腐植酸+黃腐酸緩解Cd 對獨行菜植株生長、生理和生化特性的不利影響

ErtanYildirim Melek Ekinci MetinTuran GülerayA?ar Atilla Dursun，4 Raziye Kul ZeynepAlim Sanem Argin 著 牛華琳 莊 琪 譯

1 土耳其阿塔圖爾克大學農學院園藝系 埃爾祖魯姆 25240

2 土耳其耶迪特佩大學遺傳學和生物工程專業 伊斯坦布爾 34755

3 土耳其阿塔圖爾克大學生物系 埃爾祖魯姆 25240

4 吉爾吉斯斯坦-土耳其瑪納斯大學園藝和農學系 比什凱克 720001

5 土耳其耶迪特佩大學農業貿易和管理部 伊斯坦布爾 34755

6 山西農業大學園藝學院 晉中 030600

土壤和水是寶貴的自然資源，對農業的可持續發展至關重要。然而，人類活動嚴重地破壞和污染了土壤和水。其中一個主要問題是污水和工業廢物排放到農業地區，造成各種威脅，使環境受到重金屬、鹽類和硝酸鹽的污染（Achakzai 等，2011）。重金屬對食物鏈造成的污染是一個嚴重的問題，因其高毒性對植物、動物和人類健康構成了威脅（Masindi 等，2018）。

植物有通過其根部吸收各種金屬的自然傾向。其中一些是植物的基本微量元素，如Cu2+、Co2+、Fe2+、Mo2+、Mn2+和Zn2+，而Hg2+、Cd2+、Ni2+和Pb2+等則會對植物造成危害。金屬對植物的影響因基因型而異（Medyńska-Juraszek 等，2020），其毒性取決于離子類型、離子濃度、植物種類和植物生長階段（Memon 等，2009；Liu 等，2020）。

在通常被稱為“重金屬”的污染物中，鎘（Cd）是一個主要問題，因為它在植物-土壤系統中具有流動性。盡管Cd 在環境中自然存在的量很?。?.04 ～0.32 mmol），但農業應用的殺蟲劑、磷酸鹽肥料、非農業產業的落塵和生物固體使土壤中富含這種元素（Monteiro 等，2009）。Cd 的流動性很強，很容易被植物所吸附（Ismael 等，2019）。Cd 特別危險，因為生長在受污染土壤中的植物可能在沒有任何明顯跡象的情況下大量吸收Cd，并通過喂食進入人體（Dobrikova 等，2021）。因此，植物的低Cd 攝入量以及植物對Cd 污染的生理反應對保護生物多樣性和食品安全至關重要。

腐殖物質是重要的有機材料，直接或間接地影響植物生長，改善土壤的物理和化學特性，增加植物產量。一旦這些物質與金屬形成化合物，其溶解度和生物利用率就會改變。腐殖物質和有毒的重金屬離子之間形成的強鍵在植物生產中起著重要的作用，可以減輕重金屬脅迫對植物發育的負面影響（Ozkay 等，2016）。

與其他蔬菜品種相比，葉菜是高金屬離子積累器（Alexander 等，2006）。獨行菜（Lepidium sativum）是一種主要生長在溫帶地區的多葉蔬菜。自古以來，獨行菜的種子、葉、根和花都被用來治療各種疾病或病痛（Mukhopadhyay 等，2010）。早期的報道指出，獨行菜對Cd 脅迫敏感。然而，據我們所知，還沒有研究調查腐植酸（HA）+黃腐酸（FA）對在Cd 脅迫下獨行菜生長的影響。因此，本研究用4 種劑量的HA+FA（0、10、15 和20 mL/L）處理CdSO4?8H2O 污染的土壤（0、100和200 mg Cd/kg），以闡明HA+FA 對緩解Cd 脅迫、促進獨行菜植株生長和生理生化特性的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗設置

