展中藥防治T2DM 研究，既促進中藥機制探索，同時契合臨床研究實際需求。

糖尿病在傳統中醫理論上歸于“消渴”范疇。健脾消渴方源于古方消渴方，出于《丹溪心法》，書中無固定劑量，由全國名老中醫程益春教授“健脾降糖飲”加減化裁而成[3]。該方組成基本固定，由生黃芪、生天花粉、黃連、生地黃、川牛膝和佩蘭組成[4]。目前，健脾消渴方被運用于臨床治療T2DM 效果較為顯著，且安全性較高。有臨床研究表明，健脾消渴方治療T2DM 有效率高，且未有明顯的不良反應[5]；另一項中國臨床研究針對健脾消渴方治療T2DM 的臨床特點及規律，結果表明健脾消渴方在治療T2DM 病程較長且年紀較長者表現更好，證實了健脾消渴方的臨床療效[6]。

本研究采用超高效液相色譜串聯飛行時間質譜（UPLC-Triple-TOF-MS）分析系統，對健脾消渴方干預T2DM 大鼠的尿液非靶向代謝組學研究，篩選潛在的生物標志物和高信號強度的信號通路，為健脾消渴方臨床合理應用奠定理論基礎，也為安全用藥提供依據。

1 材料

1.1 試劑與溶劑

鏈脲佐菌素Streptozotocin (S0130，Sigma 公司)；鹽酸二甲雙胍［ACF0491，默克制藥（江蘇）有限公司］；Zoletil?50（8PEJA，Virbac 公 司）； LC/MS 級甲 醇（A456-4）、LC/MS 級 乙 腈（A955-4）、LC/MS級甲酸（A117-50）、HPLC 級異丙醇（A451-4）、超純水（W6-4），均購自美國Fisher Chemical 公司。

1.2 主要儀器

Vanquish Horizon 型UHPLC 液 相 色 譜 系 統、Q-Exactive system 型質譜儀（美國Thermo Scientific公司）；Wonbio-96c 型高通量組織破碎儀（上海萬柏生物科技有限公司）；Centrifuge 5430R 型冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.3 動物及試藥

動物：40 只SD 大鼠，體質量為（180±20）g，雄性，SPF 級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心。

健脾消渴方：中藥飲片購于上海養和堂中藥飲片有限公司，經上海浦東新區中醫醫院藥劑科潘菊香教授鑒定為正品。該方組成如下：生黃芪30 g（批 號：2022071608），天 花 粉15 g（批 號：20220614）， 生 地15 g（ 批 號：2022070408）， 黃連9 g（批號：2022072308），川牛膝15 g（批號：20220328），佩蘭12 g （批號：20220419），加8 倍量水，浸泡30 min，煎煮2 次，每次40 min，合并2次提取液，濃縮至2 g/mL。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

造模：以高膳食+STZ（鏈脲佐菌素）誘導Ⅱ型糖尿病大鼠為模型。SD 大鼠適應性喂養1 周后，隨機分組，除正常組外，其余大鼠均給予高膳食飼料進行喂養，持續4 周。高膳食飼料配方組成：蛋黃粉5%、蔗糖20%、豬油15%，普通飼料60%，由動物實驗中心委托上海帆泊生物技術有限公司定制。喂養4 周后，對SD 大鼠禁食不禁水12 h，以2%STZ 溶液進行左下腹腔注射，劑量為35 mg/kg。造模3 d 后，檢測造模大鼠，以隨機血糖≥16.7 mmol/L 提示造模成功[7]。不達標者，可通過腹腔注射STZ 10 ～ 20 mg/kg進行二次造模，隨機血糖≥16.7mmol/L 并穩定1 周，可視為造模成功。

分組及給藥：共分為4 組，正常對照（NC）組、模型對照（Model）組、健脾消渴方（JPXK）組、鹽酸二甲雙胍（Met）組。JPXK 組給藥（中藥提取濃縮液）劑量為20 g/kg，Met 組為200 mg/kg，其余各組灌胃等劑量蒸餾水。持續4 周給藥后，腹腔注射Zoletil?50（舒泰50）進行麻醉取材，大鼠麻醉劑量為40 mg/kg，該實驗檢測所用樣本為尿液。

