柯薩奇病毒A 組16 型抗原ELISA 定量檢測方法的建立與初步應用

張浩然 姜莉 劉鵬 田華平 劉碧云 徐華 曹明翔 楊二霞

（艾美行動生物制藥有限公司 江蘇泰州 225300）

0 引言

手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）是全球性傳染病，已在全世界范圍內暴發或流行[1]。我國自2008 年將其列入丙類傳染病[2-3]，2008—2019 年全國法定傳染病疫情概況顯示我國報告的HFMD 約2 248萬例，平均年發病率為152/10 萬，報告重癥病例約16 萬例，死亡超過3 600 人[4]。 柯薩奇病毒A 組16型（Coxsackievirus A16，CA16） 是引起HFMD 的主要病原體。CA16 與腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）所致的HFMD 在臨床上難區別， 但CA16 分布范圍廣，導致發病人數多，常占HFMD 發病率的60%以上[5-6]，而且在近年也發生了CA16 感染導致重癥的病例甚至引發死亡，例如致死性心肌炎、肺水腫等[7-9]。因此， 在已有EV71 疫苗上市的情況下， 研發針對CA16 的疫苗對預防HFMD 具有重大意義。在CA16疫苗產品工藝開發過程中，CA16 抗原含量是疫苗質量控制的關鍵指數。 本實驗建立了CA16 抗原雙抗體夾心定量ELISA 檢測方法，為此過程提供了檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AKTA pure 150 型蛋白純化儀 （美國GE 公司）；ST-36W 型全自動洗板機（上?？迫A公司）；JCSY 型水浴鍋（上海一恒公司）；Multiskan 1510 型全波長酶標儀（美國Thermo 公司）。

1.2 材料

Vero 細胞和KMB17 細胞 （中國醫學科學院醫學生物學研究所）；清潔級新西蘭兔（雌性，體重3 kg，動物合格證號：SCXK（蘇）2017-0001，南京青龍山動物繁殖場）；CA16 抗原國家標準品（批號201507001，標示量2 000 U/mL，蛋白濃度2 μg/mL，中國藥品食品檢定研究院）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀公司）；Protein G 親和層析柱（上海博格隆公司）；單組分TMB 顯色液（北京索萊寶公司）；超濾濃縮管（100KD，美國Pall 公司）；CA16 收獲液（批號202103）、CA16 超濾濃縮液（批號202103）、CA16 純化滅活液（批號202103）、CA16 原液（批號202103，2 000 U/ml）、EV71 原液（批號20210101，5 065 U/ml）、HAV 原液（批號20210303，6 400 EU/ml）、H1N1 流感病毒（批號20191009， 滴度5.25 log 每毫升細胞培養半數感染量）均來自艾美康淮生物制藥（江蘇）有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）均購自美國Sigma 公司。

2 方法

2.1 CA16-IgG 多克隆抗體（多抗）的制備

2.1.1 動物免疫

初免將CA16 純化病毒液與弗氏完全佐劑等體積充分混合成乳膏狀，經腋窩、背部、腹股溝皮下多點免疫新西蘭兔，接種抗原劑量為4 000 U/只，每點注射0.2 mL。 初免后4 周以相同劑量與方法使用弗氏不完全佐劑加強免疫1 次。

2.1.2 血清分離與檢測

兔耳緣靜脈采血，分離血清，采用血清中和法監測其抗體效價。 當抗體效價較高時取兔全血，分離血清。

2.1.3 多抗純化

按照Protein G 親和層析產品說明書純化免疫血清，獲得多抗，將CA16-IgG 純化液經100 KD 超濾濃縮管超濾濃縮，利用BCA 蛋白定量法測定其蛋白含量。

2.2 純化CA16 多抗的評價

2.2.1 純度分析

配制10%分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后分析抗體純度。

2.2.2 純化抗體效價檢測

采用ELISA 競爭法， 將抗體進行倍比系列稀釋，10 μL/孔，加入HRP 標記的純化多抗，90 μL/孔，混合后37℃孵育3 h，洗板后四甲基聯苯胺顯色，檢測波長450 nm，參比波長630 nm，于酶標儀上讀取吸光度值（A450/630nm）。 cut off 值為（陰性平均值-陽性平均值）/2。

2.3 酶標抗體的制備

采用高碘酸鈉法將HRP 醛化后與純化CA16多抗結合，使用乙二醇終止反應，使用硼氫化鈉封閉多余醛基，使其還原成穩定態，利用硫酸銨沉淀后透析獲得酶標抗體。

2.4 雙抗體夾心ELISA 的建立

將CA16 多抗與酶標抗體進行系列稀釋， 采用棋盤法確定兩者最佳工作濃度，并對包被條件、封閉條件、樣品稀釋液、酶稀釋液以及反應時間、孵育條件等進行優化，建立檢測體系。

