基于質量編碼探針的質譜多聯檢測研究進展

殷 豪，王 偉，閔乾昊

（南京大學生命分析化學國家重點實驗室，南京 210023）

自然界中各類復雜的生命活動往往受到生物體內多種生物分子的共同調控。例如，在轉錄水平上多種RNA共同調控基因的表達[1]，在翻譯后修飾水平上多種酶共同調控蛋白的動態修飾[2]。在外界環境發生改變時，這些生物分子在體內的豐度與活性也會隨之改變。因此，針對復雜生物體系中多種生物分子的同時檢測對了解靶標環境的病理生理狀況有著重要的意義。多種生物分子的同時檢測需要一種能產生多通道信號的分析方法。傳統的熒光、拉曼等技術存在譜帶串擾問題，因此在多目標物檢測上應用受限[3]。質譜方法用待測物的質荷比來指示其目標物的存在，可以將大量的離子信號呈現于同一張譜圖中，在生物靶標的多聯檢測上具有獨特的技術優勢。然而，生物大分子自身的電離效率較差，且在真實生物體系中濃度很低，往往無法實現質譜的直接檢測[4-5]。

本世紀初，清華大學張新榮教授首次開發了基于鑭系金屬元素質量標簽的質譜分析方法，為復雜生物體系中生物大分子的多重標記分析提供了一條新策略[6]。此后，質量標簽標記技術在生物分子的定性定量檢測[7]、藥物篩選[8]和多組學分析[9]等方面得到了進一步的應用。近年來，研究者們通過設計質量編碼探針，利用易于電離的質量標簽來反映目標物的存在、活性與空間分布（圖1）。質量編碼探針是將質量標簽和識別元件一體化的探針系統，通過探針的識別作用對目標物進行特異性標記與響應，將靶標分子的存在、活性等信息轉換成質量標簽的離子信號，最終實現多重目標生物分子的高靈敏同步檢測?；谫|量編碼探針的質譜分析策略不僅為生理病理條件下復雜生命活動的多參數分析提供了思路，也為藥物靶點篩選和臨床醫學診斷開辟了新的途徑。

Figure1 Schematic illustration of mass-encoded probes for multiplex mass spectrometric detection

本文將系統介紹質量編碼探針的結構特點以及基于此開發出的各種質譜定性定量分析方法，并詳細闡述其在復雜體系生物分子多聯檢測與分析中的最新應用。

1 質量編碼探針的結構組成

為了在復雜樣本中實現對多種生物標志物的同時分析，質量編碼探針需要將目標物信號轉換成可供質譜識別的質量標簽信號，從而在質譜層面實現多種標簽信號的同時輸出。質量編碼探針通常包含質量標簽、識別元件和納米載體3 個部分，這些組成部分分別承擔著信號輸出、目標物識別和轉換以及功能元件承載的功能。質量標簽與識別元件作為質量編碼探針的核心組分，分別承載著信號輸出與目標物識別的重要功能。研究者通常采用直接化學偶聯或基于納米材料介質的共組裝方法實現質量標簽與識別元件的整合。鑒于納米結構的可設計性，近年來基于納米層級結構理性設計和表面改性的質量編碼探針已成為生物分子多聯檢測的重要探針工具。

1.1 質量標簽

質量標簽是一系列易于電離的分子或離子，可輸出其特征質荷比信息。通過對待測靶標進行質量編碼，依據其特征離子信號強度即可對靶標分子的濃度或活性進行定量分析。目前，金屬元素[10-11]、有機小分子[12-13]、聚合物[14]、核酸[15-16]、多肽[17]等都可以作為質量標簽用于待測靶標標記。

金屬同位素因其在自然界極低的豐度和相對較強的穩定性而不易受到內源性物質的干擾，被認為是一種優異的質量標簽[18]。常見的金屬同位素標簽有鑭系元素、過渡金屬元素和貴金屬元素。通過匹配電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析技術，金屬同位素質量標簽展現出極高的靈敏度和信噪比，被廣泛用于生物標志物的多重標記。此外，有機小分子和寡聚物由于其優異的電離能力而常被用作質量標簽修飾在納米載體表面，在進行特異性標記的同時可實現信號放大。為了實現多重檢測，研究者通常會設計一系列具有類似結構的小分子或聚合物來構建質量標簽庫。例如，劉虎威、白玉課題組設計合成了一組羅丹明衍生物的質量標簽，這些質量標簽在質譜檢測時會發生兩步裂解，利用解離后的羅丹明衍生物離子信號實現多重標記[19]。此外，核酸、多肽等生物分子也可用作質量標簽。核酸、多肽經過鏈置換或水解反應后，釋放出特定的標簽序列，利用不同質荷比離子信號實現多重目標物的特異性標記與分析。

