CD55蛋白在肺癌中的表達及臨床意義

金艷霞,張月洋,王 崢,黃安康,陳 穎,潘繼承,王衛東,龔永生

(1.湖北師范大學生命科學學院 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室特色野菜良種繁育與綜合利用湖北省工程技術研究中心 生物學國家級實驗教學示范中心,湖北 黃石 435002;2.蘇州市相城區漕湖人民醫院,江蘇 蘇州 215144;3.南京醫科大學附屬蘇州醫院,江蘇 蘇州 215008)

肺癌是起源于支氣管粘膜上皮的原發性惡性腫瘤,據最新全球癌癥數據顯示肺癌在因癌癥導致的死亡中占首位,比例高達20%[1].根據病理分類,約20%患者為小細胞癌(small cell lung cancer, SCLC),80%患者為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC);依據非小細胞肺癌組織亞型特點,又將其主要分為三類,即腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)、鱗癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC)和大細胞癌(large cell carcinoma, LCC)[2]。目前臨床上早期肺癌診斷的水平較低且發現晚、缺乏靈敏特異的早期診斷標志物,研究報道早診早治可將NSCLC患者五年生存率提高到80%以上[3]。目前,常用的肺癌早篩方法是低劑量計算機斷層掃描(low-dose computed tomography, LDCT),雖然將肺癌診斷率提高了20%,但其誤診率仍舊較高[4];肺癌常見的血清學早診標志物有癌胚抗原、鱗狀細胞癌抗原、細胞角蛋白片段19和神經元特異性烯醇化酶等,但它們對肺癌早期篩查敏感性較低[5]。目前研究較多的檢測方法有液體活檢,通常檢測釋放到血液中的循環腫瘤細胞、循環腫瘤DNA、外泌體、microRNAs、外周血循環RNA、腫瘤誘導的血小板和循環腫瘤血管內皮細胞等[6],但液體活檢缺乏標準化的檢測方法,還需要更充分的技術支持。因此,仍需篩選高靈敏高特異性的肺癌早期診斷標志物。

腫瘤發生時,免疫系統會對體內產生的腫瘤抗原進行防御而產生“特異性免疫球蛋白”即腫瘤相關自身抗體(autoantibodies,AABs),是腫瘤的早期預警信號,在預防醫學領域中發揮了積極作用[7]。例如,免疫檢查點分子淋巴細胞激活基因 3 (lymphocyte activation gene 3, LAG-3),T 細胞免疫球蛋白及粘蛋白結構域 3 (T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3, TIM-3)和 CD137 的聯合檢測有望提高NSCLC 的早期診斷準確性[8]。Ren等[9]采用酶聯免疫吸附法檢測7項自身抗體及腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1和NSE水平,發現聯合檢測能輔助NSCLC的早期診斷,在肺癌預防和早期篩查中發揮重要作用。在早期肺癌中與免疫相關的分子也發生了變化,Ye等[10]通過轉錄組測序從早期 NSCLC 的外周白細胞中篩選早期診斷標志物,發現酸性糖蛋白(alpha-acidglycoprotein, AGP)與轉化生長因子 β(transforming growth factor-β, TGF-β)聯合可能作為潛在的腫瘤標志物用于NSCLC的早期診斷。我們通過轉錄組數據挖掘發現,免疫分子CD59有可能作為肺癌生存判斷的指標[11]。