2.2 樣本處理

樣本處理：精確移取200 μL尿液樣本于EP管中，向EP 管中加 800 μL 提取液(甲醇:乙腈=1 : 1)于樣品中，渦旋（30 s）混勻后，低溫超聲萃取30 min（5℃，40 kHz），將樣品靜置于-20 ℃，30 min 后，13 000 r/min，4 ℃，離心15 min，離心取全部上清液，抽干，加100 μL 復溶液(乙腈:水=1 : 1)進行復溶，低溫超聲萃取5 min（5℃，40 kHz）；5 min 后，13 000 r/min，4℃，離心15 min。離心取上清液，轉移至LC-MS 進樣小瓶上機分析。

QC 樣本：即質控樣本，由等體積的所有樣本代謝物混合組成，在該次的儀器分析過程中，與原樣本設定10 : 1 比例插入混檢，目的考察整個實驗分析中的重復性。

2.3 LC-MS 檢測

色譜條件：取10 μL 樣本，由BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）分離后進入質譜開始檢測。流動相A：水（含0.1%甲酸），流動相B：乙腈/異丙醇（1/1）（含0.1%甲酸）。分離梯度：0 ～ 3 min，5%→20%B； 3 ～ 9 min，20%→95%B；9 ～ 13 min，95%B；13.0 ～ 13.1 min，95% →5%B；13.1 ～ 16 min，5%B。流 速：0.40 mL/min；柱 溫：40℃。

質譜條件：采用正負離子掃描模式進行該次實驗樣品質譜信號采集，質量掃描范圍（m/z）：50 ～1 000。離子噴霧電壓，正離子電壓為5 000 V，負離子電壓為4 000 V，去簇電壓為80 V，噴霧氣為50 psi，輔助加熱氣為50 psi，氣簾氣為30 psi，離子源加熱溫度為500 ℃，20 ～ 60 V 循環碰撞能。

2.4 數據分析

將獲得的LC-MS 原始數據導入代謝組學處理軟件Progenesis QI 進行處理，包括基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，獲得最終數據矩陣（包含保留時間、質荷比和峰強度等信息），數據矩陣用80%去除缺失值， 即保留至少一組樣品中非零值 80%以上的變量，再進行填補空缺值（原始矩陣中最小值填補空缺值）。用總和歸一化法對獲得樣本的質譜峰的響應強度進行歸一化處理，目的在于減小樣品制備及儀器不穩定等因素產生的誤差，獲得處理過后的數據矩陣。同時保留QC樣本相對標準偏差（RSD）＜30%的變量，并進行保留數據的log10 對數化處理，獲取最終用于后續分析的數據矩陣。將MS 和MSMS 質譜信息與相關代謝數據庫進行注釋匹配，主要數據庫為HMDB 等公共數據庫、Majorbio 數據庫及Metlin 數據庫等。

3 結果

3.1 UPLC-Triple-TOF-MS 分析尿液樣本

對健脾消渴方干預T2DM 各組大鼠的尿液樣本進行數據分析，精密度和穩定性考察結果符合要求。所獲得的分析數據表明，各組大鼠尿液中代謝物分離度較好，滿足了非靶向代謝組學對于代謝物的全面性、整體性的標準。與NC 組相比，Model 組代謝物的TIC 圖出現了明顯差異，表明Model 組造模成功；在健脾消渴方及陽性藥干預治療后，TIC 圖中分離度、峰數目等相對于Model 發生變化，并趨向于NC 組靠攏，提示藥物具有較好的治療效果，見圖1。

圖1 各組大鼠尿液樣本負離子模式下的TIC 圖Fig.1 TIC diagram of urine samples of rats in each group in negative ion mode

3.2 總代謝物注釋信息

對各組大鼠尿液樣本進行非靶向代謝組學實驗分析，獲取的總代謝物進行注釋到相應數據庫獲得對應信息。注釋到HMDB 數據庫結果表明總代謝物分類情況，主要以有機酸及其衍生物22.27%、脂質和類脂質分子19.33%、有機雜環化合物18.81%為主（圖2A）；通過注釋到KEGG 化合物數據庫結果表明，KEGG 化合的第一分級上，總代謝物主要以脂質、肽、有機酸、碳水化合物為主，包括了羧酸、氨基酸、單糖、磷脂等（圖2B）；注釋到KEGG 信號通路數據庫展示了其涉及的核心通路為代謝、人類疾病等領域，包括了氨基酸代謝、其他次級代謝物的生物合成、脂質代謝等（圖2C）。