1.2 識別元件

許多生物識別元件，如核酸[20-21]、多肽[22]、抗體[23]等，可作為質量編碼探針中的識別模塊來實現待測靶標的特異性識別，進而將靶標的識別事件轉化為質量編碼探針的組裝、解體或變構行為，最終通過質量標簽信號的變化對不同靶標進行特異性響應。

作為一種具有特定序列的分子，核酸可以依靠Watson-Crick 堿基配對來對核酸靶標進行識別。而對于非核酸靶標，人工體外篩選獲得的核酸適配體可以以較高的親和力與之結合，從而實現探針的觸發響應。林金明課題組提出了基于核酸適配體的細菌捕獲策略，結合滾環擴增的信號放大方法，實現了食物中病原體的高效捕獲和基于基質輔助激光解吸電離質譜（MALDI-MS）的高靈敏檢測[16]。在Caspase 家族[24]和基質金屬蛋白酶（MMP）家族[25]等特定蛋白酶的作用下，連接探針不同模塊的底物多肽可以發生水解斷裂，導致探針負載質量標簽數目發生變化，進而引發質譜響應信號的改變。此外，抗體作為一種具有特異性識別功能的蛋白，也可用于質量編碼探針的構建。將固定在界面上的一抗作為目標物捕獲抓手，以連接有信號放大模塊的二抗作為標記探針，最終形成免疫夾心結構用于臨床生化分析[26]。例如，Zhong 等[27]將抗人IgE 抗體修飾在磁珠表面用于人IgE 抗體的預捕獲，并借助質量標簽和抗原共修飾的金納米粒子（AuNPs）對人IgE 抗體進行特異性標記，實現了多種抗體的同時檢測。

1.3 納米載體

為了將質量標簽和識別元件進行有效組合，研究者們通常利用化學偶聯的方式將二者進行直接偶聯，或借助納米材料作為載體實現質量標簽與識別元件的共同負載。質量標簽和識別元件在納米載體表面以特定的層級關系進行組裝排布，最終形成具有識別標記和信號放大能力的探針工具。

在探針的構筑上，良好的生物相容性和穩定性賦予了AuNPs 廣闊的應用空間。例如，王建華課題組利用AuNPs 作為載體負載修飾有稀土元素質量標簽的DNA 雙鏈，實現對外泌體上多種蛋白標志物的直接標記[28]；劉虎威、白玉課題組將凝集素和有機小分子質量標簽共修飾在AuNPs 上，同時賦予了納米載體生物識別和信號輸出的功能[29]。此外，磁性納米粒子的引入有助于反應后探針系統的分離和收集。呂弋課題組使用夾心法構建了基于鑭系元素標簽的磁性納米探針，他們利用磁性納米粒子分離去除未與靶標結合的元素標簽，從而實現多種腫瘤標志物的ICP-MS 定量分析[30]。此外，納米材料修飾基底也可以作為質量標簽與識別元件的承載介質。納米材料修飾基底通過其表面的識別元件捕獲待測靶標，進一步結合具有特異性識別能力的質量標簽，實現靶標一對一的標記。其中，典型的基底材料主要包括金基底[31]、玻璃基底[32]和紙基底[12]。例如，吳坤明課題組利用抗體修飾的玻璃基底實現目標蛋白的預捕獲，借助抗體修飾的AuNPs 和銀納米粒子（AgNPs）分別對捕獲的蛋白進行標記，最終通過激光電離質譜（LI-MS）對AuNPs 和AgNPs 的分析反映目標蛋白的定量信息。

2 基于質量標簽多元標記策略的質譜分析方法

2.1 MALDI-MS

MALDI-MS 是一種利用激光脈沖能量使待測物電離的質譜分析手段。該方法可以用于有機小分子、核酸、多肽等質量標簽的解吸電離，在基于質量編碼探針的質譜多聯檢測與分析上具有廣泛的應用。