獨行菜在土耳其阿塔圖爾克大學的溫室里用聚乙烯盆種植。溫室溫度白天保持在22（±2）℃，夜間保持在17（±2）℃的平均溫度。本研究中使用的土壤是從土耳其埃爾祖魯姆?。?9°55′N，41°61′E）的農田中取樣，深度為15 cm。它在室內被烘干，直到可以通過4 mm 的篩子和2 mm的篩子，分別用于盆栽實驗和物理化學性質的分析。根據土壤分類學，該土壤被歸類為Ustorthents（土壤調查人員，1999）。土壤的成分是33%的沙、34%的淤泥、33%的粘土、1.2%的有機物。其他物理和化學性質為pH 值：5.61；陽離子交換容量：15.5 cmol（+）/kg；電導率：1.15 dS/m；總氮：1.15%；P：15.5 mg/kg；Zn：2.30 mg/kg；Cu：1.1 mg/kg；Fe：0.5 mg/kg；Mn：1.8 mg/kg；Cd：0.05 mg/kg；K：2.2 cmol(+)/kg；Ca：11.0 cmol(+)/kg；Mg：2.25 cmol(+)/kg。

對于重金屬脅迫處理，將鎘（CdSO4?8H2O）以3 種不同的濃度（0、100 和200 mg/kg）混入培養基，并培養3 周。

HA+FA 是由德國Humintech GmbH 提供的商品，即Powhumus。Powhumus的含量（干重%）如下。HA+FA：80% ～85%（HA90%，FA10%）， 鉀（K2O）：10% ～12%； 總有機氮：1.0%。 不溶性成分的顆粒大小為<100 μm，pH 值為9 ～10。Powhumus 的元素含量（%，質量）為C-32，H-2.8，N-1.3，灰分含量為22.9%。在無灰的基礎上的元素含量（% wt）為C-47.1；H-3.63；N-1.69；O-47.58。為了制備HA+FA（Powhumus）溶液，將350 g Powhumus 溶解在1 L 水中（350000 mg/L），然后稀釋以獲得3 種不同的濃度（3500、5250 和7000 mg/L）。HA+FA 溶液從種植的前一天開始每周3 次施于土壤中。使用0 mg/L HA+FA 作為對照，而150 ∶100 ∶150 kg/hm2的氮磷鉀被混合到培養基中作為基肥。

獨行菜的種子被播種在裝滿1 L 3 周培養的園土∶沙子（1 ∶1，v ∶v）混合物的花盆中，深度為1 ～1.5 cm，每盆有10 顆種子。出苗后，每盆留外觀相同的4 株小苗。

1.2 測定指標與方法

盆栽研究在種子播種后的第50 天結束。收獲時，從每個樣品中抽取4 株，測量莖粗、株高、葉片數、地上部和根部干鮮重。為了測定干重，植物材料在70 ℃下保存48 h。為了測定脯氨酸、蔗糖、丙二醛（MDA）、H2O2，以及抗氧化酶的活性，將大約20 g 的新鮮葉片在液氮中冷凍，然后在-80 ℃下儲存。分析是在一式四份的情況下進行的。

葉綠素讀取值（CRV 為SPAD 值）：植物葉片的葉綠素含量由葉綠素儀（SPAD-502，Konica Minolta Sensing, Inc，日本）測定。

葉面積：使用葉面積測量儀（CID-202 便攜式激光葉面積測量儀，CID 生物科學公司，美國華盛頓州）確定每次應用中植物的葉面積。

膜滲透性（MP）：MP 是根據Yildirim 等的方法測定的（Yildirim 等，2015）。

葉片相對含水量（LRWC）：LRWC 是根據Yildirim 等的方法測定的（Yildirim 等，2015）。

H2O2和MDA 分析：H2O2是根據Velikova 等（Velikova 等，2000）的方法測定的。H2O2的含量是通過使用先前由不同濃度的H2O2的標準校準曲線來計算的。MDA 含量是以硫代巴比妥酸反應性物質測量的，MDA 是脂質的降解產物，它可以確定脂質過氧化情況。通過使用155 mmol/L cm 的消光系數，從吸光度曲線上確定MDA 的濃度。

蔗糖和脯氨酸分析：蔗糖濃度由Chopra 等（Chopra 等，2000）給出的方法測量。脯氨酸的濃度是在520 nm處進行分光光度測定的（Dadasoglu等，2021）。