前期利用RNA-Seq檢測了早期 NSCLC 患者外周血中白細胞與健康受試者外周血白細胞中基因表達差異[11],由于中性粒細胞約占外周血白細胞數目的50%,本研究篩選了與中性粒細胞功能相關的CD55 糖蛋白,轉錄組數據顯示CD55表達水平在肺癌患者外周血白細胞中顯著下調,log2(肺癌組 FPKM/健康組 FPKM)值為-1.14 591[11]。本研究進一步利用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)預測了CD55蛋白的空間結構;用GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn)分析CD55在肺癌中的表達情況;用蛋白印跡檢測了肺癌患者血清樣本中CD55的表達;并用SPSS軟件(v26.0)進行ROC分析,探究CD55區分良惡腫瘤的效果、與臨床常見腫瘤標志物、患者生化指標的相關性;用TISIDB數據庫(http://cis.hku.hk/TISIDB/)分析CD55表達與腫瘤浸潤性免疫細胞的相關性、與肺腺癌和肺鱗癌患者生存、分期和分型的相關性,判斷CD55在肺癌中表達下降可能的原因;用Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)分析CD55表達與肺癌患者生存的相關性;最后用STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)分析與CD55互作的蛋白,旨在探究CD55作為腫瘤診斷和預后生存評價指標效果,為肺癌診斷和預后生存評價指標鑒定提供參考依據。

1 方法

1.1 樣本采集

本研究符合南京醫科大學倫理委員會制定的倫理學標準,受試對象完全基于自愿和知情同意原則,采集42例良性患者和48例NSCLC 患者的血液各2 mL以及臨床電子病例檢測指標,血液樣本經離心分離得到血清。受試患者通過 LDCT 和組織病理學分析確診,肺癌患者的分期判斷依據國際肺癌研究協會(International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)的第八版 TNM 分期系統。

1.2 蛋白印跡

用蛋白印跡檢測42例良性疾病患者和48例術前NSCLC患者的血清中CD55蛋白的表達水平,實驗方法和數據分析參考已發表的文獻[11]。CD55 抗體(Signalway Antibody,美國)按照1∶2 000稀釋。顯影條帶用 Vilber FUSION FX7 化學發光成像儀拍照獲得,用Image J 軟件進行蛋白條帶分析,用 GraphPad Prism 軟件(v8.0)對蛋白條帶定量數據進行統計分析。

1.3 SPSS軟件統計分析

CD55表達與肺癌患者生化指標相關性采用SPSS軟件進行分析,兩組間統計采用獨立樣本參數型t檢驗分析,數據呈現平均值±標準偏差。CD55表達與患者臨床檢測指標之間相關性分析用雙變量相關分析,pearson相關系數和雙尾顯著性檢驗。p<0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 CD55的蛋白結構

CD55的編碼序列來源于NCBI GeneBank (ID: 1604)和Uniprot 數據庫(https://www.uniprot.org/uniprot/P13987),編碼381個氨基酸,有一個N連接的GlcNAc修飾位點,C端有一個糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定位點[12],見圖1A所示。SWISS-MODEL同源模建發現CD55蛋白的3D結構與pdb為3iyp.1.E的模板序列同源性為99.74%,主要由α 螺旋和 β 折疊組成。Uniprot 數據庫也報道了 CD55 蛋白有 8 個二硫鍵,即位點 38與81、65與94、98與145、129與158、163與204、190與220、225與267和253與283 之間分別形成二硫鍵,3D結構和8個二硫鍵如圖1B 所示。

圖1 CD55的序列和3D結構A. CD55 基因序列。N-linked表示糖修飾位點,GPI-ancor amidated serine表示GPI錨定位點,下劃線表示信號肽和前導肽;B. CD55 蛋白的 3D 結構,圖中C代表半胱氨酸。

2.2 CD55在肺癌中的表達

運用 GEPIA 數據庫分析發現,CD55 在LUSC組織中表達水平顯著降低,在LUAD組織中表達水平無明顯差異(圖2A)。為了解血清水平CD55的表達情況,收集術前采樣的42例良性患者血清樣本和48例肺癌患者血清樣本進行了驗證,樣本基本信息見表1.蛋白印跡實驗結果表明CD55蛋白表達水平在良性樣本和肺癌樣本之間有顯著差異,在肺癌血清樣本中CD55表達顯著下降(圖2BC)。

圖2 CD55在肺癌中的表達A. 運用GEPIA 數據庫分析 CD55在肺腺癌和肺鱗癌組織中的mRNA表達水平。T,tumor,腫瘤組織;N,normal,正常組織;TPM,transcripts per million,每百萬個轉錄本。B.檢測肺癌患者血清中 CD55蛋白表達水平;C. 統計分析血清中CD55蛋白的表達情況。差異比較用非配對的t檢驗,**表示p值小于0.01.