小分子寡聚物具有較高的激光解吸電離效率，因此可作為質量標簽用于MALDI-MS 分析。Rotello 課題組制備了不同聚乙二醇烷基硫醇修飾的AuNPs，并驗證了其在MALDI-MS 中的電離能力[33]。隨后，通過在AuNPs上共修飾烷基聚乙二醇質量標簽和各種識別元件，進一步將其應用于對各類生物標志物的標記。劉虎威、白玉課題組在AuNPs上修飾烷基聚乙二醇質量標簽和凝集素，實現了對多種聚糖的原位標記與MALDI-MS 分析[29]。此外，本課題組將共修飾有烷基聚乙二醇質量標簽和發夾DNA 的AuNPs 作為納米標簽，利用目標RNA 介導的放大策略實現了4 種RNA 的MALDIMS同步定量檢測[14]。

由于MALDI-MS 以高能激光作為解吸電離的能量來源，研究者在質量標簽的設計時可以引入光裂解基團。納米載體上的光裂解標簽分子在激光的誘導下發生化學鍵的斷裂，通過質量標簽片段的釋放實現待測物分析。聶宗秀課題組設計了一種光裂解探針用于細胞表面聚糖的標記[34]。探針由質量標簽和凝集素兩部分構成，兩部分之間通過C--S 鍵連接。在該策略中，利用355 nm 激光照射下C--S 鍵發生斷裂釋放出的質量標簽片段，最終實現細胞表面聚糖的質譜分析。除此以外，雙鏈DNA 之間存在的氫鍵在MALDI-MS 的激光誘導下也會發生斷裂。利用這一性質，林金明課題組開發了DNA 介導的細胞表面工程化探針，該探針利用凝集素對目標糖型進行標記[35]。凝集素上修飾的引物在滾環擴增下產生具有重復序列的長鏈DNA，進一步與DNA 質量標簽進行互補配對。形成的DNA 雙鏈在激光照射下會發生氫鍵斷裂，短鏈DNA 片段在MALDI-MS 中較易發生電離，最終實現目標糖型的放大檢測（圖2-A）。

作為一種軟電離源，MALDI-MS 在對核酸、多肽等生物大分子的檢測中有獨特的優勢。除了上述利用DNA 作為質量標簽的檢測方法，鞠熀先課題組構建了多肽編碼的靶板，以蛋白酶切割產生的報告肽段作為質量標簽用于不同蛋白酶活性的評估[36]。為了對酶的活性進行可視化分析，該課題組進一步開發了基于陣列的細胞凋亡蛋白酶活性圖譜芯片（Casp-PC），利用MALDI-MS 成像對報告肽段的釋放量進行分析[37]。在此基礎上，該課題組還借助氟親和作用將底物多肽修飾在ITO玻璃上，并利用上述策略對兩種蛋白酶的活性進行定量檢測和可視化分析[17]。

2.2 ESI-MS

與MALDI-MS 類似，電噴霧電離質譜（ESIMS）是一種廣泛應用于小分子和生物大分子分析的軟電離質譜技術，適用于不同類型質量標簽分子的質譜解析。

陳蕓課題組構建了一種光裂解的DNA-PL-多肽探針，其中靶標microRNA 作為橋梁將探針與瓊脂糖納米粒子偶聯。他們利用ESI-MS檢測光裂解探針中被釋放的報告肽段，借助高效液相色譜（HPLC）定量報告肽段的總量，用于指示總RNA 中目標microRNA 的含量[38]。與之類似，為了對循環腫瘤DNA（ctDNA）中的單核苷酸變體（SNV）進行準確定量，該課題組開發了質量標記連接酶鏈式反應（LCR）探針組[39]。該策略通過連接酶鏈式反應進行信號放大，并使用瓊脂糖珠分離擴增的產物，在光誘導下釋放出可被ESI-MS 檢測的報告肽段。以上工作均利用ESI-MS對多肽質量標簽進行精確鑒定，結合HPLC 實現了定量分析。此外，基于串聯質量標簽（TMT）的定量蛋白質組學通常也會使用HPLC 進行復雜樣品分離，再結合ESI-MS/MS來對目標蛋白質組進行定量。Tate課題組應用點擊化學將化學標記的蛋白質與多功能捕獲試劑偶聯，經過純化富集后借助ESI-MS/MS對多個細胞系中的蛋白質修飾進行定量分析[40]。