過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性：CAT、POD 和SOD 的活性是根據Sahin 等（Sahin 等，2018）給出的方法測定的。

礦物質分析：獨行菜的葉子在68 ℃的烘箱中干燥48 h 后被研磨。使用Vapodest 10 快速凱氏蒸餾裝置（Gerhardt，Konigswinter，德國），通過凱氏方法測定總氮。使用電感耦合等離子體分光光度計（Optima 2100 DV, ICP/ OES; Perkin-Elmer,Shelton, CT）來測定組織的P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Cl 和Cd（Mertens 等，2005；Mertens 等，2005）。

1.3 數據分析

在實驗中，采用了隨機小區設計，并使用SPSS 20 統計包程序對獲得的數據進行了分析。對數據進行了方差分析（ANOVA），并通過Duncan多重比較試驗確定了平均值的差異。

2 結果

從表1 可以看出，在Cd 脅迫條件下，施用HA+FA 對獨行菜的葉鮮重、葉干重、根鮮重和根干重有明顯影響。我們的研究結果表明，Cd 污染對所有被調查的參數都有負面影響，而且負面影響隨著污染劑量的增加而增加。在沒有Cd 污染的情況下，當HA+FA 的應用濃度為7000 mg/L 時，植物的葉鮮重和葉干重最高；而當HA+FA 的應用濃度為3500 mg/L 時，根鮮重和根干重最高。這些發現表明，在沒有Cd 污染的情況下，與對照組（HA+FA=0 mg/L）相比，應用7000 mg/L HA+FA時，葉片鮮重和干重分別增加了35%和30%，而應用3500 mg/L HA+FA 時，根部鮮重和干重增加了33%和15%。

表1 Cd 和HA 的施用對獨行菜的葉鮮重、葉干重、根鮮重和根干重的影響Tab.1 Eff ects of cadmium and HA applications on leaf fresh, leaf dry, root fresh and root dry weight of garden cress

在Cd 污染下，葉鮮重、葉干重、根鮮重和根干重都受到了負面影響。然而，HA+FA 的應用減輕了Cd 對植物的有害影響。在200 mg/kg 的Cd 污染下，與對照組相比，濃度為7000 mg/L 的HA+FA 應用使葉鮮重、葉干重、根鮮重和根干重分別增加了262%、137%、550%和133%（表1）。

表2 顯示了HA+FA 的應用對Cd 脅迫下的獨行菜的莖粗、葉面積和CRV 的影響。Cd 污染顯著降低了獨行菜的莖粗、葉面積和CRV。最負面的影響發生在200 mg/kg 的Cd 污染。然而，HA+FA的應用減少了100 和200 mg/kg 的Cd 脅迫對獨行菜的負面影響。在200 mg/kg 的Cd 污染下，與對照組相比，施用濃度為7000 mg/L 的HA+FA，莖粗、葉面積和CRV 分別增加了92%、104%和34%。

表2 Cd 和HA 的施用對獨行菜莖粗、葉面積、CRV、MP 和LRWC 的影響Tab.2 Eff ects of cadmium and HA applications on stem diameter, leaf area, CRV, MP and LRWC of garden cress

此外，Cd 污染增加了獨行菜的MP 值，同時降低了LRWC值。植物在僅200 mg/kg的Cd處理下，其MP 值最高，LRWC 值最低。而HA+FA 的應用緩解了Cd 對獨行菜的不利影響，在200 mg/kg Cd污染下，7000 mg/L 的HA+FA 處理，與對照組相比，MP 和LRWC 值分別增加了537%和32%。

由表3 可知，CAT、POD 和SOD 活性隨著Cd 污染的增加而增加。在200 mg/kg Cd 污染下，7000 mg/L HA+FA 的處理，與未施用HA+FA 的處理相比，CAT 和SOD 活性分別下降了43%和21%，而POD 活性則提高了186%。盡管獨行菜在200 mg/kg 的Cd 污染處理下獲得了最高的H2O2、MDA、脯氨酸和蔗糖值，但濃度為7000 mg/L 的HA+FA 處理成功緩解了200 mg/kg Cd 脅迫帶來的有害影響，使H2O2、MDA、脯氨酸和蔗糖值分別下降66%、68%、70%和56%（表3）。

