西妥昔單抗對A-431細胞系增殖和凋亡的影響

殷祥燁，姜偉乾，韓愚弟，韓 巖

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第一醫學中心整形修復科，北京 100853

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)是由表皮角質形成細胞惡性增殖引起的一種皮膚惡性腫瘤[1]。在所有皮膚癌中，其發病率僅次于基底細胞癌，病死率僅次于黑色素瘤[2]。近年來，cSCC的發病率呈顯著上升趨勢，高齡、日光照射等常見因素均可誘發cSCC，給人們的健康帶來了極大的威脅[3-4]。美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南建議，對于無法接受手術治療的晚期cSCC患者，其治療方案首選為放療聯合順鉑的整體治療方案，不能接受放療者可采用帕博利珠單抗或西米普利單抗進行免疫治療。靶向治療方案雖具有良好的安全性和有效性，但因缺乏臨床試驗結果，目前仍未被列入cSCC的指南和共識[5]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在多種惡性腫瘤中處于高表達狀態，對腫瘤細胞的增殖、分化起重要作用[6]。西妥昔單抗(cetuximab，Cet)是一種單克隆抗體藥物，對EGFR具有高特異性。鑒于其優秀的抗腫瘤效果和出色的安全性，已被用于轉移性結直腸癌、晚期頭頸部鱗狀細胞癌的治療[7-8]。有研究表明，EGFR在cSCC中為高表達狀態，通過下調EGFR的表達可抑制cSCC細胞的增殖、遷移和侵襲，從而發揮抗腫瘤效應[9]。據此，本研究擬探討Cet對高表達EGFR的皮膚鱗狀細胞癌細胞A-431增殖和凋亡的影響，以期為臨床中無法接受手術治療的cSCC患者提供一種安全有效的治療可能。

材料與方法

1 細胞系及細胞培養 皮膚鱗狀細胞癌細胞A-431購自武漢普諾賽公司，人永生化表皮細胞Ha-Cat購自湖南豐暉生物科技有限公司。A-431細胞在添加10%(V/V)胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖(4.5 g/L葡萄糖)培養基中培養，HaCat細胞在添加10%(V/V)胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM低糖(1.0 g/L葡萄糖)培養基中培養。所有細胞均在37℃，5% (V/V) CO2條件下培養。當細胞融合度達到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，傳代培養或接種于細胞板中進行后續實驗。

2 主要試劑 Cet購自德國默克公司。Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)、Dimethyl sulfoxide (DMSO)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DMEM高糖培養基(4.5 g/L葡萄糖)、DMEM低糖培養基(1.0 g/L葡萄糖)購自美國Corning公司。青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal calf serum，FBS)購自美國Gibco公司?？笶GFR抗體購自武漢賽維爾生物科技有限公司，抗GAPDH抗體購自美國CST公司。RIPA裂解緩沖液及BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

3 主要儀器 CO2恒溫細胞培養箱(美國Thermo Scientific)，超凈工作臺(天津泰斯特公司)，Spectra Max M8酶標儀(美國MD公司)，凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Tanon 4800 全自動化學發光圖像分析系統(上海天能生命科學有限公司)，Cytomics FC 500流式細胞儀(美國Beckman公司)。

4 細胞EGFR表達量篩查分析 運用人類蛋白質圖譜數據庫(https://www.proteinatlas.org)，篩查并分析其所收錄的41種正常組織和腫瘤細胞系中EGFR的表達情況。

5 Western blot檢測EGFR蛋白表達 向A-431細胞和HaCat細胞中加入RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心15 min，提取A-431細胞和HaCat細胞蛋白，應用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離等量的蛋白質，并通過凝膠電泳儀轉移到PVDF膜上。應用含5%脫脂牛奶的TBS-T溶液封閉PVDF膜1 h，隨后與EGFR一抗及GADPH一抗孵育過夜。最后，將PVDF膜洗滌3次，并與辣根過氧化物酶偶聯抗體在室溫下孵育2 h。Western blot圖像采用Gel成像系統，在膜頂部添加200 μL ECL化學發光試劑，檢測目的蛋白條帶。

6 細胞毒性實驗 將A-431細胞以8 × 103/孔的細胞密度接種于96孔板中，培養12 h。實驗組用Cet以0.025 μg/mL ~ 200 μg/mL的濃度處理細胞48 h，對照組加入同等體積的PBS溶液。在每孔中加入10 μL的MTT (5 mg/mL)，繼續培養細胞4 h，吸棄上清液體，每孔中加入200 μL的DMSO溶液，37℃恒溫條件下中低速震蕩10 min，使甲瓚結晶充分溶解，應用酶標儀于490 nm和570 nm波長處測量各孔的吸光度值，并計算各藥物濃度下的細胞存活率。細胞存活率=[(實驗孔-對照孔)/(對照孔-空白孔)] × 100%[10]。

