外源抗菌肽對木荷體內微生物和代謝物的影響

陳建樺

(福建省泰寧國有林場,福建 三明 354400)

木荷(SchimasuperbaGardn.et Champ.)為山茶科木荷屬植物,是我國亞熱帶地區常綠闊葉林的主要優勢闊葉樹種[1],主要分布于浙江、福建、江西、貴州、湖南、廣西、廣東、海南等地[2]。木荷環境適應性強,利用價值高,用途廣泛,樹干通直,材質堅硬且不易變形[3-4]。此外木荷喜光,能抑制林下植被生長進而形成裸露地帶,具備良好的防火阻燃效果,是一種優良的造林、用材以及防火樹種[3,5]。但是長久以來,木荷人工林生長緩慢,且經營管理粗放,林分質量普遍不高[6],同時病害對木荷人工林的危害極大[1,7],雖然可以采取一些化學防治手段進行防治,但是仍然缺乏有效的高通量控制手段。

植物抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)主要是指由植物所產生的能夠抵抗外界侵害的小分子多肽,被認為是最快速、普遍、直接和持久的對抗細菌、真菌、病毒等微生物以及各種動物和昆蟲的屏障之一[8-9]。AMPs具有廣泛的抗菌、抗真菌、抗病毒和抗癌活性,不僅可以作為直接殺微生物劑在宿主防御中發揮作用,而且還可以作為調節劑間接調節宿主免疫應答[10]。因此AMPs可以成為傳統抗生素的一個很有前景的替代品[11]。近年來AMPs在多種農林作物中成功應用[12-16],成為高效、高通量、生態友好的抗病手段。

為驗證抗菌肽對木荷內環境的影響,本研究通過添加通用抗菌肽的方式處理2年生木荷幼苗,并對其微生物與代謝物內環境進行分析,探索抗菌肽影響木荷的分子機制,以期為防治木荷病害及持續經營木荷人工林的生產實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于福建省泰寧國有林場,地處福建省西北邊陲泰寧縣(26°54′6.2928″N、117°11′29.4936″E),毗鄰江西省的南豐、廣昌、黎川等地,地形突兀,四周高中間低,呈階梯式下降,海拔305—328 m,坡向西南,坡度18°左右。屬于亞熱帶季風氣候,表現出明顯的山地氣候特點,氣溫較低,冬季寒冷,夏季晝夜溫差大。年均氣溫18 ℃,極端最高溫40 ℃,極端最低溫-11 ℃,年均降水量1765 mm,年積溫5000 ℃左右,適合林木生長發育。

1.2 樣本采集與處理

2021年11月,將2年生長勢均衡、健康程度良好的木荷幼苗按照種植區域分為2部分;一部分葉片噴灑500倍抗菌肽雙蒸水稀溶液作為處理組(T),另一部分在葉片噴灑雙蒸水作為對照組(CK),以葉片開始有水珠滴下為準?？咕挠筛＝ㄞr林大學海峽聯合研究院提供。

于2021年12月,采用五點取樣法,在處理和對照組內分別采集10株木荷幼苗,進行表面消毒,先用75%的乙醇表面消毒1 min,迅速用無菌水涮洗3～5次;然后用30%的雙氧水浸泡15 min;再次用無菌水涮洗3～5次,擦干表面水分,編號后封存于保鮮袋放入干冰中帶回實驗室,放于-80 ℃保存。

1.3 宏基因組學分析

1.3.1 DNA提取 將1.2中保存的木荷幼苗樹干上、中、下部位各5 cm以及全部根部和葉片放入液氮中,按照MoBio DNA Isolation Kit(12855-50,MoBio,美國)說明書提取樣品DNA。使用NanoDrop 2000 spectrophotometer(Thermo Fisher Scientifific,美國)測量DNA質量。在1%瓊脂糖凝膠上檢查DNA的完整性。提取的DNA在-80 ℃儲存。

1.3.2 高通量測序 用Covaris ultrasonic crusher將DNA剪切至300 bp,對片段進行末端修復、A尾處理和Illumina兼容接頭的連接處理。DNA測序文庫在Allwegene公司(北京)的Illumina Hiseq平臺上進行測序。運行后,使用Illumina分析管道版本2.6執行圖像分析,基數調用和錯誤估計。

1.3.3 數據分析 原始數據的質量控制使用Trimmomatic[17]進行,包括刪除適配器序列和低質量讀取。如果讀數與適配器序列,N(不確定堿基)比率大于1%,低質量堿基(Q≤20)含量大于50%,則過濾讀數;并過濾掉質量控制后長度仍小于150 bp的讀數。