圖2 總代謝物注釋信息：HMDB 數據庫結果（A）、KEGG 化合物數據庫結果（B）和KEGG pathway 數據庫結果（C）Fig.2 Total metabolite annotation information: HMDB database results (A), KEGG compound database results (B) and KEGG pathway database results (C)

3.3 樣本比較分析

進一步對獲得的差異代謝物進行深度挖掘信息，并進行樣本間的比較分析。Heatmap 圖（陽離子檢測模式）展示了NC 組與其余三組代謝產物表達差異程度較大，具有顯著性意義，提示造模成功；JPXK 組與NC 組聚類層級接近，提示其樣本具有相關性；Model 組與NC 組相距最遠，提示了Model 組大鼠內在代謝出現紊亂，見圖3A。

圖3 樣本比較分析熱圖（A）及PCA 分析結果（B）Fig.3 Sample comparative analysis heatmap (A) and PCA analysis results (B)

PCA 分析表明，在正離子模式下，NC 組與其余三組代謝產物分離度較高，代謝產物表達輪廓區分明顯；JPXK 組與Model 組相比，分離度相對較高，有重合區域也有各自獨有區域，提示了在健脾消渴方干預T2DM 大鼠后，對尿液代謝差異代謝物產生改變；隨后將采用有監督的多維統計分析方法PLS-DA 分析對兩組樣本之間的差異進行模型分析，見圖3B、表1。

表1 PCA 分析Scores 圖的模型參數表Tab.1 Model parameter table of PCA analysis scores plot

采用PLS-DA 分析針對性比較兩組間差異性。由圖4（A1、B1）可知，各兩組間的分離度較好，造模后，Model 組代謝產物數據已開始偏離NC 組，對Model組給予JPXK 治療后代謝產物差異性明顯。同時，對上述2 個PLS-DA 分析進行模型驗證，通過200 次置換檢驗對PLS-DA 模型進行驗證，確保未發生過擬合，置換檢驗評價的標準為Q2回歸線與Y軸的截距，截距小于0.05 表明模型穩健可靠，未發生過擬合，見圖4（A2、B2）。

圖4 PLS-DA 分析針對性比較兩組間差異性Fig.4 The PLS-DA analysis compared the differences between the two groups

3.4 組間差異代謝物分析

針對Model 組和JPXK 組的差異性代謝物進行比較分析，在陽+陰離子檢測模式下，顯著性差異代謝物定義為P_value ＜0.05，VIP_pred_OPLS-DA ＞1，共計589 個差異代謝產物，其中上調差異性代謝物為209 個，下調差異代謝物為380 個（圖5A）；對589個差異代謝產物進行KEGG Compound 分類，差異代謝物中，主要集中在Lipids 和Peptides 領域，包括了氨基酸、羧酸、磷脂和脂肪酸（圖5B）。

圖5 JPXF 組與Model 組的差異代謝物火山圖（A）及KEGG Compound 分類（B）Fig.5 Volcano map (A) and KEGG compound classification (B) of differential metabolites between JPXF group and Model group

3.5 差異代謝物識別及分析

3.5.1 構建潛在生物標志物代謝集 基于前期研究中PLS-DA 及OPLS-DA 分析，以設定VIP 參數大于1 為條件，對組間兩兩比較展開篩選，數據實際處理時發現差異物數量較多，不利于后續分析，故提高參數篩選條件，選擇 VIP ＞1.5 的化合物，再結合獨立t檢驗的P＜ 0.01 篩選出符合要求的化合物即為潛在生物標志物。分析所得數據繁雜。將重點關注的方向集中在NC 組與Model 組，發生了顯著性變化的差異代謝物（341 個），并且在JPXK 的干預治療下（329 個），又發生了顯著性變化的某些特定代謝產物，共篩選出60 個內源性化合物發生了上述改變，視為潛在的生物標志物，包括輔酶B、二十二碳六烯酸、LysoPC［(20 : 4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0 : 0)］、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、水蘇糖、棕櫚酰肉堿、硫酸去甲腎上腺素、12-epi-LTB4 等。同時創建潛在生物標志物專屬代謝集，注釋到KEGG 數據庫比對。在KEGG 數據庫中具有對應信號通路的15 個潛在生物標志物的相關信息，涉及的主要信號通路為碳代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝、半乳糖代謝，詳細信息見表2。