近年來，常壓質譜技術迅猛發展，由于無需對樣品進行特殊處理，可以實現復雜樣品的快速在線檢測。在ESI源的基礎上，許多新型電離技術被報道并用于生物分子的多聯檢測。劉虎威、白玉課題組開發了陣列式電噴霧加速芯片噴霧電離（eCSI）裝置，并結合羅丹明衍生物質量標簽提出了常壓質譜（AMS）免疫分析平臺（圖2-B）[19]。在電噴霧的作用下，連接質量標簽和納米載體的Au-S 鍵發生第一步斷裂。第二步斷裂由離子源內碰撞誘導的解離（CID）產生，由此釋放出質量標簽并產生特征離子信號。該課題組還進一步將AMS免疫分析平臺進行改進后構建了紙基電噴霧電離（PS-ESI）裝置，用于血清的快速直接分析[12]。最近，該研究團隊還開發了基于納米電噴霧電離質譜（nanoESIMS）的多維有機質譜流式系統，利用nanoESI 源將細胞表面的質量標簽電離，通過輸出單個細胞表面的分子信息實現單個細胞的分型[41]。

2.3 ICP-MS

ICP-MS因其極高的靈敏度在基于質量標簽的質譜多聯檢測中被廣泛應用。ICP-MS可以對金屬元素進行高靈敏響應，因此在基于元素標簽的質量編碼探針中具有獨特的技術優勢。

ICP-MS對稀土元素的檢測有著極高的靈敏度和較寬的線性范圍，因此稀土元素的使用在元素

質譜流式技術可以在更高維度輸出細胞表面分子信息，已成為質量標簽技術在生命分析領域的重要研究范式。與傳統熒光流式不同，質譜流式技術以金屬元素作為標簽，以ICP-MS 作為檢測器，可以對單細胞多參數分析。新型質譜流式標記方法的開發可以提高標記的效率，更全面地揭示細胞所處的生理病理狀態。Gonzalez 等[50]開發了一種基于熒光-質量雜交標簽的納米追蹤器，應用于長時間的活細胞標記。這種納米追蹤器可以實現熒光流式和質譜流式雙模態信號輸出，兼顧了熒光標簽在微觀上的靈敏度和質量標簽在宏觀上的準確性。質譜流式技術以極高的通量呈現細胞表面或細胞內部蛋白的表達水平，為展現細胞標記中占主體地位[42]。通過在探針上修飾多種稀土元素標簽，可以實現多個目標物的高靈敏定量檢測。例如，王秋泉課題組利用修飾有鑭系元素標簽的短鏈DNA 與滾環擴增產生的長鏈DNA 配對，實現了基于ICP-MS 的多種DNA 同時檢測[43]。呂弋課題組使用可螯合鑭系元素標簽的底物DNA鏈，并結合DNA 酶步行器的信號放大實現了對多種microRNA 的高靈敏測定[44]。胡斌課題組借助多組分核酸酶對修飾有元素標簽的底物DNA 的特異性切割，實現了多種microRNA 的ICP-MS 同時檢測[45]。該課題組后續還結合鑭系元素標記策略和熵驅動的催化擴增，實現了基于ICP-MS 的多種RNA 定量分析[46]。除了在DNA 末端修飾元素標簽，抗體與鑭系元素標簽的偶聯也為多種蛋白質的免疫分析提供了標簽工具。商業化的金屬螯合聚合物（MCP）使用螯合試劑，如DOTA[47]和DTPA[48]等，借助氮原子和羧基與三價陽離子形成的穩定配合物將鑭系元素偶聯在聚合物上，并利用聚合物與抗體的共價連接構建基于元素標簽的質量標記試劑。相比于只含有單個鑭系原子的鑭系金屬標簽，這種金屬螯合聚合物可以同時螯合多個金屬原子，提高了鑭系元素標簽的原子載量，大大提高了基于ICP-MS方法的檢測靈敏度。為了承載更多數量的金屬原子，丁顯廷課題組開發了一種含Zr 同位素的納米金屬有機框架（Zr-NMOF），并在其表面進行抗體修飾（圖2-C）。該復合型的納米結構在細胞標記上擁有比傳統MCP 更高的靈敏度，從而拓展了ICP-MS在微量、痕量目標物分析上的應用[49]。的生命活動提供了高維度的分子信號。結合生物信息學的數據處理手段，研究者們可以實現海量數據挖掘，為疾病診療、藥效評價等方面提供數據支撐。Tislevoll 等[51]應用32 維質譜流式細胞術來研究急性髓系白血病患者化療后外周血樣本中的細胞信號轉導網絡。通過無監督和有監督的機器學習，作者發現細胞外信號調節激酶（ERK）1/2 的減少和p38 絲裂原活化蛋白激酶（MARK）的磷酸化是患者5年生存率的重要預測指標。

