基于網絡藥理學探討菊苣抗菌作用機制

吾爾麥提汗·麥麥提明，買買提明·買合木提，麥合皮熱提罕·麥麥提明

1.新疆維吾爾醫學?？茖W校，新疆 和田 848000；2.和田地區人民醫院，新疆 和田 848000

菊苣為維吾爾族和蒙古族習用藥材，亦是《中華人民共和國藥典》中收載的中藥材，來源于菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分或根，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫等功效[1]，在臨床上對于濕熱型肝炎、全身性水腫等疾病的治療具有良好的效果[2]。

菊苣主要成分包括半萜類、黃酮類、香豆素類等?，F代藥理研究結果表明，菊苣可以控制血糖、血脂水平，并且能夠有效預防心腦血管疾病，還能發揮抗癌效果。此外，有研究發現毛菊苣根對枯草芽孢桿菌、金色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌和大腸桿菌均有抑制作用[3]。從以上報告可以看出菊苣具有較強的抗菌作用，但是菊苣抗菌作用機制還未得到詳細論證。

網絡藥理學指的是運用計算機、基因組學、拓撲學等方面的知識，通過構建疾病-基因-靶點-藥物共同作用的網絡，深度挖掘中藥的藥物機理、作用原理、毒性等特點的新興學科之一，在闡明中藥綜合作用機制方面具有諸多優勢[4]，并且其已成功地應用于闡明中醫藥的治療機制。本文結合網絡藥理學方法分析菊苣抗菌作用機制，以期為后續進一步開展菊苣抗菌活性研究提供一定的理論基礎和科學依據。

1 方法

1.1 菊苣有效成分篩選及靶點的預測

首先利用TCMSP 數據庫檢索菊苣中所有化學成分，進而設定篩選條件：OB≥30%、DL≥0.18，據此選擇菊苣有效成分，隨后使用TCMSP 數據庫獲取相應的靶點信息，通過GeneCards 數據庫得到有效成分靶點的gene symbol。

1.2 抗菌基因靶點分析

將“antibacterial”設定為檢索關鍵詞，然后通過GeneCards 網站獲取抗菌基因靶點。

1.3 菊苣“藥物-成分-靶點-疾病”可視化網絡的構建

根據篩選出的菊苣活性成分所對應的靶點和抗菌相關靶點，使用VENNY2.1 在線作圖軟件繪制韋恩圖。選取菊苣活性成分對應的靶點基因與抗菌基因交集的部分，通過Cytoscape3.7.2 軟件的應用，構建菊苣網絡圖。

1.4 菊苣抗菌的蛋白互作網絡的構建

將菊苣有效成分抗菌靶點注釋STRING 數據庫，并將“Homosapiens”設置為物種類型，其他參數只需保持默認數據即可，以此建立蛋白互作網絡(PPI)。把PPI 網絡結果輸入Cytoscape 軟件中并利用cytoNCA 插件篩選出Degree 值排名前20 的關鍵靶點。

1.5 基因富集分析

將關鍵靶點注釋metascape，將物種設定為“Homosapiens”，完成關鍵靶點GO 生物學富集分析與KEGG 代謝通路富集分析，然后使用微生信在線作圖軟件完成富集結果的條形圖和氣泡圖的制作。

2 結果

2.1 菊苣有效成分及靶點的篩選結果

在TCMSP 中，基于DL≥0.18 且OB≥30%的條件進行篩選，合計獲得12 個菊苣有效成分，具體情況見表1。在12 個菊苣活性組分中，共找到156 個靶點，將重復部分刪除后，獲得了100 個菊苣潛在靶點，菊苣成分ψ-taraxastero、cichoriosideB 并未匹配到合適的靶點。

表1 菊苣中12 種有效成分的基本信息

2.2 抗菌相關基因靶點的預測結果

在GeneCards 數據庫中共搜索到抗菌相關基因靶點884 個。

2.3 菊苣“藥物-成分-靶點-疾病’可視化網絡的構建

將菊苣100 個潛在靶點和884 個抗菌基因靶點輸入VENNY2.1 軟件中繪制韋恩圖，結果如圖1 所示，兩者取交后獲得了46 個疾病—藥物共同潛在靶點。利用這46 個共同潛在靶點，在Cytoscape3.7.2 軟件的配合下完成“藥物-成分-靶點-疾病”模型的建立（圖2）。對測試結果進行分析可知：菊苣9 種有效成分在46 個抗菌靶點發揮抗菌功效均起到關鍵作用。其中，木犀草素、β-谷甾醇、（2R）-3-[3-（5-allyl-2-hydroxyphenyl）-4-hydroxyphenyl]propane-1,2-diol擁有最多的對應靶點。由此判斷，3 種成分對于抗菌具有較強的功效。

圖1 抗菌相關靶點與菊苣有效成分作用靶點的韋恩圖

圖2 “藥物-成分-靶點-抗菌”網絡

2.4 PPI 網絡創建和核心基因篩選結果

使用STRING 數據庫完成46 個共有靶點對應的PPI 網絡，具體情況如圖3 所示。該PPI 網絡中共有46 個節點和489 條邊，其中45 個靶點直接進入PPI 網絡，剩余1 個靶點（LACTB）屬于游離靶點蛋白，不參與PPI。將PPI 網絡結果輸入Cytoscape 軟件中并利用cytoNCA 插件篩選出Degree 值排名前20 的關鍵靶點，Degree 值排名前20 的關鍵靶點蛋白包括白細胞介素-6、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶、TP53 細胞腫瘤抗原、腫瘤壞死因子、胱天蛋白酶3、基質金屬蛋白酶9、轉錄因子JUN、HSP90AA1、前列腺素G/H 合酶2、表皮生長因子受體等，說明上述蛋白之間的相互作用在網絡中極其關鍵。