7 細胞凋亡檢測 將A-431細胞接種于12孔板上(3 × 105/孔)。孵育12 h后，分別用PBS、Cet(150μg/mL)處理細胞24 h。消化、收集各組細胞，離心去除上清液，以PBS洗滌細胞，應用1 ×binding buffer重懸細胞，先后加入Annexin V-FITC和PI，在37℃條件下避光孵育15 min。即刻用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

8 統計分析方法 本研究的每個實驗均重復3次，計量資料以表示。數據通過Graphpad Prism 8軟件進行分析處理。組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 EGFR在A-431細胞中的表達情況 A-431細胞來源于1例85歲的老年女性cSCC患者，是目前應用最廣泛、最具代表性的商品化cSCC細胞系[11]。為研究A-431細胞中EGFR的表達情況，我們對人類蛋白質圖譜數據庫中收錄的41種正常組織及腫瘤細胞系的EGFR表達情況進行了篩查分析。結果表明，在所有正常及腫瘤組織細胞中，A-431細胞的EGFR表達量排名第1，且遠高于其余各種細胞(圖1A)。隨后，我們通過Western blot實驗對培養的A-431細胞及對照組HaCat細胞進行了EGFR表達情況的對比。結果表明，A-431細胞中EGFR的表達量遠高于HaCat細胞(圖1B)。以上實驗結果均表明，皮膚鱗狀細胞癌細胞A-431的EGFR呈高表達狀態，且表達量遠高于正常表皮及器官組織細胞，是研究Cet靶向治療皮膚鱗狀細胞癌的最優選擇。

圖1 EGFR在各種細胞中的表達情況 A：人類蛋白質圖譜數據庫中收錄的41種正常組織及腫瘤細胞系的EGFR表達鑒定；B：Western blot檢測A-431細胞及HaCat細胞EGFR表達情況Fig.1 Expression of EGFR in cells A: Identification of EGFR expression in 41 normal tissues and tumor cell lines included in human protein map database; B: Expression of EGFR in A-431 and Hacat cells detected by Western blot

2 MTT法檢測Cet對A-431細胞增殖的影響MTT結果顯示，用Cet (0.025 μg/mL、0.25 μg/mL、2.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)處理A-431細胞48 h，A-431的細胞生存率隨Cet濃度的增加而降低。在200 μg/mL Cet濃度下，A-431的細胞生存率僅為38.65%(P＜0.01；圖2)。這表明與對照組相比，Cet可顯著抑制A-431細胞增殖，充分發揮單藥抗腫瘤作用。

圖2 Cet對皮膚鱗狀細胞癌細胞A-431增殖的影響Fig.2 Effect of Cet on the proliferation of A-431 cells detected by MTT assay

3 流式細胞術檢測Cet對A-431細胞凋亡的影響我們通過Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)雙染法在A-431細胞中對不同組別的細胞凋亡情況進行了分析。結果表明，Cet組在150 μg/mL濃度下，細胞凋亡率達29.85%，而空白對照組的細胞凋亡率為10.44%(P＜0.01；圖3A、圖3B)。實驗結果表明，Cet可通過影響細胞凋亡相關蛋白發揮其抗腫瘤效應。

圖3 Cet對皮膚鱗狀細胞癌細胞A-431凋亡的影響A：流式細胞術檢測Cet及對照組處理后A-431細胞的凋亡情況；B：A-431細胞凋亡率統計Fig.3 Effect of Cet on apoptosis of A-431 cellsA: Apoptosis of A-431 cells detected by flow cytometry; B: Statistics of apoptosis rate of A-431 cells

討 論

cSCC是發病率最高的皮膚惡性腫瘤之一，男性發病率為9% ~ 14%，女性發病率為4% ~ 9%[12]。由于人口壽命延長以及多種因素(如日光照射等常見致癌)的影響，近些年cSCC患病率顯著增加[13]。雖然大部分cSCC患者可通過切除腫瘤或局部放療的方式獲得良好預后，但也有一部分患者表現出局部浸潤和轉移的傾向[14]。美國明尼蘇達州的一項研究表明，cSCC的局部復發通常發生在初次診斷后的2年內。手術切除后，具有高風險特征的患者有13% ~ 41%的局部區域復發率和7% ~ 16%的遠處轉移率，而涉及淋巴結轉移的cSCC患者10年生存率低于20%[15]。