Figure2 Scheme of utilizing different mass spectrometric approaches to detect mass tags

2.4 其他質譜分析方法

除了上述3種最常用的質譜分析方法，飛行時間二次離子質譜（ToF-SIMS）、基質輔助激光解吸電離-免疫組化（MALDI-IHC）、免疫-解吸電噴霧電離（Immuno-DESI）等分析手段也被用于質量編碼探針的質譜檢測。張俊龍課題組通過代謝標記將帶有疊氮或炔基的分子引入細胞中的生物大分子，并利用點擊化學將稀土金屬標簽與其偶聯。通過采集鑭系元素豐富的重組碎片離子，成功實現了多種生物標志物的ToF-SIMS 成像[52]。Heeren課題組開發了6 種光切割質量標簽抗體（PC-MT），結合靶向和非靶向質譜成像，將MALDI-IHC 應用于深度空間蛋白質組學的研究中[53]。在MALDI 紫外光的誘導下，質量標簽和抗體之間的連接子發生斷裂，從而釋放出易于電離的多肽質量標簽用于MALDI 成像。這種MALDI-IHC 技術擁有比普通免疫組化技術更高的檢測通量，在對特定靶標進行成像的同時可以進行非靶向肽段的成像，為研究組織腫瘤微環境中的疾病標志物提供了一種新的策略?？贵w偶聯質量標簽的分析策略也被用于DESI-MSI 中。Zare 課題組設計了基于Immuno-DESI 的質量標記策略，并對組織上的藥物靶點和級聯信號因子進行了多重成像[54]。DESI 離子源產生的酸性電噴霧微滴會誘導質量編碼探針中的硼酸酯鍵發生斷裂，產生硼酸質量標簽被質譜實時采集，實現組織樣本上生物大分子的在線分析。

3 質量編碼探針在質譜多聯檢測與分析中的應用

3.1 生物樣本中多種靶標分子的定量分析

體液或細胞裂解液中存在多種與疾病相關的生物分子，如核酸、蛋白質、脂質等。對于某種特定的疾病而言，僅僅檢測某一種生物分子無法滿足精準診斷的要求。對多種疾病標志物的同時檢測有助于提高疾病診斷的準確率，減少假陽性或假陰性情況的發生?；谫|量編碼的質譜分析策略可以對體液或細胞裂解液中多種生物靶標進行同時高靈敏定量檢測，從而為疾病診斷和藥效分析提供指導和幫助。

核酸靶標的檢測在臨床檢驗中具有重要意義。王秋泉課題組結合鑭系元素質量標簽和滾環擴增技術，實現了對多種病毒DNA（HIV, HAV,HBV）的同時檢測[43]。探針在4T1 細胞裂解液和血清中的初步應用證實了該方法在臨床檢測上的實際應用價值。呂弋課題組開發了一種基于ICP-MS的三維DNA步行器，成功對肺癌相關的miR-125b、miR-141 和miR-21 在肺癌細胞A549 和正常細胞HBE 中的含量進行監測，驗證了3 種microRNA 在肺癌細胞系中的過量表達[44]。