癌癥的發生與免疫微環境和免疫細胞密切相關,大多數腫瘤浸潤性免疫細胞在腫瘤的發生發展中失衡[13]。因此推測CD55在肺癌中的異常表達可能與免疫相關。運用TISIDB數據庫分析在LUAD和LUSC中CD55的表達與腫瘤浸潤性免疫細胞的相關性,發現在LUAD中CD55表達水平與CD8+ T細胞呈負相關(r=-0.191,p=1.21×10-5),與NK細胞(r=-0.114,p=0.00 951)、巨噬細胞(r=-0.054,p=0.22)和中性粒細胞(r=0,p=0.092)無顯著相關性(圖3ABCD);在LUSC中CD55表達水平與NK細胞(r=0.235,p=1.18×10-7)、巨噬細胞(r=0.267,p=1.46×10-9)和中性粒細胞(r=0.371,p<2.2×10-16)呈顯著正相關(圖3EFGH)。然而,肺癌中CD55的表達水平與腫瘤浸潤性免疫細胞之間的具體關系還需實驗進一步驗證。

圖3 LUAD和LUSC中CD55表達與腫瘤浸潤性免疫細胞的相關性ABCD.在LUAD中CD55表達與腫瘤浸潤性免疫細胞的相關性,采用spearman相關系數進行相關分析。A,CD8+T細胞;B,NK細胞;C,巨噬細胞;D,中性粒細胞。EFGH. 在LUSC中CD55表達與腫瘤浸潤性免疫細胞的相關性,采用spearman相關系數進行相關分析。E,CD8+T細胞;F,NK 細胞;G,巨噬細胞;H,中性粒細胞。

2.3 CD55表達與患者臨床檢測指標之間的關系

ROC曲線分析發現,相比其他臨床腫瘤標志物,CD55可以有效區分良惡腫瘤,AUC值為0.744,靈敏度為80.0%,特異性76.9%(圖4A和表2)。進一步分析CD55表達水平與患者腫瘤標志物的相關性發現,CD55表達與AFP、CA724和GP73顯著相關(圖4BCD,表2)。此外,通過雙變量相關也分析了CD55表達與肺癌患者(n=48)臨床生化指標之間的相關性,發現CD55表達水平與患者年齡、紅細胞分布寬度標準差、凝血酶原時間、國際標準化比值和凝血酶時間顯著相關(圖5)。

表2 CD55表達與臨床患者血清腫瘤標志物之間的相關性

圖4 ROC曲線分析和CD55表達與腫瘤標志物的相關性分析A. ROC分析。BCD.運用SPSS軟件進行雙變量相關分析;p<0.05為有統計意義。AFP,alphafetoprotein,甲胎蛋白;CA724,carbohydrate antigen 724,糖類抗原724;GP73,Golgi protein 73,高爾基蛋白73.

圖5 CD55表達與肺癌患者臨床檢測指標之間的相關性分析運用SPSS軟件進行雙變量相關分析, p<0.05為有統計意義。注:Age,年齡;RDWSD,red cell volume distribution width,紅細胞分布寬度標準差;PT,prothrombin time,凝血酶原時間;INR,international normalized ratio,國際標準化比值;TT,thrombin time,凝血酶原時間。

2.4 CD55表達水平與肺癌患者生存的相關性分析

利用Kaplan-Meier Plotter 數據庫分析CD55表達水平與肺癌患者生存的相關性,發現CD55 高表達的早期肺癌患者(n=298),其生存時間為136.33個月,CD55低表達的肺癌患者(n=279),其生存時間為62.3個月(圖6A);在整個肺癌時期CD55高表達的患者(n=1 265),其生存時間為103個月,CD55低表達的患者(n=660),其生存時間為52.97個月(圖6B),這一結果表明 CD55 有潛力作為肺癌患者預后生存的評價指標。進一步用TISIDB 分析CD55 mRNA表達水平在LUAD和LUSC中與腫瘤、生存、分期、免疫亞型與分子亞型之間的關系,發現CD55表達與LUAD和LUSC患者的生存和分期無顯著相關性(圖6CDEF);與LUAD和LUSC患者的免疫亞型有顯著相關性(圖6GH);與肺鱗癌患者的分子亞型也有顯著相關性(圖6I)。