圖3 抗菌靶點PPI 網絡

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析結果

GO 功能富集分析將Degree 值排名前20 的關鍵靶點輸入metascape 中，將“Homo sapiens”設置為物種類型，以P＜0.01，最低富集數設計為1.5 進行關鍵靶點GO 生物學富集分析，得到生物過程為20個，細胞組分為6 條，分子功能為8 條，結果如圖4所示。

圖4 抗菌靶點GO 功能富集分析柱狀

KEGG 通路富集分析將Degree 值排名前20 的關鍵靶點輸入metascape 中，將“Homo sapiens”設置為物種類型，以P＜0.01，最低富集數設計為1.5 進行關鍵靶點KEGG 代謝通路富集分析，得到12 條信號通路，結果如圖5 所示。

圖5 抗菌靶點KEGG 功能富集分析氣泡圖

3 討論

現代藥理學及各方面研究結果表明，大部分中藥抗菌的作用機理都是通過激活生物體內在的其他抗菌因子[5]來激發生物體免疫力，從而降低細菌毒副作用，并提高生物體自身抵抗細菌的能力和機體自我修復的能力，以達到抗菌的目的。雖然已有關于菊苣的抗菌作用的相關報道[3-4]，但其抗菌作用機制尚未得到過詳細論證。本文采用網絡藥理學方法對菊苣中與抗菌有關的有效成分、作用靶點及生物信號通路情況進行研究，結合網絡藥理學預測了菊苣9 種有效成分在46 個抗菌靶點抗菌時起到主要作用，其中木犀草素、β-谷甾醇、MOL008539 擁有最多的對應靶點，由此推測，這3 種成分可能在抗菌過程中發揮關鍵作用。也有研究[6]發現，木犀草素能夠發揮抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗氧化等作用。劉淼等[7]通過研究發現木犀草素可破壞細菌細胞膜，在浮游狀態下導致細胞形態變動，進而幫助細胞內容物產生滲漏效果，以此提升抗菌的作用，其通過限制生物膜形成等方式來降低抗生物被膜活性。Lokadi Pierre Luhata[8]首次發現，從紅樓花葉中分離出的β-谷甾醇對金黃色葡萄球菌具有抑菌效果。還有文獻報道[9]β-谷甾醇具有抗真菌活性。雖然缺乏關于MOL008539（別名為Magnolignan A）的抗菌作用的相關報道，但莫斯喻等[10]表示厚樸具有保護神經、心腦血管以及抗氧化、抗菌、抗炎、抗潰瘍、抗腫瘤等功效。通過這些報告可以推測出MOL008539 可能參與抗菌過程。此結果與以往文獻報道相一致，因此進一步確定了菊苣通過這3 種活性成分作用于多個靶點發揮抗菌作用。

從PPI 網絡分析的結果來看，PPI 網絡Degree值排名前5 的關鍵靶點分別為白細胞介素-6、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶、TP53 細胞腫瘤抗原、腫瘤壞死因子、胱天蛋白酶3。AKT1 被激活后參與細胞生長、代謝、增殖和凋亡等多種生物學過程，并且其屬于重要信號通路[11]；IL-6 本身屬于炎癥細胞因子，對于炎癥反應能夠發揮重要的功能和效果，并能有效提升T 細胞、B 細胞的活性，同時刺激外援物質的識別應答功能，以此發揮抗菌消炎的效果[12]。腫瘤壞死因子可誘導某些腫瘤細胞的程序性死亡，在特定條件下能促進細胞增殖，提升細胞分化速度，并且能持續調整患者身體免疫效果[13]。胱天蛋白酶3 作為參與細胞凋亡過程的關鍵執行因子，廣泛參與細胞凋亡的過程[14]。TP53 細胞腫瘤抗原會主動進行DNA 修復、細胞死亡促進等，對于機體免疫應答、炎癥反應發揮著特定的功能[15]。因此可以得知菊苣的抗菌靶點通過促進細胞凋亡、刺激機體的識別應答、免疫調節等途徑發揮抗菌作用。

從GO 功能富集結果來看，與抗菌有關的有效成分靶點主要集中在平滑肌細胞增殖的調控、神經元死亡的調控、蛋白質磷酸化的正向調控、凋亡過程的正向調控、炎癥反應的調控上。由KEGG 通路富集結果來看，抗菌靶點主要富集在癌癥通路方面，其次為脂質和動脈粥樣硬化，人巨細胞病毒感染、南美錐蟲病、卡波氏肉瘤等相關皰疹病毒感染，血流剪切力與動脈粥樣硬化，JAK-STAT 信號通路、甲型流感等信號通路。上述結論表明，菊苣抗菌作用可通過多種生物途徑、多條信號通路共同實現。

綜上所述，本文在研究過程中以網絡藥理學方法為基礎，分析菊苣中發揮抗菌作用的有效成分、靶點和信號通路，以期為后續菊苣抗菌活性研究活動的開展提供一定的理論基礎和科學依據。