除了多種DNA 或RNA 的同時檢測外，細胞裂解液中多種酶活性的同時評估有助于了解不同酶在生理條件下的作用。鞠熀先課題組開發了一種基于MALDI-MS 的多肽編碼靶板用于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的分析[36]。通過檢測非胰腺細胞（HeLa 和MCF-7）和胰腺癌細胞（PANC-1 和PC-3）裂解液中兩種酶的活性，證實這種方法可以有效區分胰腺細胞和非胰腺細胞。該課題組還利用開發的蛋白酶活性圖譜芯片，對caspase 1、2、3和8的活性進行同時評估[37]。此外，該課題組將開發的陣列應用于檢測MCF-7 細胞和MCF/ADR 細胞在化療藥物阿霉素（DOX）處理前后多種細胞凋亡蛋白酶活性的變化。該方法可以呈現出兩種細胞裂解液中酶活性的差異，為細胞耐藥性評估和區分藥物敏感/耐藥提供了重要的技術手段。Mrksich課題組提出了基于MALDI-MS 的自組裝單層膜技術（SAMDI-MS），并成功用于酶反應底物的高通量篩選[55]。該課題組利用SAMDI-MS 技術測量了CYP2C9酶的催化活性，成功從12種藥物中篩選出CYP2C9 酶的抑制劑，并確定了抑制劑的抑制常數（Ki）[56]。該方法可以用于更大規模的藥物代謝水平研究和藥物蛋白相互作用評估，從技術層面助力新型藥物的篩選與開發。

3.2 細胞表面多種標志物的同時檢測

細胞表面生物分子的表達與許多生命活動密切相關，例如細胞黏附[57]、細胞信號轉導[58]、免疫應答[59]等。在疾病的發生和進展中，細胞表面的分子會出現異常表達。在時間和空間多個維度分析細胞表面疾病標志物，有助于更好地從分子層面上理解病理過程中細胞發生的變化，為后期藥物開發奠定基礎。質量編碼探針上整合的生物識別元件賦予其出色的特異性，可用于細胞表面多種生物分子的同時準確定量。

劉寶紅課題組利用質量標簽修飾的AuNPs 和抗體修飾的金基底，實現了單個細胞表面多種蛋白質的同時分析[31]。通過對比MCF-7 細胞和DU145 細胞，驗證了MUC1、EpCAM 和CK19 3 種蛋白質在單個細胞水平上的差異化表達。細菌表面蛋白質的標記對菌群的識別和分選具有重要的意義。如圖3-A所示，王秋泉課題組以鑭系元素編碼的多克隆抗體作為特異性的細菌身份標簽（LnpAb-ID），實現了混合菌液中對單個菌株的計數和識別[60]。他們還將這種鑭系元素編碼的質譜分析策略應用于萬古霉素和AgNPs 的抗菌能力評估和機制探究。作者發現兩種抗菌劑均能對模型細菌造成一定的殺傷，并且AgNPs 殺傷細菌的機制有很多種，包括AgNPs 自身對脂多糖層上連接N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸的糖苷鍵的打斷，以及AgNPs上釋放的Ag+對細菌造成的氧化損傷。Chiu課題組設計了一種具有熒光和質譜信號的鑭系配位半導體聚合物點，可以實現流式細胞術和質譜流式細胞術的雙功能應用[61]。探針可以在MCF-7細胞和Jurkat T 細胞的混合物中實現兩種細胞的識別區分，并且成功應用于人外周血單核細胞（PBMC）的分型，展現了其在單細胞分析上的應用潛力。

疾病的發生往往伴隨著細胞表面蛋白質糖基化修飾的異常改變[62]。原位檢測細胞表面的多種聚糖有助于理解糖基化修飾的生物學功能，為相關藥物的研發提供新思路。林金明課題組利用DNA 介導的細胞表面工程化，實現了對α-D-甘露糖/α-D-葡萄糖和β1-6N乙酰葡糖胺的同時標記[35]。在此基礎上，他們進一步將這種策略應用于評估腫瘤細胞的多藥抗性與N 聚糖表達量之間的關系。研究者發現在抗藥的細胞系MCF7/ADR 細胞中兩種聚糖的表達量均高于MCF-7 細胞，并且在衣霉素作用下MCF7/ADR 細胞中兩種聚糖的下調水平均高于MCF-7 細胞。作者推測衣霉素誘導的糖基化改變與細胞多藥抗性的降低具有相關性。聶宗秀課題組將制備的光裂解探針應用于MCF-7細胞和MCF-7R 細胞中4 種聚糖（α-D-甘露糖/α-D-葡萄糖、β-半乳糖、N-乙酰葡糖胺/唾液酸、Neu5Aca2-6Gal(NAc)-R）的檢測[34]，并在單細胞水平上對4種聚糖的比例進行了定量分析，發現細胞的抗藥性與β-半乳糖和Neu5Aca2-6Gal(NAc)-R 的明顯上調有關。