將高質量序列與NR數據庫進行比較,并使用diamond DIAMOND[18]工具將其分類為不同的分類群。使用MEGAHIT[19]組裝測序數據,過濾掉低于500 bp的重疊群。使用Prodigal software[20]注釋重疊群以預測開放閱讀框(ORF),并使用CD-HIT軟件[21]構建非冗余基因集。參照Bowtie等[22]將測序數據與非冗余基因集進行比較,統計不同樣本中基因豐度信息。通過搜索功能注釋數據庫KEGG,COG/KOG,GO,CARD和CAZyme來注釋基因功能。

1.4 代謝組學分析

1.4.1 代謝物提取 將1.2中保存的木荷幼苗樹干上、中、下部位各5 cm以及全部根部和葉片放入液氮中,然后按照De VR等[23]描述的方案提取代謝物,設置3次技術性重復。

1.4.2 超高效液相色譜-質譜-質譜分析 使用配備Waters ACQUITY UPLC BEH酰胺柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)的安捷倫1290 Infinity Ⅱ系列UHPLC系統(安捷倫科技公司)進行分離[24]。流動相A為甲酸銨10 mmol·L-1、氨10 mmol·L-1,流動相B為乙腈。色譜柱溫度設置為35 ℃、自動取樣器溫度設置為4 ℃、注射量為1 μL[25-26]。

1.4.3 數據分析 將在>50%的實驗樣品中檢測到的代謝物特征從數據分析中刪除;采用內標歸一化方法,將原始數據的缺失值按最小值的一半補齊;將相對標準差(relative standard deviation,RSD)大于30%的特征從后續分析中刪除。得到的涉及峰號、樣品名稱和歸一化峰面積的三維數據被送入R軟件包MetaboAnalystR進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal least squares discriminant analysis,OPLS-DA)。PCA顯示了樣品數據的分布。為了獲得更高水平的群體分離,并更好地了解負責分類的變量,應用監督下的OPLS-DA,然后計算R2和Q2的值。R2表示一個變量的變化被解釋的程度,Q2表示一個變量被預測的程度。之后,為了檢查OPLS-DA模型的穩健性和預測能力,進一步進行了200次置換。為了完善這一分析,得到預測變量重要性的第一個主成分(Variable importance in the projection,VIP)。VIP值概括了每個變量對模型的貢獻,VIP>1且P<0.05(t檢驗)和(FOLD CHANGE<0.67或FOLD CHANGE>1.5)的代謝物被認為是顯著變化的代謝物。此外,利用商業數據庫,包括KEGG(http://www.kegg.jp)和MetaboAnalyst(http://www.metaboanalyst.ca/)來搜索代謝物的路徑。

2 結果與分析

2.1 微生物組學分析

2.1.1 微生物群落多樣性分析 Alpha多樣性可以反映微生物群落的豐度度和均勻度[27],外源施加抗菌肽后的木荷通過宏基因組測序分析(圖1)表明,處理組的Shannon指數、Simpson指數、Invsimpson指數均顯著高于對照組,說明施加抗菌肽顯著提升木荷體內微生物的多樣性和物種集中性。

不同小寫字母為在P<0.05水平上差異顯著(t檢驗)。圖1 不同處理條件下微生物群落的α多樣性指數box圖

2.1.2 微生物群落組成 通過宏基因組測序分析得到的有效序列注釋結果,共得到2個界、30個門、60個綱、98個目、167個科、320個屬、932個種,根據樣品物種注釋的結果,選取各樣品在目水平上相對豐度高于1%的物種,生成物種累積相對豐度圖,以便更加直觀地了解施加抗菌肽前后的木荷在目分類水平上相對豐度含量較高的菌種及分布的優勢菌種。結果表明,施加抗菌肽前后的木荷在目水平(圖2)主要分布有腸桿菌目(Enterobacterales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、生絲微菌目(Hyphomicrobiales)、紅細菌目(Rhodobacterales)、芽孢桿菌目(Bacillales)以及球囊霉目(Glomerales)。

圖2 不同處理條件下相關微生物群的樣本目分類聚類柱狀圖

左邊為樣本間層次聚類分析;右邊為樣品的群落結構柱狀圖;橫坐標為物種在該樣本中的相對豐度;縱坐標為樣本名稱。圖3 不同處理條件下相關微生物群的屬分類聚類柱狀圖

2.1.3 微生物群落功能 利用Diamond軟件將非冗余基因集序列與KEGG數據庫進行基因同源性比對,對施加抗菌肽前后的木荷體內的功能基因進行注釋。根據所有樣品在KEGG數據庫中的功能注釋和豐度信息繪制顯著差異功能熱圖(KEGG選取第3層級進行展示),并從功能和樣品2個層級進行聚類(圖3)。處理組有6條通路豐度比較高:糠醛降解通路(Furfural degradation),神經活性配體-受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction),鐵載體基團非核糖體肽的生物合成(Biosynthesis of siderophore group nonribosomal peptides),金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureus infection),鞘糖脂生物合成-神經節系列(Glycosphingolipid biosynthesis-ganglio series),糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定蛋白(Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins)。對照組有4條通路豐度比較高:二萜類生物合成(Diterpenoid biosynthesis),脂肪酸碳鏈延長(Fatty acid elongation),凝集素(Lectins),維生素的消化和吸收(Vitamin digestion and absorption)。

