兩株麥冬內生細菌的鑒定及生物學特性研究

沈瑜琦,陳 帥,李維波,牛 然,邵登科,張春源,賴澤成,葉文雨

(1.國家菌草工程技術研究中心,福建 福州 350002;2.植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室,福建農林大學生命科學學院,福建 福州 350002;3.福建農林大學植物保護學院,福建 福州 350002)

麥冬(Ophiopogonjaponicus)是一種常綠草本,是中醫處方中的常見藥材。麥冬的野生資源較為豐富,且由于市場需求量較大,人工種植面積在不斷地擴大中。藥用麥冬種植范圍相當廣泛,主產于浙江、四川等地[1-2]。麥冬大都生長于海拔2 000 m以下的山坡較為陰暗潮濕處、靠近水源處或林下[3]。因藥用麥冬具有一定的醫療價值,所以其內生菌產生的抗藥活性可能高于普通植物[4],具有較高的研究價值。麥冬味甘、微苦性微寒,其入藥部位主要為果實和小塊根,具有調節心律、調節體內微循環、滋陰潤肺等功效[5]。

內生菌指能于植物各組織內正常生長,但不引起該植物產生病征的一類微生物[6]。一些內生細菌為提高宿主對環境的適應能力,利用自身擁有某些機制來實現此目的[7]。研究顯示,許多藥用植物的有效成分受到內生菌的影響[8-12]。從植物組織器官中分離出來的內生菌,經過篩選后,部分能產生與植物相似或相同的有效成分,通過培養這些藥用植物內生菌可以突破藥用植物本身生長的限制[13],對藥材的品質和質量都能有進一步的改善。

本研究以麥冬為材料,分離和純化得到其內生細菌,通過形態學觀察和分子生物學方法鑒定所得菌株,進一步研究菌株的生理生化特性,以期為藥用植物內生細菌的功能菌株的篩選和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源

本試驗所用麥冬植株采自福建省三明市福建盤古中藥材有限公司,采集樣品為健康生長的植株,采樣方法為五點采樣法,采集后放置于4 ℃冰箱備用。

圖1 麥冬采樣圖Fig.1 Ophiopogon japonicus sampling illustration

1.1.2 培養基配方

LB固體培養基,LB液體培養基,淀粉牛肉膏蛋白胨培養基,葡萄糖蛋白胨培養基,均采用《微生物學實驗技術》中的配制方法[14]。

1.1.3 PCR引物

本試驗所用PCR引物購自北京擎科生物科技股份有限公司,細菌通用引物27F為擴增麥冬內生細菌16S rDNA片段序列的上游引物,1492R為下游引物(表1)。

表1 PCR引物Table.1 PCR primer

表2 PCR反應體系Table.2 PCR reaction system

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離與純化

將新鮮的麥冬葉片用清水沖洗直至表面無泥沙塵土附著,用濾紙吸干麥冬葉片表面水分。將麥冬葉片浸泡于75%乙醇中5 min后用無菌水沖洗3遍及以上,用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min,后用蒸餾水沖洗5～7遍。將表面消毒好的麥冬葉片在研缽內充分研磨,取葉片組織研磨液適量涂布至LB培養基上,28 ℃恒溫培養12 h,待培養基平板內細菌長出后,依據培養基平板內各菌落的形態、顏色、大小等外觀差異,挑取外觀不同的單菌落進行3 次平板劃線,經過純化后對菌株進行編號保存。

1.2.2 菌株的形態特征

將LB固體培養基倒平板后,劃線,放置于37 ℃培養24 h,觀察菌落形態特征。

1.2.3 分子鑒定

挑單菌落進行菌株的活化,利用上述表1引物,以菌液為模板利用16S rRNA基因序列進行PCR擴增。

25 μL反應體系如下:

PCR反應條件:

94 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,共設35 個循環;72 ℃延伸 7 min 。PCR產物通過北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。將所得序列在NCBI網站上進行BLAST序列對比,使用Mega 11軟件采用鄰近法構建系統發育樹,確定細菌種屬。

1.2.4 過氧化氫酶試驗

挑取預先培養在LB固體培養基上細菌的單菌落,將其輕輕涂抹在干凈的載玻片上,一個載玻片上涂上下兩處,相互之間留出一定間距,將其中一組設置為對照組。滴加3%過氧化氫溶液3 mL,觀察反應現象。

1.2.5 淀粉水解試驗

將含淀粉的牛肉膏蛋白胨固體培養基滅菌后融化并冷卻至50～60 ℃,而后在超凈臺中倒板,靜置,按無菌操作法將接種針燒紅3遍,冷卻。將預先培養好的生長在固體培養基上的菌落中挑取單菌落至平板,每個菌株接種兩板,一板為對照,每板接種三個單菌落,等距排布,做好標記,在28 ℃培養箱中培養1 d。待形成菌落后,在平板上滴加碘液4～5滴,可輕微旋轉使碘液鋪滿全皿,觀察結果,并拍照。

1.2.6 甲基紅試驗

取滅菌后的葡萄糖蛋白胨培養液分裝至已提前滅過菌的干燥試管中,每管5 mL,將已培養好的菌株挑取單菌落至試管中,做好標記,于37 ℃搖床內培養1 d。在培養好的裝有菌液的試管內滴加各甲基紅試劑3～4滴,充分搖勻,觀察結果。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態學鑒定

MD1 菌落邊緣較為整齊,淡黃色,表面光滑,不透明,單菌落小而凸起,圓形,較為粘稠濕潤,易被挑起(圖2A)。

圖2 細菌菌落的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of bacterial colonies