采用碳酸鹽緩沖液將CA16 多抗濃縮液稀釋到2.0 μg/mL，包被至96 孔酶標板上，100 μL/孔，置4℃12 h，洗板3 次，加入1.5% BSA 封閉液，置4℃12 h，洗板3 次，晾干后于箒20℃保存。

使用時將板室溫平衡30 min， 加樣100 μL/孔，用0.01 mol/L PBS 在板內進行對倍稀釋， 設三孔陰性對照，兩孔空白對照，37℃孵育2 h，洗板機洗板5次，1 min/次，300 μL/孔，拍干，加入HRP 標記的CA16多抗，100 μL/孔，37℃孵育1 h。 此CA16-IgG-HRP用酶稀釋液（0.01 mol/L PBS 配制的1.5%BSA）稀釋使用，經條件試驗檢測，稀釋比例確定為1∶9 000。 洗板機洗板5 次，1 min/次，300 μL/孔，拍干，加入TMB單組分顯色液，100 μL/孔，37℃孵育10 min，加入2 mol/L硫酸終止反應，50 μL/孔，10 分鐘內用酶標儀讀取結果，以A450/630nm作為檢測結果。

2.5 方法驗證

按照《中國藥典》三部（2020 版）中《生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則》[10]的要求，對檢測方法進行驗證，對本試劑盒的線性、靈敏度、準確度、精密度、穩定性、專屬性進行驗證。

2.5.1 線性和最低檢測下限

用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）將CA16 抗原國家標準品（2μg/mL）分別稀釋至90.91、45.45、22.73、11.36、5.68、2.84、1.42、0.71 ng/mL。 用建立的方法對各樣品進行檢測，雙復孔上樣，以不同濃度樣品的A450/630nm和抗原含量進行線性擬合， 根據擬合直線的斜率及決定系數分析最佳線性范圍，并確定最低檢測下限。

2.5.2 精密度

2.5.2.1 日內精密度

使用該體系由3 位實驗員于同一時間分別獨立操作， 將CA16 國家標準品用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）稀釋至45.45 ng/mL（A450nm＞1.0，代表強陽性）、11.36 ng/mL（A450nm=0.4～0.7，代表中陽性）、2.84 ng/mL（A450nm=0.1～0.25，代表弱陽性），用建立的方法進行測定， 計算不同濃度樣品在不同操作人員間的變異系數（CV），即變異系數=標準差÷平均值×100%。

2.5.2.2 日間精密度

由3 位實驗員于3 個不同時間點使用該檢測體系分別獨立操作，按2.5.2.1 方法稀釋CA16 國家標準品，用建立的方法進行測定，計算CV。

2.5.3 準確度驗證

按2.5.2.1 方法稀釋CA16 國家標準品，用建立的方法進行檢測， 計算實際測定值并根據理論值計算相對偏倚（RB），分析該方法的準確度。

2.5.4 特異性驗證

用該方法檢測流感病毒收獲液、EV71 收獲液、HAV 收獲液，vero 細胞和KMB17 細胞裂解液等樣品，分析該方法的特異性。

2.5.5 穩定性驗證

將CA16 抗體包被板放于含干燥劑的鋁箔袋中抽真空后置于37℃溫箱，放置5 d 后測定，以-20℃保存的CA16 抗原包被板做對照，比較該保存條件下的線性、最低檢測下限、特異性、精密度以分析其穩定性。

2.5.6 適用性分析

對3 批CA16 收獲液、超濾濃縮液、純化滅活液與原液進行抗原檢測， 以監測CA16 抗原制備過程中的比活。

3 結果

3.1 兔抗CA16 多抗的制備及鑒定

利用血清中和的方法檢測免疫前及免疫過程中的兔血清CA16 抗體效價，初免后28 d 內抗體效價相對較低， 初免28 d 進行二免后效價迅速升高，抗體效價最高達1∶20 480， 但在二免14 d 發現其有下降趨勢，隨即采集兔全血，分離較高效價兔血清。 利用SDS-PAGE 電泳及銀染的方法檢測CA16 多抗純度，結果出現50 000 和23 000 這2 條帶，無其他雜帶（圖1）；使用超濾管對CA16-IgG 純化液進行超濾濃縮，BCA 蛋白定量的方法測定CA16 多抗蛋白濃度為23.8 mg/mL。

圖1 純化的柯薩奇病毒A 組16 型多抗電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of purified Coxsackie virus group A type 16 polyclonal antibody

