斜葉黃檀HPLC 指紋圖譜及含量測定研究

覃川嫻，何澤源，黃清霞，韋建華，馮 旭

（1.廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧530200；2.廣西高校中藥提取純化與質量分析重點實驗室，廣西 南寧530200）

斜葉黃檀Dalbergia pinnata(Lour.) Prain 為豆科黃檀屬植物，又名羽葉檀、羅望子葉黃檀、斜葉檀，主產于海南、廣西、云南及西藏等地區。最早收錄于《云南藥用植物名錄》，記載其根可消炎解毒、截瘧、治瘧疾[1]?！吨袊参镏尽分杏涊d其“全株藥用，治風濕、跌打、扭挫傷，有消腫止痛之效”[2]。我國海南、云南等民間將其外用于跌打損傷、刀傷、燙傷等，亦可內服用于治療心血管疾病和糖尿病等疾病，具有悠久的民間藥用歷史[3]?，F代研究表明，斜葉黃檀中主要含有黃酮類、揮發油類、甾醇類及三萜類等成分[4-6]，具有抗炎、抗氧化、抗菌、褪黑等作用[7-8]。

目前有關斜葉黃檀的研究報道較少，主要集中在品種鑒定、化學成分分析以及藥理作用等方面。在質量標準研究方面，有學者對斜葉黃檀進行性狀、顯微鑒別，并利用薄層色譜法、氣相色譜法等對斜葉黃檀中的揮發油進行檢測分析，但未對其他成分進行研究[9]。本研究采用HPLC 法建立斜葉黃檀指紋圖譜并同時測定原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素4 種成分的含量，以期為斜葉黃檀的質量控制提供一定的參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（VWD 檢測器，美國安捷倫科技公司）；Agilent 1100 Series 型高效液相色譜儀（DAD 檢測器，美國安捷倫科技公司）；XSR205 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試藥與試劑

原 兒 茶 酸（ 純 度＞98%， 批 號：GR-138-011006）、芒柄花素（純度＞98%，批號：GR-138-024504）均購于南京廣潤生物制品有限公司；桂皮鞣質B1（純度＞98%，批號：20221013）購于成都草源康生物科技有限公司；芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷（歸一化法計算純度＞98%）為實驗室自制。乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。10 批斜葉黃檀藥材經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室廖月葵高級實驗師鑒定，均為豆科黃檀屬植物斜葉黃檀Dalbergia pinnata(Lour.) Prain 的根莖。陰干，打粉，過二號篩。藥材來源見表1。

表1 斜葉黃檀藥材來源Tab.1 Source of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain medicine

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 18 min，10% → 13%A；18 ～ 23 min，13% →15%A；23 ～ 43 min，15% →19%A；43 ～ 67 min，19% →25%A；67 ～ 112 min，25% →45%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為25℃；進樣量為10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取斜葉黃檀藥材1 g，精密稱定，精密加入55%乙醇10 mL，超聲處理70 min，用55%乙醇補重，搖勻，取續濾液，即得。

2.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，用甲醇溶解并定容，制成每毫升含原兒茶酸3.94 μg、桂皮鞣質B1 1 108.29 μg、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷223.85 μg、芒柄花素8.56 μg的溶液。

2.4 斜葉黃檀指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗 取同一批斜葉黃檀藥材粉末（S1），制成供試品溶液，按“2.1”項下條件連續進樣6 次，以5 號峰（桂皮鞣質B1）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 分別小于0.33%和2.2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取同一批斜葉黃檀藥材粉末（S1），制成供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項下條件進樣測定，以5 號峰（桂皮鞣質B1）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 分別小于0.99%和2.8%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批斜葉黃檀藥材粉末（S1）6 份，制成供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣測定，以5 號峰（桂皮鞣質B1）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 分別小于0.28%和2.8%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 指紋圖譜的建立 取10 批斜葉黃檀藥材，制成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，將10 批斜葉黃檀藥材所得圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，以S1 斜葉黃檀藥材圖譜為參照圖譜，生成10 批斜葉黃檀藥材的疊加圖譜，確定了13 個共有峰，并通過對照品保留時間和紫外光譜對比，確認了1、5、10、13 號峰分別為原兒茶酸、桂皮鞣質B1 、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素，見圖1、2。

圖1 10 批斜葉黃檀供試品疊加色譜圖Fig.1 Superimposed chromatograms of 10 batches of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain samples

圖2 混合對照品(A)和斜葉黃檀供試品(B)色譜圖Fig.2 HPLC of mixed reference substance(A) and Dalbergia pinnata (Lour.) Prain sample(B)

2.4.5 相似度評價 以5 號峰（桂皮鞣質B1）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間見表2，相對峰面積見表3。10 批斜葉黃檀藥材的相似度分別為0.990、0.990、0.993、0.967、0.983、0.990、0.994、0.997、0.995、0.990。

表2 共有峰相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相對峰面積Tab.3 Relative peak area of common peaks