圖6 CD55 表達與肺癌患者生存、分期和分型之間的相關性A. 早期肺癌中CD55表達水平與肺癌患者生存的相關性分析;B. 在整個肺癌時期,CD55表達水平與肺癌患者生存的相關性分析;C.CD55表達與LUAD患者生存之間的相關性分析;D.CD55表達與LUSC患者生存之間的相關性分析;E. CD55表達與LUAD分期的關系;F. CD55表達與LUSC分期的關系;G.LUAD中CD55表達與免疫亞型之間的關系;H.LUSC中CD55表達與免疫亞型之間的關系;I.LUSC中CD55表達與分子亞型之間的關系。CPM,counts per million,每百萬計數;C1,wound healing,創傷愈合;C2,IFN-gamma,γ-干擾素;C3,inflammatory,炎癥;C4,lymphocyte depleted,淋巴細胞缺失;C5,immunologically quiet,免疫靜息;C6,TGF-β,轉化生長因子-β.

2.5 CD55蛋白與其它蛋白之間的相互作用

STRING 數據庫分析與CD55可能有相互作用的蛋白,發現10 種蛋白與CD55 蛋白之間存在相互作用(圖7),即膜攻擊復合物抑制因子(membrane attack complex inhibitor, CD59)、粘附 G 蛋白偶聯受體(adhesion G protein-coupled receptors, CD97)、補體C2、補體C3、補體C4α鏈(C4A)和補體C4β鏈(C4B)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM1)、A 類磷脂酰肌醇聚糖(phosphatidylinositol glycan class A, PIGA)、粘附 G 蛋白偶聯受體 E2(adhesion G protein-coupled receptor E2, EMR2)。

圖7 分析與CD55蛋白相互作用的蛋白(在STRING數據中選擇物種:人)

3 討論

CD55是一種糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidy linositol, GPI)錨定的V型跨膜蛋白,由于存在不同的糖基化形式,其分子量分布在55 kDa到75 kDa不等,是膜結合性補體調節蛋白(membrane-bound complement regulatory proteins, mCPRs)的重要成員,在血液和多種組織中表達[14]。CD55可防止細胞發生補體介導的細胞毒性[15],其能增強補體激活,發生級聯酶促反應[16],增加中性粒細胞、單核細胞和 T 細胞的募集[17]。CD55主要功能是通過解離 C3 和 C5 轉化酶來抑制補體介導的裂解,其在腫瘤細胞上的過表達可以起到保護作用,避免腫瘤細胞被補體裂解;還可以阻止抗原呈遞細胞對腫瘤細胞的吞噬[18]。有研究也發現在 NSCLC 組織中CD55 的轉錄水平下調,并通過唾液酸化加工成其它生物大分子,這使得其成為 NSCLC 的潛在標志物[19]。

本研究基于前期轉錄組數據鑒定發現的CD55在肺癌外周血白細胞中表達下調[11],運用COSMIC數據庫分析了CD55在肺癌中的突變情況,發現0.58%的病例表現出點突變,1.6%的病例表現出拷貝數變異(數據來源:https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic),基因突變也許是CD55在肺癌中異常表達的原因之一。生物信息學數據庫分析和實驗驗證發現,相比健康樣本,CD55在肺鱗癌組織中下降,在肺腺癌組織中表達水平無顯著差異。蛋白印跡實驗結果表明 CD55 在NSCLC 患者血清中蛋白表達水平相比良性患者血清樣本顯著下降;TISIDB數據庫分析發現CD55的表達在肺腺癌和肺鱗癌中與浸潤的相關免疫細胞不同,CD55在肺腺癌中表達水平與腫瘤浸潤性CD8+ T細胞呈負相關,與NK細胞、巨噬細胞和中性粒細胞無顯著相關性;在肺鱗癌中其表達與NK細胞、巨噬細胞和中性粒細胞均呈顯著正相關(圖3),可能其表達水平也受到免疫細胞不同程度的調控。研究報道CD55蛋白在鱗癌和腺癌中的表達不同的原因可能是腺癌細胞抑制補體介導的細胞損傷的水平表達導致其在組織中表達下降的趨勢不如鱗癌[20]。

