臍帶間充質干細胞對卵巢早衰家兔線粒體的影響

張娟, 李陽, 閆夏貝, 劉杰, 庹平

(1.中部戰區總醫院 生殖醫學科, 湖北 武漢 430070; 2.武漢科技大學 醫學院, 湖北 武漢 430081)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF) 是指40歲以下女性出現卵泡發育不良和卵巢過早老化,引起持續性閉經和性器官萎縮并伴有雌激素缺乏及促性腺激素水平升高的一種綜合征[1]。其發病機制尚不清楚,與許多復雜因素有關,主要有遺傳缺陷疾病[2]、自身免疫疾病和化療損傷等醫源性因素[3-4]。常用的激素替代療法只能緩解低雌激素導致的圍絕經期綜合征,并不能有效恢復卵巢功能,而且超量使用激素會出現相應的副作用。因此,需要積極尋求治療POF的新方法[5-6]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因其固有的再生特性在醫學中備受重視[7-8]。MSCs是一種多能干細胞,免疫原性差,且獲取途徑多樣。其中人臍帶來源的間充質干細胞獲取較為容易,也無創傷,且引發的倫理問題較少,是極好的來源途徑[8-10]。臍帶間充質干細胞能夠分泌許多細胞因子和生長因子、信號脂質、信使RNA和調節性miRNA等[11],這些因素與細胞間通訊、細胞信號傳導及細胞或組織代謝的變化有關。臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)能同時激活多種機制(營養、旁分泌、免疫調節和分化)來影響受損組織再生的所有階段,從而改善卵巢功能[12]。本課題組前期已成功構建了家兔卵巢早衰模型[13],并發現環磷酰胺誘導的家兔POF模型在注射UCMSCs治療后,早衰卵巢的結構和功能得到改善,細胞凋亡情況減少,雌二醇(estradiol,E2)上升,促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)下降,UCMSCs可能通過上調富半胱氨酸蛋白61和結締組織生長因子的表達,從而激活休眠卵泡生成、恢復卵巢功能,對POF起到治療作用[14]。為進一步探究UCMSCs治療POF的作用機制,本研究以家兔為對象,觀察UCMSCs治療后顆粒細胞凋亡比例、線粒體超微結構變化以及線粒體DNA(mitochondrial deoxyribonucleic acid,mtDNA)的拷貝數變化,研究UCMSCs對卵巢早衰家兔線粒體的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性未交配日本大耳白兔15只,2.5～2.8 kg,月齡5月左右,購自武漢萬千佳興生物科技有限公司[SCXK(鄂)2018-0022],飼養于中部戰區總醫院醫學實驗中心[SYXK (鄂)2019-0082]。本研究經中部戰區總醫院倫理委員會批準(審批號:2022211)。

1.2 主要試劑與儀器

EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix(EQ001)、FSH/ E2 ELISA Kit (ELK9279/1208)均購自武漢ELK公司;tunel試劑盒(11684817910)購自北京Roche公司;MesenCultTMOsteogenic/Adipogenic/Chondro Differentiation Kit(05465/05412/05455)均購自加拿大stemcell technologies公司;Anti-CD90/34/105/45均購自美國BD Biosciences公司;熒光定量PCR儀(QuantStudio 6 Flex System)購自武漢Life technologies公司;倒置熒光拍照顯微鏡(IX51)購自日本OLYMPUS公司;酶標儀(DR-200Bs)購自Diatek公司;透射電子顯微鏡(HT7800)購自HITACHI公司;注射用環磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)購自德國Baxter Oncology GmbH公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與模型制備

隨機分組,正常對照組3只,POF模型組和UCMSCs治療組各6只。根據前期研究,采用連續2 d腹腔注射50 mg/kg環磷酰胺構建POF模型,注射環磷酰胺后,各組家兔都有脫毛情況,采食量變少、活動量減少、E2和FSH水平變化及卵巢指數變化等。