表3 鎘和HA 的施用對獨行菜CAT、POD、SOD、H2O2、MDA、脯氨酸和蔗糖的影響Tab.3 Eff ects of cadmium and HA applications on CAT, POD, SOD, H2O2, MDA, proline and sucrose activities of garden cress

由表4、表5 可知，除了Cd 元素外，Cd 污染減少了獨行菜其他礦物元素含量。而在施用HA+FA 后，除了Cd 元素外，其他礦物元素的含量都得到了提高。N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、B 和Cl 都在沒有Cd 污染與7000 mg/L HA+FA 的處理下得到了最高值，在200 mg/kg 的Cd 與0 mg/L HA+FA 的處理下得到了最低值。7000 mg/L HA+FA 的處理成功緩解了Cd 脅迫帶來的有害影響，與對照組相比，N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn 和B 分別增加了75%、23%、84%、87%、40%、85%、143%、1%、65%和115%。另一方面，7000 mg/L HA+FA 的處理成功減少了獨行菜對Cd 和Cl 的吸收，與對照組相比，分別減少了95%和80%。

表4 Cd 和HA 的施用對獨行菜宏觀元素含量的影響Tab.4 Eff ects of cadmium and HA applications on macro element content of garden cress

表5 Cd 和HA 的施用對獨行菜微量元素含量的影響Tab.5 Eff ects of cadmium and HA applications on micro element content of garden cress

3 討論

重金屬會對植物造成有毒影響，如缺綠病，抑制生長和光合作用、水分平衡的變化和營養物質的攝入，最終導致植物死亡（Singh 等，2016）。重金屬的毒性通過4 個可能的機制在植物中表現出毒性，它們是（i）在根表面與營養陽離子競爭吸附（例如，As 和Cd 分別與P 和Zn 競爭吸附）；（ii）直接相互作用使巰基（-SH）失活，破壞了植物的結構和功能；（iii）通過取代特定結合位點的必需陽離子來破壞酶的功能；以及（iv）產生活性氧（ROS），最終損害大分子（Sharma 等，2009）。

Cd 被認為是一種重要的污染物，因為它具有高毒性和高水溶性。Cd 可以通過其對土壤中礦物質的影響或通過減少土壤微生物的數量來改變礦物的吸收。Cd 可能對氣孔導電性、排汗和光合作用產生負面影響。萎黃、葉褶皺和矮小是植物Cd 中毒的常見和易見的癥狀。Cd 還通過抑制硝酸還原酶活性來減少硝酸鹽的攝取以及其從根部到枝條的運輸（Prerna 等，2019）。

在本研究中，發現Cd 脅迫對獨行菜的生長有負面影響（表1）。Cd 脅迫下生長的獨行菜雖然其LRWC 減少，但是MP 增加（表2）。同樣，以往的研究表明Cd 脅迫對蘿卜（Farouk 等，2011）、 獨行菜（Pavel 等，2013；Pirdosti 等，2018）和萵苣（Loi 等，2017）的植株生長特性有負面影響。

另一方面，在Cd 脅迫下生長的獨行菜中施用HA+FA 對其生長有積極影響（表1）。此外，HA+FA 的施用增加了獨行菜的LRWC，減少了MP（表2）。同樣，在以前的研究中，HA+FA的應用減輕了重金屬脅迫對萵苣（Haghighi 等，2010）、蘿卜（Farouk 等，2011）、卷曲萵苣（Ozkay等，2016）、三葉草（Sergiev 等，2012）、玉米（Chaab 等，2015）和小麥（Rashid 等，2018）植株生長特性的負面影響。腐殖物質是存在于腐殖質中的天然有機聚電解質，它可以穩定土壤中的有機質。許多研究者曾經報道，腐殖物質能夠促進植物在不同脅迫條件下的生長（Sergiev 等，2012）。HA+FA 通過改善土壤的一些物理和化學特性，直接或間接地影響植物生長和產量。此外，HA+FA改變了有毒重金屬的溶解度和生物利用率，通過強鍵與它們形成化合物，從而減少重金屬對植物生長的脅迫（Ozkay 等，2016）。與重金屬形成的這些強鍵是HA 和FA 的陽離子交換能力（CEC）的結果。由于其結構中含有大量的羧基和酚羥基，腐殖物質具有很高的陽離子交換能力，HA 和FA的陽離子交換能力分別為600 ～890 cmol(+)/kg 和1000 ～1230 cmol(+)/kg（Conte 等，2005；Tan 等，2014）。這些能力是普通粘土礦物的5 至100 倍，這使得腐殖物質成為完美的穩定劑。此外，盡管有各種方法和技術被用于穩定Cd、Pb、Cu 和Zn，但是應用腐殖物質是唯一的非化學和自然方法。