2.4.6 聚類分析 將10 批次斜葉黃檀藥材13 個共有峰的峰面積從中藥相似度軟件導出，整理后導入SPSS（21 版）軟件進行聚類分析，結果見圖3。10批斜葉黃檀藥材以10 平方歐氏距離為準可細分至三類：S6 單獨為第一類；S5、S9 為第二類；S1 ～ S4、S7、S8、S10 為第三類。表明不同產地的斜葉黃檀共有峰含量之間存在一定的差異。

圖3 聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram

2.4.7 主成分分析 以10 批次斜葉黃檀藥材的13個共有峰峰面積為變量，使用SPSS（21 版）軟件進行主成分分析，提取得到3 個主成分，累積方差貢獻率為89.943%，見表4。載荷矩陣結果顯示，色譜峰5（桂皮鞣質B1）、色譜峰8、色譜峰9 在主成分1 上有較高載荷；色譜峰2 在主成分2 上有較高載荷；色譜峰10（芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷）、色譜峰13（芒柄花素）在主成分3 上有較高載荷。建立以主成分1、2、3 的空間散點坐標系得PCA 得分圖，其結果與聚類分析（以10 平方歐氏距離）相一致，見圖4。

圖4 PCA 得分圖Fig.4 PCA score chart

表4 主成分的初始特征值和貢獻率Tab.4 Principal component analysis of eigenvalue and variance contribution rate of samples

2.5 斜葉黃檀含量測定研究

2.5.1 線性關系考察及檢測限、定量限 取不同體積的混合對照品溶液，用甲醇配制成不同的濃度，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標建立各成分的線性回歸方程；逐級稀釋標準品溶液，按信噪比（S/N=3）計算各成分的檢測限；按信噪比（S/N=10）計算各成分的定量限。結果見表5。

表5 4 種成分的線性關系及檢測限、定量限Tab.5 Linearity of 4 components and LOD， LOQ

2.5.2 精密度試驗 取“2.3”項下混合對照品溶液連續6 次進樣，計算得到原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分峰面積RSD分別為0.96%、0.18%、0.68%、0.48%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 同“2.4.2”項下方法，計算得到原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分峰面積RSD 分別為1.10%、0.40%、0.51%、0.44%，表明該方法在24 h 內基本穩定。

2.5.4 重復性試驗 同“2.4.3”項下方法，計算得到原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分含量RSD 分別為1.60%、1.20%、0.75%、0.46%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知各成分含量的斜葉黃檀粉末（S1）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，大約按1 : 1 比例加入混合對照品溶液，按“2.2”項下方法制備，按“2.1”項下條件測定，計算得到原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分平均加樣回收率分別為103.79%、103.26%、96.22%、104.06%，RSD 分別為1.2%、1.3%、2.8%、1.2%，結果表明方法準確可行。結果見表6。

表6 斜葉黃檀中4 種成分加樣回收試驗結果（n = 6）Tab.6 Recovery experiment of 4 components in Dalbergia pinnata (Lour.) Prain by sample addition(n = 6)

2.5.6 樣品含量測定 取10 批斜葉黃檀藥材制備成供試品溶液，分別測定，計算各產地原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素成分的含量，結果見表7。

表7 10 批斜葉黃檀中4 個成分的測定結果（μg/g, n = 3）Tab.7 Measurement results of 4 components in the 10 batches of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain (μg/g, n = 3)

3 討論

本研究采用HPLC-DAD 進行全波長掃描發現，在254 nm 波長下原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素均有較強的紫外吸收，色譜峰峰型較好且雜峰干擾較少，因此確定254 nm 為檢測波長。并對不同流動相（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%乙酸）、色譜柱（Inertsil 柱、Waters 柱、Phenomenex 柱、FeniGen 柱）、柱溫（20、25、30、35、40℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、進樣量（5、10、15 μL）進行考察，結果發現采用Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，進樣量：10 μL，所得色譜峰的分離效果最好。

本研究建立的10 批斜葉黃檀HPLC 指紋圖譜，相似度均大于0.900，由于本實驗收集的斜葉黃檀藥材均來自廣西地區，表明該地區斜葉黃檀藥材質量差異較小，藥材質量總體較為穩定。聚類分析和主成分分析結果顯示，10 批次斜葉黃檀以10 平方歐氏距離為準可分至三類，表明不同產地的斜葉黃檀共有峰含量之間存在一定的差異，可能受生長環境、生長年限、采收期等影響。

根據10 批不同產地斜葉黃檀的含量測定結果分析，廣西區內不同產地斜葉黃檀中的原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素含量存在一定的差異。其中，不同產地的斜葉黃檀藥材中4 種成分均以桂皮鞣質B1 的含量最高，均占其總含量的70%以上，推測桂皮鞣質B1 含量對斜葉黃檀藥材質量影響較大，可考慮作為評價斜葉黃檀藥材質量的指標之一。

4 結論

本研究建立的斜葉黃檀HPLC 指紋圖譜以及對原兒茶酸、桂皮鞣質B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素4種成分的含量測定方法，能有效分析不同產地的斜葉黃檀藥材的質量差異，為進一步研究其藥效關系和質量控制提供參考。但研究所用的斜葉黃檀均來源于廣西地區，存在樣品批次較少、代表性不夠等問題，后續可將其有效成分作為指標對其他地區斜葉黃檀進行研究，進而為斜葉黃檀藥材的質量控制提供依據。