考慮到種種不良預后，人們單獨提出了晚期cSCC的概念[16]。晚期cSCC包括局部晚期cSCC(lacSCC)和(或)轉移性cSCC (mcSCC)。lacSCC定義為局部晚期進展(腫瘤已深入到皮下組織、肌肉或神經)且不再適合行手術或放射治療的cSCC。mcSCC是指已經擴散到原始位置外的相鄰皮膚、淋巴結或其他器官的腫瘤類型[17-18]。NCCN指南指出，手術治療是目前根治cSCC的首選方法[5]，但部分晚期cSCC患者無法通過手術得到有效治療[17]。隨著cSCC發病率的不斷提高，疑難、晚期的病例愈發多見，晚期cSCC患者治療方式的選擇在過去10年中發生了重大變化。

考慮到疾病嚴重程度、腫瘤位置和患者合并癥等因素，目前晚期cSCC患者大多采用基于順鉑的化學療法或姑息性治療方案。不過這類治療方法持續時間長、不良反應程度重，嚴重影響了患者的依從性，從而限制了治療效果[5,19]。隨著免疫治療、靶向治療等新興治療方式的出現，晚期cSCC患者的治療有了新的選擇。與傳統化療藥物相比，這些藥物具有程度更輕的不良反應，在晚期疾病患者中可能具有更好的治療有效性和耐受性[20]。

EGFR是一種致癌受體蛋白酪氨酸激酶，可啟動多種細胞內信號通路。EGFR過表達與腫瘤細胞存活、增殖、侵襲和轉移密切相關，已在多種類型的惡性腫瘤中觀察到了EGFR的高表達[21]。目前，基于抗EGFR的靶向治療方案已成為結直腸癌等諸多高表達EGFR實體瘤的一線治療選擇[22]。為探究EGFR在cSCC中的表達情況，有研究者通過免疫組織化學染色的方式對cSCC組織樣本進行研究，結果表明EGFR在85.7%的cSCC細胞中過度表達[16]。此外，據文獻報道，EGFR的表達在cSCC增殖、侵襲和轉移中發揮重要作用，與cSCC患者的不良預后密切相關[23-24]。目前已有多項實驗研究表明，抑制EGFR的表達可作為cSCC的有效治療策略[9,25-26]。

Cet是一種嵌合免疫球蛋白G1單克隆抗體，與EGFR的外部域結合后可誘導EGFR內化和降解，阻斷細胞內信號轉導途徑，從而抑制腫瘤細胞的增殖，誘導癌細胞的凋亡[27]。鑒于其優異的安全性和抗腫瘤作用，已被批準用于RAS基因野生型轉移性結直腸癌(2005年)以及晚期頭頸部鱗狀細胞癌(2020年)的治療中。雖然Cet的療效和安全性已在結直腸癌和頭頸部鱗狀細胞癌的治療中得到證實，但目前有關Cet治療cSCC的研究還相對缺乏，其對cSCC細胞增殖和凋亡的影響尚不明確。

本研究通過人類蛋白質圖譜數據庫篩查分析發現，EGFR在A-431細胞中的表達遠超其余各種細胞，是EGFR表達量最高的細胞。我們通過Western blot實驗，對比了A-431細胞和HaCat細胞中EGFR的表達情況。結果顯示， 與HaCat相比，A-431細胞中EGFR確實為高表達狀態。這一結果也與文獻報道的cSCC中EGFR表達情況高度一致，符合Cet靶向治療的基本條件，為后續實驗的開展奠定了基礎。

抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡是Cet抗腫瘤的主要作用方式。在我們的研究中，MTT結果顯示隨著Cet濃度的提高，A-431細胞的生存率逐漸降低，200 μg/mL的Cet濃度處理48 h后，A-431的細胞生存率僅為38.65%(P＜0.01)。該結果充分表明，Cet單藥可對A-431細胞的增殖造成影響，且藥物對腫瘤細胞殺傷能力呈濃度依賴性。我們在應用流式細胞術分析Cet誘導A-431細胞凋亡的研究中發現，150 μg/mL的Cet濃度處理24 h后，有29.85%的A-431細胞凋亡，是對照組細胞凋亡率的2.86倍(P＜0.01)。這說明Cet單藥使用時，可通過影響細胞凋亡途徑相關通路，誘導A-431細胞凋亡，從而起到抗腫瘤作用。

綜上，我們證明了Cet對EGFR高表達的皮膚鱗狀細胞癌細胞A-431有較強的增殖抑制作用，并可誘導A-431細胞凋亡，有望成為晚期cSCC治療的新選擇。但Cet治療cSCC的具體作用機制仍需進一步探究，并且需臨床試驗進一步驗證其安全性和藥物療效。

作者貢獻殷祥燁：完成實驗，論文撰寫；姜偉乾、韓愚弟：論文修改；韓巖：論文的選題、審閱及修改。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：xiangyeyin301@163.com。