1.3.2 UCMSCs治療

(1)UCMSCs的培養及鑒定 臍帶標本取自本院妊娠37周以上產婦胎兒,已獲中部戰區總醫院倫理委員會批準(審批號:2016020)。將洗凈的臍帶剪成2～3 cm的小段,剔除臍動靜脈,剝離華通膠,用無菌眼科剪將華通膠剪成1 mm2的小組織塊,轉移至細胞培養瓶中,加入10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素及完全培養液,于5% CO2、37 ℃的培養箱中靜置培養,待細胞長至80%～90%融合時用胰蛋白酶消化液消化凍存或傳代。每3 d按1∶3體積比傳代。取第3代UCMSCs,制成懸液于EP管,分別加入抗體CD90、CD34、CD105、CD45,流式細胞儀檢測結果顯示:貼壁細胞表達CD90和CD105,不表達CD34和CD45,為人體臍帶間充質干細胞(圖1)。取第3代UCMSCs,將細胞以(1.5×105)/孔接種于培養皿中,分別標記為正常組、成骨組、成脂組和成軟骨組。待細胞長到70%～80%匯合度時分別將成骨組的培養基、成脂組的培養基、成軟骨組的培養基換成相應的誘導液,正常組繼續用完全培養基培養,每2～3 d換液一次,鏡下觀察,發現明顯鈣結節進行茜素紅染色、發現明顯脂滴進行油紅O染色、在誘導的21 d行阿利新藍染色,證明UCMSCs的成骨、成脂及成軟骨分化潛能(圖2)。

圖1 UCMSCs的流式檢測結果Figure 1 Flow detection results of UCMSCs

(2)治療方法 UCMSCs治療組的6只家兔在造模后第3天連續注射3 d的UCMSCs懸液,細胞數為(5×106)/mL,每天2 mL。卵巢早衰模型組注射同等的滅菌用水。

1.3.3 觀察指標

在造模前、治療后1、7和14 d,通過耳緣靜脈采取3組家兔靜脈血,離心(3 000 r/min,10 min)取上清,血清于-80 ℃冰箱保存。在治療后14 d處死后取材,取3組家兔雙側卵巢,清洗并稱質量,切取適量卵巢組織放在4%多聚甲醛中固定,固定后石蠟包埋,5 μm切片備用;切取米粒大小組織放入電鏡固定液中,另取所需量新鮮組織凍存在-80 ℃冰箱中。

(1)卵巢指數 生理鹽水清洗血跡,剝離多余脂肪組織后,用電子天平稱取卵巢濕重并記錄;卵巢指數=卵巢濕重(g)/家兔體質量(kg)。

(2)血清E2和FSH水平 取出-80 ℃冰箱保存的血清,Elisa法檢測血清中E2和FSH水平。

(3)卵巢顆粒細胞凋亡檢測 每個卵巢組織石蠟切片隨機選取3張切片,經脫蠟,蛋白酶K消化,37 ℃水浴鍋孵育30 min;加入破膜液,取tunel試劑盒中的試劑1和試劑2按體積比1∶10混合,配制適量孵育液,4 ℃過夜;滴加DAPI染核,室溫避光孵育20～30 min;用抗熒光淬滅封片劑封片,顯微鏡下觀察拍照,IPP軟件計數。

(4)電鏡觀察線粒體形態 取出電鏡固定液中的卵巢組織,1%鋨酸避光室溫固定;組織依次加入不同體積分數的乙醇和100%丙酮上行脫水;丙酮:812包埋劑滲透包埋;包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h;超薄切片后用150目方華膜銅網撈片;銅網先在2%醋酸鈾飽和酒精溶液中染色;然后再2.6%枸櫞酸鉛溶液中避二氧化碳染色;透射電鏡觀察卵巢組織中線粒體的超微結構形態。

(5)RT-PCR法檢測卵巢組織中mtDNA拷貝數 取20 mg卵巢組織于1 mL預冷的TRIpure中充分研磨,加入三氯乙烷混勻-離心-取上清液-加入異丙醇混勻-離心-棄上清-加入75%乙醇清洗RNA沉淀-離心-棄上清,加入RNase-Free Water充分溶解RNA,采用EntiLink 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA,最后使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix進行PCR擴增。引物:Rb-ACTIN:上游:5’-CCCAGATCATGTTCGAGACGT-3’,下游:5’-TAGC-CCTCGTAGATGGGCAC-3’;Rb-mtDNA:上游:5’-CGAAAAATCTTAGGGTACATACAAC-3’,下游:5’-TTAGGTTGACTAGTGGGTAAGGTAT-3’,采用2-ΔΔCT法進行mtDNA拷貝數結果的計算。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 卵巢指數比較