良惡腫瘤的區分一直是肺癌診斷的難題,本研究發現CD55區分肺部良惡腫瘤效果比現有臨床腫瘤標志物更好,而且CD55表達水平與腫瘤標志物AFP、CA724和GP73顯著相關(圖4)。Zhang等[21]研究表明GP73在肺癌患者的血清中高表達;韓等[22]通過統計分析表明GP73可以作為肺腺癌和鱗癌鑒別診斷的標志物。而且,CD55表達與肺癌患者臨床生化指標中凝血因子具有顯著相關性(圖5)。大量證據表明肺癌與高凝狀態有關,癌細胞可表達促凝血因子,激活凝血級聯反應;分泌腫瘤壞死因子α等可溶性介質或與宿主血管和血細胞直接接觸,刺激促凝血因子的表達[23]。補體蛋白過度激活也可加強高炎癥和高凝途徑,并導致組織損傷和器官衰竭[24]。因此,本研究為CD55可能作為潛在的肺癌診斷標志物提供了依據,也為CD55參與肺癌發生機制探究提供了參考。

本研究分析發現CD55表達與肺癌生存相關,低表達CD55的肺癌患者生存期更短,推測是因為 CD55 抑制自然殺傷(natural killer cells, NK cells) 細胞的細胞毒性,CD55 高表達有利于 NK 細胞的激活,當其低表達時,NK 細胞功能失衡不能及時發生效應,可能引起腫瘤細胞發生免疫逃逸,導致腫瘤惡性發展,患者的生存時間更短[12]。實驗還發現CD55表達與LUAD和LUSC患者的免疫亞型有顯著相關性,與肺鱗癌的分子亞型也有顯著相關性(圖 6)。

STRING分析發現與CD55相互作用的蛋白大多參與免疫調控,如補體CD59蛋白。Li等[25]發現NSCLC中CD59 表達增加導致 caspase-3 和 Fas 表達減少、Bcl-2 表達增加,從而影響肺癌的發生發展。CD97 是 G 蛋白偶聯受體家族的成員,通過與其配體 CD55 相互作用在血管生成、腫瘤分化中發揮作用[26],且在腫瘤發生發展中可刺激影響腫瘤侵襲性并表現出粘附特性[27]。EMR2在單核細胞/巨噬細胞高度表達,并與中性粒細胞遷移和活化有關,可促進粒細胞趨化、脫粒和粘附,在巨噬細胞中能促進炎性細胞因子的釋放[28]。炎癥因子ICAM1對于中性粒細胞粘附和跨內皮遷移至關重要[29]。CD55作為補體激活調節因子中的一員,針對免疫分子的腫瘤靶向治療也備受關注,Dho等[30]開發了一種新型嵌合抗 CD55 特異性單克隆抗體并證明了其在胸膜轉移性肺癌中具有抗腫瘤功效。Zhang等[31]構建了一種攜帶兩個治療基因的溶瘤腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD可以有效抑制肺癌生長,是潛在的肺癌治療方法。這些研究表明CD55可能參與肺癌的發生,有望作為肺癌治療的靶點。

綜上所述,本研究檢測了CD55在肺癌中的表達,以及區分良惡腫瘤的效果,探究了CD55表達水平與患者腫瘤標志物和生化指標的相關性、與肺癌分期、分型、患者生存的相關性,表明CD55 有潛力作為肺癌診斷和預后生存的腫瘤標志物。