3.3 細胞內多種活性分子測定

在真實環境下評估生物分子的活性對了解細胞內生理活動的動態網絡具有重要意義。探針層級結構的合理設計使得細胞內活性生物分子的存在及活性信息可以觸發探針變構，進而在質譜層面呈現出質量標簽離子信號的變化。

多酶活性的同時評估有助于研究相關信號通路中包含的多種酶在生理環境下的動態變化。此外，對多種酶的活性進行同時評估有助于闡明細胞在外源藥物刺激下的生理狀態改變，為藥物靶點篩選和藥效分析提供參考和借鑒?；诖?，本課題組開發了核衛星結構蛋白酶響應型質量編碼納米翻譯器（PRMNTs），用于同時評估多種細胞凋亡蛋白酶的活性（圖3-B）[24]。探針被細胞吞入后，細胞內蛋白酶對核衛星結構連接肽段進行水解，酶切后磁珠上剩余的不同AuNPs 表面質量標簽的離子強度變化可最終用于呈現多種蛋白酶的活性。通過檢測多種細胞凋亡蛋白酶的活性，作者發現在不同外源刺激下細胞程序性死亡涉及的凋亡途徑具有差異性，不同蛋白酶的激活在細胞凋亡進程中也存在特定的先后順序。除了對細胞內多種酶活性進行同時評估外，本課題組還構建了熒光-質量雙編碼納米探針（FMNPs），借助熒光成像方法可視化microRNA 在單個細胞中分布，并利用質譜技術實現microRNA 的精確定量，成功實現了miR-21和miR-141在多種細胞中的雙模態檢測[63]。

Figure3 Schematic illustration of biomarker detection by mass-encoded probes

3.4 組織樣本中多目標物成像

質譜成像通過逐點采集樣品表面單個像素點的分子信號，進一步利用軟件重構以形成質譜成像圖譜，可同時獲取數百種分子的空間分布信息[64]。結合質量編碼探針和質譜成像技術，研究人員可以對攝入體內的藥物分子、載體以及納米顆粒進行空間定位，并對組織上多種目標物進行同時標記，這為研究不同目標物的生物分布提供了圖像信息。

在LDI-MS 的激光照射下，某些納米材料在低質量范圍內會出現特征性的指紋信號。借助該特點，聶宗秀課題組對碳納米材料（多壁碳納米管、單層石墨烯、碳納米點）、MoS2納米片和含碳氣溶膠在亞器官上的分布進行了質譜成像探究。該研究團隊通過在多壁碳納米管上負載DOX，實現了對負載有藥物的碳納米材料的成像以及對其在腫瘤組織中的定量[65]。此后，利用負載有DOX 的MoS2納米片的特征質譜信號，作者對MoS2的器官和腫瘤攝取以及DOX 的原位釋放進行了定量分析，并對DOX/PEG-MoS2在正常組織和腫瘤組織組織間和組織內的分布進行成像[66]。利用碳氣溶膠中元素碳（EC）和有機碳（OC）的內在指紋圖譜，該課題組提出了一種無標簽的質譜成像策略，實現了對器官中碳氣溶膠沉積、轉移和組成改變的成像和定量，加深了對氣溶膠顆粒健康危害的理解[67]。

Rotello 課題組在AuNPs 表面修飾上一系列具有不同端基的聚乙二醇烷基硫醇，并用LDI-MSI對多種AuNPs 在小鼠體內的生物分布進行成像（圖4-A）[68]。脾臟成像的實驗數據證明納米粒子在亞器官的分布受到其表面化學的影響，為后續多重成像的研究奠定了基礎。為了研究納米粒子表面修飾的化學單層在生物體內穩定性，該課題組提出了ICP-MS 和LDI-MS 雙模態成像策略[69]。通過ICP-MS 確定AuNPs 的總量，利用LDI-MS 確定AuNPs 上剩余的質量標簽的數量，最終評估出AuNPs 表面質量標簽的穩定性。成像數據表明納米粒子在脾臟不同位置具有不同的穩定性，這為理解納米材料的藥代動力學性質提供了有力的方法和工具。