3.2 性能驗證

3.2.1 線性和最低檢測下限

采用建立的方法， 吸光度值與蛋白濃度擬合曲線作回歸分析方程， 重復檢測發現線性范圍在0.71～45.45 ng/mL 之間， 與其吸光度值呈良好的線性關系，R2＞0.997（圖2）；以陰性平均值的2.1 倍作為判定結果，其最低檢測下限為2.84 ng/mL。

圖2 柯薩奇病毒A 組16 型國家標準品的標準曲線Fig.2 Standard curve of national standard for Coxsackie virus group A type 16

3.2.2 精密度

計算日內精密度，高、中、低3 個濃度樣品變異系數分別為3.86%、5.29%、7.83%， 均小于15%（見表1）。

表1 柯薩奇病毒A 型16 抗原ELISA 定量檢測方法 （x±s）Table 1 Intraday Precision of ELISA Quantitative Detection Method for Coxsackie Virus Group A Type 16 Antigen （）

表1 柯薩奇病毒A 型16 抗原ELISA 定量檢測方法 （x±s）Table 1 Intraday Precision of ELISA Quantitative Detection Method for Coxsackie Virus Group A Type 16 Antigen （）

?

計算日間精密度CV 值，在高、中、低3 個濃度樣品變異系數分別為6.59%、12.55%、14.83%， 其變異系數有所上升，但同樣小于15%。 表明該方法具有良好的精密度（見表2）。

表2 柯薩奇病毒A 組16 型抗原ELISA 定量檢測方法的日間精度（）Table 2 Daytime Precision of ELISA Quantitative Detection Method for Coxsackie Virus Group A Type 16 Antigen （）

表2 柯薩奇病毒A 組16 型抗原ELISA 定量檢測方法的日間精度（）Table 2 Daytime Precision of ELISA Quantitative Detection Method for Coxsackie Virus Group A Type 16 Antigen （）

?

3.2.3 準確度

如表3 所示，高、中、低3 個濃度樣本的相對偏倚（RB）均不高于±12%，表明該方法準確度良好。

3.2.4 特異性試驗結果

用該方法檢測流感病毒收獲液、EV71 收獲液、HAV 收獲液，vero 細胞對照和KMB17 細胞等樣品，結果除CA16 收獲液為陽性（A450nm大于cut off 值0.105）外，其余均為陰性，A450nm均小于0.105，表明該方法特異性良好（圖3）。

圖3 柯薩奇病毒A 組16 型抗原ELISA 定量檢測方法的特異性Fig.3 The specificity of the ELISA quantitative detection method for Coxsackie virus group A type 16 antigen

3.2.5 穩定性

穩定性考察結果顯示決定系數為0.998； 最低檢測下限有一個稀釋度的浮動；特異性方面幾種非CA16 的樣品均為陰性；精密度檢測方面高、中、低3個濃度樣品日內精密度均小于15%。 證明該方法具有良好的穩定性（見表4）。

表4 穩定性試驗結果Table 4 Stability Test Results

3.2.6 適用性結果

對CA16 滅活疫苗制備中的中間產物進行抗原濃度的檢測，監測3 批CA16 抗原制備過程的比活，結果如圖4 所示，比活持續上升，符合生產過程中比活持續升高的規律。利用該方法可指導工藝的探索，為CA16 疫苗研發奠定基礎。

圖4 CA16 滅活疫苗中間品的比活檢測結果Fig.4 Specific Activity Test Results of Intermediate Products of CA16 Inactivated Vaccine

4 討論

CA16 病毒與EV71 病毒是HFMD 的主要病原體[11]。 現在已有EV71 型HFMD 疫苗上市，而CA16型HFMD 疫苗均處于研發階段[12]。在研發過程中，亟需一種特異性良好、靈敏度高、精密度、準確度及穩定性良好的檢測體系。用該方法建立的體系，較好的達到了上述要求。在CA16 疫苗研發過程中，用該方法檢測中間產物，用反饋回來的數據，改進工藝，為CA16 疫苗的研發奠定了基礎。

在建立方法時發現抗血清效價受新西蘭兔個體差異影響較大。隨著免疫次數的增加，抗體效價先升后降，在二免10 天左右達到峰值后，提示需實時監測兔抗血清效價水平，取其峰值進行血清收集。

該方法在線性范圍0.71～45.45 ng/mL，決定系數＞0.997，即在這個范圍內形成的復合物和檢測抗原含量成較好的正比關系，且最低檢測下限為2.84 ng/mL，體現了較高的靈敏度。綜上所述，該體系建立的方法具有較高的靈敏度、精密度和穩定性。該方法能夠較好的滿足CA16 疫苗的研發工作， 為未來產業化發展奠定基礎。