不同貯藏溫度對2種冬青花粉萌發力的影響

鄭永強,蘆 斌,洪春桃,魏 斌,沈登鋒,章建紅,潘存德

(1.新疆農業大學林學與風景園林學院,新疆 烏魯木齊 830052;2.寧波市農業科學研究院林業研究所,浙江 寧波 315040)

冬青屬(Ilex)植物株型優美,果色鮮艷,果量大,屬內有鐵冬青(Ilexrotunda)、無刺枸骨(I.cornuta′Fortunei′)等在園林中廣泛應用[1]。系統進化研究表明,冬青屬植物種間存在廣泛的基因交流和遺傳漸滲,種間生殖隔離不明顯。在冬青屬植物間開展雜交育種,聚合不同種間的優良性狀具有天然優勢。但由于冬青屬植物品種繁多,在雜交育種中經常會有花期不遇的情況。開展花粉貯存條件的研究,可以有效地解決這一問題。

花粉作為雜交育種的重要基礎材料,具有豐富的遺傳變異,是新種質創制的關鍵[2]。常用的花粉貯藏方法主要為低壓法、低溫干燥法、冷凍干燥法和超低溫法等[3-6]。以上貯藏方法主要通過溫度、空氣濕度等條件的調控抑制花粉呼吸作用,延長花粉活力。其中效果最佳的是超低溫貯存法,其常用于菌株、酶、DNA等生物活性物質的保存,且用于花粉貯存的研究比較全面[5-6];冷凍干燥貯存法與低溫干燥貯存法區別在于需要更低的溫度和濕度,一般于-20 ℃左右貯存,比較經濟、簡便,應用廣泛。不同貯藏溫度對于不同種花粉的影響存在差異,且活力變化曲線也存在差異[7-9]。因此,本文對全緣冬青(I.integra)和枸骨2種鄉土冬青屬植物的花粉萌發和貯藏溫度進行研究,以期解決由遺傳差異造成的不同種間花期不遇而影響雜交育種的問題,為冬青雜交育種中花粉活力檢測及保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于寧波市農業科學研究院高新農業技術試驗園區(121°41′E、29°48′N),屬亞熱帶季風氣候,夏季高溫多雨,冬季寒冷干燥,全年降水量充沛。以園區內全緣冬青和枸骨15 a植株的花粉為試驗材料。選擇在盛花期(2022年3月24日)進行花粉采集,用修枝剪剪取生長健康、花朵發育良好、花量大的雄花枝,帶回實驗室置于陰涼干燥處水培,于25日7∶00使用鑷子、毛刷和毛筆等工具將待開放或剛開放的雄花置于鋪有硫酸紙的培養皿中收集花粉,然后置于2 mL的離心管中存放,至8∶00采集結束,并分成4份。

1.2 試驗方法

參閱文獻[7-10],采用離體萌發法,設置4種花粉貯藏溫度[7,10-13],即室溫(20～23 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃ 4種貯藏溫度處理;并根據花粉活力變化速度設置觀測點時間,詳見表1。

表1 不同處理花粉測定時間

花粉活力測定方法:采用優化后的培養基配方,蔗糖100 g·L-1+硼酸10 mg·L-1+瓊脂0.5%,將pH值調至7.0[13-14]。用玻璃棒蘸取少許融化后的培養基,均勻涂抹在雙凹載玻片的凹陷區域,用毛筆蘸取充分混合后的花粉,均勻撒播于培養基表面。將玻片置于鋪有2層濕濾紙的培養皿中,外部包裹錫紙避光處理,放入28 ℃的培養箱中培養24 h,使花粉管充分萌發。

花粉管充分萌發后,用40×顯微鏡觀察(蔡司Axio Scope.A1),統計花粉萌發率和評價花粉活力?；ǚ酃苊劝l長度大于或等于花粉粒直徑作為判斷花粉萌發的標準[8,10-11]。每個載玻片取5個視野計數;萌發率計算公式為:萌發率(%)=已萌發的花粉粒數 / 測定的花粉?？倲怠?00。

1.3 數據處理

數據采用Excel 2021計算和分析,利用Origin pro 2021進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏溫度對枸骨花粉萌發率的影響

新鮮枸骨花粉的初始萌發率為89.1%。由圖1可知,在4種溫度條件下貯藏的枸骨花粉,其萌發率隨著時間的延長均呈現不同程度的下降。在室溫條件下貯藏3、7 d時萌發率分別為79.3%、44.1%,基本可以滿足短期內的生產需求。在4 ℃條件下,貯藏4～7 d的萌發率在71.6%～60.4%之間,均高于室溫保存;但卻在貯存14 d后迅速下降,16 d時達到最低值(12.6%)。-20 ℃低溫貯藏下,花粉萌發率在120 d內保持著較高的萌發率水平;但在貯藏140 d時迅速下降,萌發率從60.8%(30 d)降至4.4%(140 d),無法滿足育種需要。-80 ℃超低溫貯藏,60 d時萌發率為63.54%,顯著低于初始萌發率;然后緩慢下降至130 d時的33.58%;之后花粉萌發率急劇下降至140 d時的2.87%。