2.2 代謝組學分析

基于非靶向代謝組技術的代謝分析,在不同處理的木荷幼苗中共檢測到2072個代謝物。采用UHPLC-MS/MS檢測平臺、本地數據庫以及多元統計分析相結合的手段研究樣品間的代謝物差異。

OPLS-DA是一種有監督的判別分析統計方法。通過建立的判別模型,可以最大程度地反映分類組別之間的差異,從數據集中篩選出與分組相關的差異代謝物。從圖4可以看出,2組樣本得分差異顯著[12],樣本全部處于95%置信區間(Hotelling′s T-squaredellipse)內。第一個主成分的貢獻率為84.7%,正交主成分得分為7.9%,2個貢獻率之和為92.6%。主成分分析表明,處理組與對照組差異顯著。

橫坐標T_score為第一主成分的預測主成分得分;縱坐標Orthogonal_T_score為正交主成分得分;散點形狀和顏色為不同的實驗分組。圖4 不同處理條件下代謝物的OPLS-DA圖

每個點代表1個代謝物;橫坐標為該組對比各物質的倍數變化(取以2為底的對數);縱坐標為t檢驗的P-value(取以10為底的對數)。散點顏色為最終的篩選結果,顯著差異上調的代謝物以紅色表示;顯著差異下調的代謝物以綠色表示;非顯著差異的代謝物為灰色。圖5 不同處理間差異代謝物篩選火山圖

橫坐標為每條通路的Impact;縱坐標為通路名稱。代謝通路分析結果以氣泡圖進行展示,氣泡顏色為富集分析的P-value,顏色越紅表示富集程度越顯著;點的大小為富集到該通路的差異代謝物的個數。圖7 不同處理的代謝通路分析

將篩選差異代謝物的結果以火山圖(volcano plot)的形式進行可視化,結果見圖5。共篩選到687個差異代謝物,其中上調的差異代謝物有233個,占比34%;下調的差異代謝物有454個,占比66%。

對OPLS-DA模型的變量重要性投影(VIP)進行多元分析有助于初步篩選不同物種之間的代謝物。同時,結合單變量分析的P值和倍數變化(差異倍數變化值),進一步篩選品種間不同的代謝物,不同代謝物的VIP值顯示前20個代謝物中,不同樣本間差異較大(圖6)。

根據上述富集結果,繪制富集到的KEGG通路的氣泡圖(只展示top20的結果),見圖7。其中差異代謝物主要富集在ABC轉運蛋白(ABC transporters)通路,花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)通路,類黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)通路,苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)通路等。

通過以上分析得到的差異代謝物,在生物學上往往具有結果和功能相似性或互補性,或者受同一代謝通路的正調控或負調控,表現為在不同試驗組間具有相似或相反的表達特征。對這類特征進行層次聚類分析,有助于將具有相同特征的代謝物歸為一類,并發現代謝物在試驗組間的變化特征。同時,聚類熱圖分析顯示組內誘導代謝物的組成相似。處理組誘導的代謝物與對照組組成不同,這與抗菌肽的功能特點高度相關(圖8)。

圖中橫坐標為不同樣本;縱坐標為所有組合的差異代謝物;不同位置的色塊為對應位置代謝物的相對表達量。 圖8 不同處理的所有差異代謝物的層次聚類分析熱圖[17]

3 結論

抗菌肽是天然防御病原體的重要組成部分。這些肽的抗菌作用機制通常更為復雜。為了進一步研究抗菌肽在木荷中的功能,通過添加抗菌肽[19]后研究木荷體內的微生物和代謝物的變化來探討抗菌肽對木荷影響的分子機制。