質量編碼探針可以對組織表面難電離的生物標志物進行標記，進而通過質量標簽分子的質譜成像呈現出目標生物分子的組織空間分布。聶宗秀課題組將制備的光裂解探針應用于乳腺組織上多種聚糖的質譜成像，成功揭示了聚糖在癌癥組織和癌旁組織的不同分布[34]。劉虎威、白玉課題組將雙功能激光可裂解探針用于聚糖識別標記，最終實現肝癌組織和癌旁組織的成像[29]。根據聚糖的空間分布差異，該工作實現了具有不同病理狀態組織和不同微觀結構組織的清晰區分，包括肝壞死組織、肝纖維化組織、上皮組織和結締組織等。最近，Zare 課題組開發了一種基于硼酸質量標簽（BMT）修飾抗體的免疫解吸電噴霧電離質譜成像平臺（圖4-B）。通過對EGFR和其下游的級聯信號因子（Raf、ERK、p-MEK、p-Raf、p-ERK）以及兩種相關的酶（PLC、PKC）進行質量標簽標記與成像，作者發現抗腫瘤藥拉帕替尼可以通過調節下游信號通路和其他代謝途徑，抑制EGFR 介導的腫瘤生長[54]。

4 總結和展望

基于質量編碼探針的質譜分析技術能夠實現對多種疾病標志物的同時高靈敏檢測，有助于全面理解生命系統功能分子的內在關聯，同時在方法學層面也拓寬了質譜在醫學、藥學等領域的應用。典型的質量編碼探針由質量標簽、識別元件和納米載體3 個部分構成。通過合理設計將3 個功能組件有效整合，即可構筑具有特定功能的探針，最終用于不同應用場景下的質譜多聯檢測。針對于不同的質譜檢測方式，質量編碼探針的設計和使用也各具特色，為細胞內外多種疾病標志物的檢測和成像提供了豐富有效的手段。

然而，質量編碼探針在合成、作用及檢測過程中還存在如下技術難點：（1）針對不同類型目標物開發一種通用型的質量編碼探針一直是困擾研究者的重要問題。其中，質量標簽的選取要在兼顧離子化效率和生物毒性的前提下，保證與探針其余部分偶聯的穩定性。（2）由于探針遞送過程中存在許多因素的影響，例如細胞內吞的效率和溶酶體逃逸的效率，因此細胞內活性分子的原位定量分析目前還較難實現。生物體各種內源性物質不僅會影響質量標簽或識別元件在載體表面的穩定性，也會由于基質效應影響質量標簽電離的效率。（3）對于實際樣品中豐度相對較低的生物分子，現有的信號放大策略主要依賴于酶催化反應和納米材料質量標簽載體，亟待開發級聯放大系統或高標簽載量的質量編碼探針對微量靶標進行信號增敏。

質量編碼探針在生物學上的大規模應用也存在諸多挑戰。首先，考慮到同源靶標在識別元件識別對應目標物時存在的干擾，質量編碼探針在多目標物響應上的正交性仍需進一步優化。其次，由于無機納米粒子和重金屬元素存在未知的生物毒性，質量編碼探針在活細胞乃至在活體上的應用受到了限制。此外，質量編碼探針因其結構設計的復雜性和檢測目標物的異質性，暫時無法實現大規模目標物的同時分析，在檢測通量上還有很大提升空間。

為推進質量編碼探針在生物體系中的應用，設計具有合理層級結構的探針將有助于實現原位靶標分析。此外，進一步建立質量標簽庫可以為生物標志物的多元檢測乃至對藥物靶點篩選和藥物療效評估起到推動作用。當前，將人工智能技術應用于生物化學等領域的研究已經成為當前學科發展的趨勢。例如，美國麻省理工學院Bhatia課題組近年來開發了一類可對疾病特異性蛋白酶組進行特異性響應的腎臟可清除質量編碼探針，利用尿液中收集的質量標簽豐度反映病理環境下的酶活性信息。同時，開發基于機器學習算法的疾病分類器，依據多種蛋白酶活性的異常調控水平成功實現了生命體生理病理狀態的分類評估[70-72]。借助超高容量的質量編碼探針庫，結合機器學習和深度學習等技術，有望實現對不同類型生物標志物的超高容量多重標記以及多參數質譜分析。人工智能技術的應用不僅有助于多目標物的高通量檢測，還能從繁雜的數據中提煉出有價值的分子信息，為新藥靶點的發現提供多維度的數據支持。在可以預見的未來，以多重質量編碼技術為工具，結合人工智能的質譜大數據分析將是生命分析和生物醫藥領域一個快速發展的重要研究方向。