正常對照組卵巢指數為(0.0567±0.0475),POF模型組卵巢指數為(0.0379±0.0239)。與對照組相比,模型組卵巢指數降低,差異有統計學意義(P<0.05);UCMSCs治療組卵巢指數為(0.0436±0.0125),與模型組相比,治療組卵巢指數升高,差異無統計學意義(P>0.05);3組的卵巢指數比較差異有統計學意義(F=27.764,P<0.05)。

2.2 各組E2和FSH值比較

各組在造模前血清E2和FSH水平差異無統計學意義(FE2=0.032,PE2>0.05;FFSH=0.289,PFSH>0.05)。造模后模型組家兔E2值一直較低、FSH值一直較高,未隨時間出現規律性變化,與正常對照組相比,差異有統計學意義(t治療后1d E2=3.016,t7d E2=4.247,t14d E2=14.931,P<0.05;t治療后1d FSH=-4.562,t7d FSH=-8.015,t14d FSH=-9.038,P<0.05)。干細胞干預后治療組家兔血清E2水平上升,FSH水平下降,并且隨著時間出現周期性波動,與模型組相比差異具有統計學意義(t治療后1d E2=-6.896,t7d E2=-3.573,t14d E2=-45.964,P<0.05;t治療后1d FSH=3.136,t7d FSH=4.424,t14d FSH=8.872,P<0.05),見圖3、4。

圖3 3組不同采血時間點的E2水平Figure 3 E2 levels in the three groups at different blood collection time points

圖4 3組不同采血時間點的FSH水平Figure 4 FSH levels in three groups at different blood collection time points

2.3 卵巢顆粒細胞凋亡檢測

正常對照組卵巢顆粒細胞凋亡數較少,散在分布,平均表達數為(1.51±0.24);POF模型組卵巢顆粒細胞凋亡數明顯增多,均勻分布,平均表達數為(50.66±7.32),與正常對照組相比有差異(t=-11.442,P<0.05);UCMSCs治療組卵巢顆粒細胞凋亡數較模型組減少,平均表達數為(27.89±4.97),與模型組比較,差異有統計學意義(t=4.400,P<0.05)。3組凋亡率比較,差異有統計學意義(F=69.57,P<0.05),見圖5、6。

A:正常對照組; B:模型組; C:治療組A: Normal control group; B: Model group; C: Treatment group圖5 卵巢顆粒細胞凋亡圖Figure 5 Apoptosis of ovarian granulosa cells

2.4 電鏡下卵巢組織線粒體形態變化

正常對照組中卵泡顆粒細胞的細胞核較大,圓形色淡,核仁偏位,并常見有分裂跡象。細胞質內有豐富的線粒體、發達的粗面內質網等細胞器;線粒體,呈圓形或長橢圓形,散在分布。POF模型組卵泡顆粒細胞核皺縮明顯,線粒體結構排列紊亂、腫脹及空泡變,線粒體體積變大、基質變淺等,粗面內質網擴張或囊泡化,或互相離散。UCMSCs治療組卵泡顆粒細胞核皺縮不明顯,散在分布正常及異常線粒體結構,線粒體嵴部分尚存,伴空泡,見圖7、8。

A:正常對照組; B:模型組; C:治療組A: Normal control group; B: Model group; C: Treatment group圖7 透射電鏡下的線粒體形態改變(×2 500)Figure 7 Morphological changes of mitochondria under transmission electron microscopy(×2 500)

2.5 卵巢組織中mtDNA拷貝數變化

正常對照組卵巢組織中mtDNA拷貝數均值為(1.04±0.12),POF模型組卵巢組織中mtDNA拷貝數較少,均值為(0.26±0.10),與正常對照組相比差異有統計學意義(t=8.789,P<0.05);而UCMSCs治療組卵巢組織中mtDNA拷貝數明顯增加,均值為(0.66±0.14),與模型組相比,差異有統計學意義(t=-4.097,P<0.05)。3組卵巢的卵巢組織中mtDNA拷貝數比較差異有統計學意義(F=32.89,P<0.05),見圖9。

1)P<0.05; 2)P<0.01圖9 卵巢組織中mtDNA拷貝數Figure 9 Copy number of mtDNA in ovarian tissue