MD2菌落邊緣也較為整齊,白色,表面光滑,不透明,單菌落小而凸起,圓形,較為粘稠濕潤,易被挑起(圖2B)。

2.2 菌株的分子鑒定

將兩株菌株DNA擴增后得到PCR產物,結果得到大小在1 500 bp 左右的片段。

將測序結果在NCBI網站上進行BLAST序列比對,利用Mega 11軟件構建系統發育樹的結果顯示,菌株MD1與路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)聚在同一分支,相似性達到100%,可初步判斷該MD1菌株為路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)(圖3A);菌株MD2與節桿菌(Arthrobacterwoluwensis)聚在同一分支,相似性達到98%,可初步判斷該MD2菌株為節桿菌(Arthrobacterwoluwensis)(圖3B)。

圖3 基于16S rRNA序列構建MD1、MD2的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree construction of MD1 and MD2 based on 16SrRNA sequences

2.3 菌株的生理生化特性鑒定

2.3.1 淀粉酶水解試驗

將 MD1、MD2 菌株分別點種于淀粉水解培養基上培養,一個皿等距點種三個。結果表明,兩株菌株都產生了水解圈,在淀粉水解酶試驗中均為陽性,兩菌株都能產生胞外淀粉酶。淀粉遇碘變藍色,若菌株周圍出現透明的水解圈,則說明該菌株無法直接利用大分子的淀粉,需要分泌胞外淀粉酶來分解淀粉為葡萄糖或麥芽糖,再被細菌吸收利用,這就使得碘液無法與淀粉反應變藍,從而產生透明的水解圈(圖4A)。

圖4 菌株MD1和MD2的部分生理生化特性Fig.4 Selected physiological and biochemical properties of strains MD1 and MD2

2.3.2 甲基紅試驗

菌株MD1、MD2在甲基紅試驗中,MD1顏色為紅色,結果為陽性,MD2顏色呈黃色,結果為陰性。MD1菌株使甲基紅試液變紅,說明該菌株分解葡萄糖產生丙酮酸后,可以使丙酮酸分解產生大量酸性物質,溶液pH降低,甲基紅指示劑遇酸變紅;而MD2 菌株所在的試驗組,試液為黃色,說明該菌株產生丙酮酸后很快將丙酮酸脫羧成醇等物質,溶液pH仍在6.2以上,甲基紅指示劑呈黃色(圖4B)。

2.3.3 過氧化氫酶試驗

菌株 MD1、MD2在過氧化氫酶試驗中,MD1、MD2菌株肉眼都能觀察到產生大量氣泡,為陽性。在該試驗中,兩組試驗組肉眼能夠觀察到大量氣泡,說明該菌株含有過氧化氫酶,過氧化氫酶是一類含有鐵的蛋白,能夠催化過氧化氫產生大量氧氣,在此過程中起到傳遞電子的作用。(圖4C)。

3 結論與討論

本試驗從麥冬葉片中分離了兩株內生細菌,編號為MD1和MD2,經過形態觀察、分子生物學鑒定以及生理生化試驗,最終確定MD1菌株是路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii),淀粉水解試驗、甲基紅試驗和過氧化氫酶試驗均為陽性;MD2菌株是節桿菌(Arthrobacterwoluwensis),淀粉水解試驗和過氧化氫酶試驗均為陽性,而甲基紅試驗為陰性。本結果為麥冬內生細菌的功能菌株的篩選和多樣性研究提供理論基礎。

植物內生菌的發現歷史可以回溯到100 多年前,因其自身特性而不被人們重視,一直到二十世紀三十年代,牲畜中毒后,研究發現因為食用感染內生菌的牧草,才真正引起人們重視。近20 年來,內生細菌受到了廣大學者的高度關注[15-17]。研究發現,它們與植物的關系有三種:一是中性,對植物生長無影響;二是有益,能促進植物生長或者抑制病原物侵染;三是有害,在一定條件下能引起植物病害[18,19]。

植物內生細菌通過與寄主植物的相互影響,相互促進,協同生長,是一種寶貴的資源[20],因而在植物體內分離出的內生菌可能在其他領域發揮作用,如植物病蟲害的防治,促進植物生長[21]。從藥用植物分離發現的內生菌的次生代謝產物很可能是抗癌、抗炎等新型活化物質的來源[22],但內生菌的分離受到時間空間等條件上的限制[23],在操作時需選擇最佳條件進行研究。

Hoffmann等[24]于2002年首次發現路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)并報道。近年對該細菌在其他領域的報道漸漸增加,路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)除一開始在人類病原菌中發現外,在發酵蔬菜、植物根際土、根結節和石油管道的微生物群落等地都有分離得到[25]。其作用亦具有多樣性,如產胞外多糖[26]、生物控制能力以及烴降解能力[27]等。但目前國內對路德維希腸桿菌的研究較少,主要集中于該菌在特定環境污染的修復[28]。在植物促生方面,路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)被發現在海雀稗、番茄和達烏里胡枝子中均能促進植物根系生長,其中在達烏里胡枝子體內分離出的菌株能夠促進植物有更好的耐鹽堿特性[29],因而在后續研究中,可以增加對該菌株其他方向的研究。

節桿菌是水體和土壤中的優勢細菌,近年來對其在環境污染物降解的研究較多[30,31],例如節桿菌屬細菌能夠降解多環芳烴、N-雜環化合物等環境有機污染物。關于其固氮能力和對植物的促生能力也在進一步研究中[32]。節桿菌大都為非致病性菌株,因而對其致病機理的研究較少,但由于分布的廣泛性,可能存在的致病性、治病機理和耐藥性都應引起重視[33]。此外,節桿菌因分布廣泛,能在多種環境下生存,對其進行多基因組水平的解析,能夠從另一個角度了解其在環境污染改善方面的潛力[34]。因此,可以利用節桿菌對土壤的修復作用制作生物肥料。