結果發現施加抗菌肽后,處理組的Alpha多樣性顯著高于對照組,說明施加抗菌肽后木荷體內的微生物的豐富度和均勻度顯著上升且物種集中性更高,這與Bleecker等[28]的研究結果相反,進一步說明抗菌肽在木荷體內對細菌和真菌的病原體有抗性,具有抗菌的功能。在目分類學水平上,施加抗菌肽后木荷體內的優勢菌目腸桿菌目、伯克氏菌目、生絲微菌目、紅細菌目、芽孢桿菌目以及球囊霉目豐度顯著(P≤0.05)升高。腸桿菌(Enterobacter)是溶磷菌的主要類群之一,有研究報道陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)是目前研究最廣的種類,具有溶磷、分泌ACC轉氨酶、合成植物激素IAA及防治病害等多種促生功能[29-31]。伯克氏菌目的細菌類群具有固氮和降解芳香族化合物的功能[32],近年來被認定是有益的微生物群落,但也是潛在的致病性微生物[33];伯克氏菌目和假單胞菌目已經被證實對某些細菌和真菌病原體具有高效的拮抗作用[34-35],因此,該細菌在病原菌的防御以及維持細菌群落穩定方面具有重要作用[36]。研究表明生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)和伯克氏菌科(Burkholderiaceae Comamonadaceae)均具有較強的固氮功能,可吸收利用大氣中N2,說明固氮微生物可能在全氮和堿解氮含量較低的CK處理中具有較強的競爭力[37]。研究表明多粘類芽孢桿菌廣泛生存在各種作物的土壤、根系、根際中,包括小麥、玉米,高粱、甘蔗和大麥中,其對多種植物病害具有良好的防控效果,被廣泛運用在農業生產中[38],這與Das等[39]的研究結果相似,進一步說明抗菌肽在木荷體內的抗菌性,因此被認為是基本的、可誘導的植物防御屏障的組成部分[40]。芽孢桿菌目是農田土壤中的典型有益微生物種群,含有大量植物促生功能菌、病原拮抗菌等,可提高植物獲取營養物質的效率,促進植物生長,同時抑制土傳病原微生物侵染[41]。這與Dumas等[42]、Lix等[43]的研究結果相似,說明施加抗菌肽后木荷的抗逆性明顯提高,有助于木荷的生長發育。球囊霉科(Glomeromycota)是分布最為廣泛、研究最為深入的AM真菌,具有廣泛的環境適應性[44]。

本試驗對添加抗菌肽和對照組的木荷幼苗進行代謝物分析,結果發現:共篩選到687個差異代謝物,其中上調的差異代謝物有233個,占比34%;下調的差異代謝物有454個,占比66%。差異代謝物主要富集在ABC轉運蛋白通路、花生四烯酸代謝通路、類黃酮生物合成通路、苯丙烷類生物合成通路等。其中,ABC轉運蛋白是廣泛存在于原核和真核生物中的膜整合蛋白,它利用水解ATP的能量進行細胞膜的主動運輸功能[45],涉及到主動向胞外排放種類繁多的內源或外源毒素。主要包括真菌自身產生的侵染寄主植物所需的真菌毒素,土壤環境中有毒重金屬元素,其它拮抗微生物所產生的抗生素,化學合成的農藥和植物防御性物質。

在各種生理性刺激作用下,細胞膜磷脂被磷脂酶A2脂解釋放出花生四烯酸(AA),AA調節多種脂質信號介質的生理反應和病理過程,并控制重要的細胞過程,包括細胞增殖、凋亡、代謝和遷移[46]。法博濤[47]已經證明了其具有促炎癥和促細胞凋亡作用,花生四烯酸可以被代謝為促炎性分子和抗炎性分子,薩仁圖雅等[48]已經證明花生四烯酸在生物體內含量最豐富,其代謝產物最具有生物活性的小分子物質之一,在眾多生理及病理過程中發揮重要的調節作用。

在植物體中類黃酮合成途徑是目前研究最為清楚的次生代謝途徑,類黃酮物質在植物體內具有重要的生理意義,在植物的授粉、抗病蟲害、抵御紫外輻射、與微生物的信號傳遞等諸多方面發揮重要作用[49-50]。周科等[51]已經證明合成物質具有抗病性的生物合成通路:類黃酮生物合成通路與植物抗逆境脅迫直接相關。

苯丙烷類生物合成途徑是植物3條主要次生代謝途徑之一,丙氨酸經多步催化反應生成4-香豆酸輔酶A,進入特異性合成途徑轉化成不同的苯丙烷類代謝產物,如香豆素、類黃酮、萜類、木質素、花青素等,在植物的生長發育過程及應答逆境脅迫中發揮重要作用[52]。這一結果與Wang等[53]的研究結果相似,能量和物質代謝是生物體基本的生命活動現象,這些代謝活動的強弱直接反應著植物的生存情況[54],說明添加抗菌肽有助于提高木荷體內的能量和物質代謝,從而提高木荷體內抗性。

木荷具有樹干端直、材質優良、生物防火、蓄水保肥等一系列優良特性,是很好的經濟和生態樹種。目前,木荷人工林管理粗放,經濟效益較差,抗病蟲害能力弱,針對木荷病害防治主要局限于其作為病原真菌的毒力因子在侵染寄主植物中的作用方面[55-56],以及植物病原真菌對各類殺菌劑的耐藥性問題。綜上所述,噴灑抗菌肽對防治木荷病害有顯著效果,這將為利用抗菌肽防治木荷病害及持續經營木荷人工林的生產實踐提供參考。