不同小寫字母為在相同溫度貯藏條件下不同時間萌發率差異顯著,下同。

對比枸骨花粉在4種貯藏溫度下隨著貯藏時間變化的萌發率可以看出,貯藏于-20 ℃和-80 ℃條件下花粉活力長時間保持較高活力,在這2種溫度條件下貯藏枸骨花粉可以有效減少花粉萌發力下降,延長花粉貯藏時間。

2.2 不同貯藏溫度對全緣冬青花粉萌發率的影響

全緣冬青新鮮花粉的初始萌發率為86.1%。由圖2可知,在4種溫度條件下貯藏的全緣冬青花粉,其萌發率隨著時間的延長均呈現不同程度的下降。貯藏在室溫下的花粉在第6 d時已下降至15.7%,基本失去應用價值。在4 ℃低溫條件下貯藏4 d時花粉萌發率為71.9%,顯著低于初始萌發率;至16 d時萌發率下降至14.6%,顯著低于相同溫度條件下其它時間的萌發率。-20 ℃貯藏條件下,貯藏30 d時花粉萌發率為68%,顯著低于初始萌發率;貯藏60、90、110 d時花粉萌發率分別為54.3%、51.4%、42.8%,下降較為緩慢;至140 d時花粉萌發率為4.01%,下降速度較快。-80 ℃貯藏條件下,貯藏60、110 d時萌發率分別為55.3%、44.2%,顯著低于初始萌發率;至140 d花粉萌發率為2.97%,基本失去生活力。

圖2 全緣冬青花粉不同貯存溫度萌發率的變化情況(A:室溫;B:4 ℃;C:-20 ℃;D:-80 ℃)

全緣冬青花粉萌發率在不同貯藏溫度條件下的下降趨勢總體與枸骨相同。不同的是,在室溫條件下全緣冬青花粉貯藏6 d時萌發率就達到極低的水平,枸骨則是在7 d時仍有較高的萌發率;但全緣冬青在貯藏90 d后出現-20 ℃條件下的花粉萌發率均高于-80 ℃的現象,如貯藏120、130 d時,-20 ℃條件下貯藏的萌發率分別為36.3%、32.6%,-80 ℃條件下貯藏的萌發率分別為29.4%、27.1%,說明全緣冬青花粉較適合在-20 ℃條件下貯藏。

3 結論與討論

冬青不同種間的花期差異較大,如貝爾奇卡金(I.×altaclerensis′Belgica Aurea′)、牢蘇尼阿納(I.×altaclerensis′Lawsoniana′)、金皇帝(I.×altaclerensis′Golden King′)3種哈克勒雷冬青的盛花期較枸骨、全緣冬青晚10～15 d,在3月底或4月初左右,如進行雜交育種,則會碰到花期不遇的問題。從本試驗結果來看,常溫儲藏下枸骨和全緣冬青只能在3 d內保持較高的花粉活力水平。李修鵬等[11]和吳月亮等[12]研究發現華頂杜鵑(Rhododendronhuadingense)和文冠果(Xanthocerassorbifolia)的花粉常溫貯藏時的生活力均不能滿足實際生產需求,與本試驗結果相類似。

研究表明,低溫貯藏對于保持花粉活力具有重要作用。李振勤等[8]研究表明相同時間下低溫冷藏保存的滇山茶(Camelliareticulata)花粉萌發率顯著高于常溫保存,且梅紅品種的花粉萌發率隨著保存溫度的下降而顯著上升;4個桑樹品種花粉研究也有同樣的趨勢,花粉活力是隨著儲藏溫度的降低而升高[15]。本研究結果表明,在4 ℃低溫條件下貯藏的2種冬青的花粉保存時間僅16 d,-80 ℃條件下的枸骨花粉和-20 ℃條件下的全緣冬青花粉貯藏90 d時萌發率均在50%以上,3種低溫條件下的花粉萌發率顯著高于室溫,這與李振勤等[8]的研究結果相一致。但是在貯藏90 d后,全緣冬青表現出-80 ℃貯藏的花粉萌發率低于-20 ℃的情況,與李振勤等[8]和陳怡等[15]的研究結果(花粉保存活力是隨著儲藏溫度的降低而升高)不一致,這可能與物種或花粉對于溫度劇烈變化的敏感性有關。本研究中2種冬青花粉萌發率比郭娟等[10]研究的4種冬青(短梗冬青(I.buergeri)、全緣冬青、大別山冬青(I.dabieshanensis)、大葉冬青(I.latifolia))采用離體萌發法在4、-20 ℃條件下的萌發率都要高,比李修鵬等[11]研究的華頂杜鵑的萌發率要低,表明花粉的保存期限也因植物種類和貯藏條件的不同存在較大差異[12],且充分說明貯藏溫度是影響花粉萌發力的重要因素[16]。因此,雖然在室溫條件下2種冬青花粉均不能保存較長時間,僅可用于花期鄰近(相差3 d以內)物種的雜交育種;在生產應用上短期(30 d)保存2種冬青都可以采用-20 ℃低溫貯藏;長期(60～90 d)保存,枸骨采用-80 ℃低溫貯藏,全緣冬青可采用-20 ℃低溫貯藏?？紤]到實際具備條件和能耗問題,建議均選擇-20 ℃低溫保存。