表2 生物標志物相關信息表Tab.2 Table of information related to Biomarkers

3.5.2 VIP 值分析 通過聚類熱圖和變量權重值（VIP）條形圖的聯合使用，可展示各組中代謝物在各樣本中的表達和代謝物在多元統計分析的VIP 和單維統計中的P值，從而直觀的看出差異代謝物的重要性和表達量的趨勢變化。選取VIP 值前20 統計分析，見圖6，Model 組和JPXK 組相比，豐度排名前20 的代謝物豐度差異明顯，相比于Model 組，JPXK組包括莽草酸、薯蕷皂苷D、綠花堿、Marmesin rutinoside 及L-丙氨酸等豐度前20 的代謝物含量水平均出現上調。

圖6 VIP 值前20 差異代謝物的相對表達及顯著性分析Fig.6 Relative expression and significance analysis of the top 20 metabolites of VIP

3.6 差異代謝物的KEGG 信號通路挖掘

考慮中藥干預后，可能對T2DM 大鼠干預新的信號通路，產生新的差異代謝物，并不包含于上述挖掘的共同潛在生物標志物范圍中，因此，直接將各組間比較得到的差異代謝物利用KEGG 數據庫，通過KEGG 通路富集，利用MetaboAnalyst 軟件將代謝集中的代謝物按照其參與的pathway通路進行分析（圖7），用以完善整體數據挖掘信息。結果表明，健脾消渴方改善T2DM 與色氨酸代謝相關性最強，此外，可能通過苯丙素類的生物合成、類苯丙酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成進行調節。

圖7 Model 組與JPXK 組的差異代謝物的KEGG 通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis of differential metabolites between Model and JPXK group

4 討論

研究結果表明健脾消渴方干預T2DM 大鼠尿液中的潛在生物標志物包括了色氨酸、硫酸去甲腎上腺素、LysoPC(20 : 4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0 : 0)等物質，涉及的主要信號通路為氨基酸代謝、脂肪酸代謝、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝等代謝通路。

健脾消渴方干預后，尿液中硫酸去甲腎上腺素、色氨酸等含量上升，表明與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成關系密切[8]。去甲腎上腺素已被證實具有免疫調節及抗炎作用，而系統性炎癥是T2DM 重要的表征之一，抗炎有助于改善T2DM[9]，該成分含量上調，揭示了健脾消渴方具有一定抗炎作用。色氨酸是表達5-羥色胺的前體，其生物合成途徑異常必然會負反饋5-羥色胺表達，從而導致神經系統出現功能障礙及炎癥，這也是糖尿病并發癥中多出現周圍神經病變的原因[10]。健脾消渴方改善上述成分的表達，提示其可能具有一定的保護神經系統功能性作用，值得進一步深入研究。T2DM 患者普遍存在糖代謝異常，與多個代謝途徑（葡萄糖生成、糖酵解/糖異生、三羧酸循環等）緊密相關[11]，健脾消渴方干預多信號通路研究結果夯實了這一結論。

在T2DM 病程中，脂質代謝異?？蛇M一步加重胰島素抵抗（IR）[12]。健脾消渴方可上調二十二碳六烯酸（多不飽和脂肪酸PUFAs）含量表達，可多途徑維持細胞膜的穩定性，減輕炎癥損傷，調節細胞功能[13]。溶血磷脂酰膽堿LysoPC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)為脂質類成分，可調節機體胰島素分泌，積極參與脂質代謝和糖尿病的進程[14]，健脾消渴方干預后相對含量上調，總體趨向于正常含量表達，基于lysoPC 和lysoPE 為炎癥及體內氧化應激相關代謝的中間產物，推薦作為特征性指標，可協助預測早期糖尿病[15]。

5 結論

本研究利用LC-MS 技術分析了健脾消渴方干預T2DM 代謝相關的物質基礎和可能的信號通路，為該中藥方劑的臨床使用及合理用藥提供實驗依據。目前單一的非靶向代謝組學的研究仍顯得不夠完善，后續研究將結合關鍵性的分子信號通路，多組學多技術聯用，探索新的藥物作用靶點，進一步挖掘健脾消渴方干預T2DM 的作用機制。