3 討論

近年來,眾多研究表明間充質干細胞治療是較好的細胞療法之一[15-16]。間充質干細胞來源廣泛,而較為常用的是UCMSCs[17]。UCMSCs能分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、上皮樣細胞、平滑肌細胞及神經元樣細胞等多種類型的細胞,且取材簡單、免疫原性低和倫理爭議少,在醫學中具有廣闊的應用前景。目前研究表明,UCMSCs已在許多疾病的治療中發揮重要作用,如卵巢早衰、糖尿病、肝損傷、骨損傷等[18-20]。

線粒體是存在于顆粒細胞和卵母細胞內、具有核外遺傳物質、可獨立進行轉錄和翻譯的半自主細胞器,參與許多基本的細胞功能調節。線粒體內膜向內褶皺形成“嵴”,線粒體嵴上有許多線粒體基粒,這些基?？衫煤粑満铣葾TP,線粒體分布不規則及空泡化結構改變是卵母細胞損傷的標志[21]。線粒體結構的紊亂變化會影響卵母細胞的發育,可能導致卵巢儲備功能下降甚至衰退[22]。mtDNA是線粒體獨立擁有的一組遺傳物質,編碼著線粒體呼吸鏈上的13種蛋白[23]。mtDNA拷貝數的減少會影響呼吸鏈上13種蛋白亞基的轉錄和翻譯,從而導致線粒體功能異常[23]。研究發現[24-25],線粒體功能異?？稍斐陕涯讣毎捌渲車亚痤w粒細胞的功能障礙和凋亡,導致卵泡閉鎖甚至衰竭。上述研究提示線粒體異常與卵巢衰老密切相關。

本研究顯示:與正常對照組相比,造模后卵巢指數明顯降低,POF模型組家兔一直處于低E2和高FSH狀態,顆粒細胞凋亡比例明顯升高,影響卵母細胞的生長與發育,均顯示了環磷酰胺對卵巢的損傷,模型在生理上能基本代表人POF。同時觀察發現,POF模型組家兔卵巢組織線粒體結構紊亂、完全空泡化,大量線粒體嵴消失,mtDNA拷貝數明顯減少,表明卵巢早衰與線粒體損傷存在相關性,卵巢衰老伴隨線粒體結構紊亂和功能異常。經UCMSCs耳緣靜脈注射治療后,POF家兔卵巢指數升高,血清FSH值降低、E2值升高,顆粒細胞凋亡明顯減少,卵巢組織的線粒體結構中間雖有空泡化,但線粒體嵴部分尚存,mtDNA拷貝數也增加,提示線粒體損傷修復可能在UCMSCs治療卵巢早衰中起作用。最近的觀察表明,在許多情況下,干細胞只短暫地出現在受損組織中,但它們在短暫出現期間,會限制組織破壞或通過各種機制加強修復受損組織,這些機制包括為促進組織內源性干細胞的增殖和分化提供合適的環境;上調過度免疫反應的基因;轉移含有線粒體和microRNA的囊泡成分;上調炎癥反應的基因[26]。研究闡明[27-28],UCMSCs有能力將自己的線粒體轉移到mtDNA耗盡的細胞中,轉移的mtDNA可以恢復線粒體呼吸鏈和氧化磷酸化等一系列重要的細胞功能,表明UCMSCs可以作為一種潛在的治療手段,線粒體的轉移為UCMSCs治療與線粒體功能障礙相關的疾病提供了合理的依據。

綜上所述,POF伴隨著mtDNA拷貝數的減少和線粒體結構的破壞,經UCMSCs治療后,mtDNA拷貝數較前增加,線粒體結構部分恢復,提示UCMSCs對POF的治療可能是通過修復線粒體損傷來減少細胞凋亡和組織修復來完成的,但其通路機制仍需進一步探索。

作者貢獻聲明

張娟:提出研究思路和框架,完善課題,修改論文;李陽:實驗操作,撰寫論文;閆夏貝:設計及指導實驗,撰寫論文;劉杰:指導實驗步驟,協助實驗完成;庹平:指導文獻的查找和實驗步驟。

利益沖突聲明

本研究未受到企業、公司等的第三方資助,不存在潛在利益沖突。