本研究中，在沒有Cd 脅迫的情況下，應用HA+FA 沒有觀察到CAT 活性的變化。另一方面，Cd 脅迫對CAT 活性的影響隨對照組（HA+FA=0）所應用的Cd 濃度而變化，即當Cd 污染水平為100 mg/kg 時，CAT 活性下降，但當Cd 濃度變為200 mg/kg 時，CAT 活性上升。盡管CAT 活性在200 mg/kgCd 污染的對照組中達到了非常高的水平（約90 EU/gr leaf），但施用濃度為7000 mg/L 的HA+FA 后，CAT 活性明顯下降，甚至下降到低于沒有Cd 脅迫時的水平（約75 EU/gr leaf）（表3）。

本研究結果也表明，Cd 脅迫條件下增加了獨行菜的POD 和SOD 活性，而在HA+FA 處理下，POD 活性得到大幅度增加，SOD 活性下降（表3）。

不同的研究表明，各種環境脅迫（鹽度、缺水和重金屬）會影響酶的活性（Shams 等，2020）。Shao 等（Shao 等，2008）表明，在脅迫條件下，抗氧化活性增強。另一方面，Sergiev 等（Sergiev 等，2012）認為，重金屬的應用對CAT 的活性沒有顯著影響，而對三葉草的SOD、GST（谷胱甘肽-S-轉移酶）和GPOX（愈創木酚過氧化物酶）活性卻有增加。這與我們的結果相似，Ozkay 等（Ozkay 等，2016）指出，重金屬脅迫增加了卷曲生菜的SOD活性，而HA 的應用支持了這種增加。有研究報告說，HA 作為活性氧的清除劑，它的應用導致了SOD 和GST 活性的進一步增加。HA 的這種積極作用很可能是由于其在營養介質或植物中形成了螯合絡合物。研究表明，HA 和FA 能有效地固定重金屬，并在礦物土壤中發揮更大的作用（Tang 等，2014）。且其固定能力與腐殖物質中添加的FA 含量直接相關。因為FA 的尺寸（分子量）較小，氧含量較高，是HA 的兩倍，所以其流動性較高。此外，由于在其結構中存在許多羧基（COOH）和羥基（COH）[范圍從520 到1120 cmol (H+)/kg]，FA的反應性更高，這使得FA 的交換能力是HA 的兩倍以上。

土壤中金屬的性能受到HA 和FA 施用的影響。HA 和FA 對土壤中Pb、Cd、Ni 的影響以及對植物的可利用性已經得到了廣泛的研究。但是，由于HA 和FA 的復雜性和土壤特性的巨大差異，目前已經報道出一些不一致的結果（Janos 等，2010；Topcuoglu 等，2012；Park 等，2012）。

早期的報道表明，HA 和FA 處理是通過影響土壤中可交換性的養分形態（Janos 等，2010），并減少Pb 和Cd 的積累來影響植物的（Kalis 等，2006）。在酸性土壤中，腐殖物質對重金屬有抑制作用（Bor?vka 等，2004；Rong 等，2020；Jiang等，2005；Wang 等，2017；Wu 等，2017）。 相反，在堿性土壤中發現腐殖物質會刺激金屬的可用性（Topcuoglu 等，2012；Park 等，2012）。這種矛盾可用腐植酸含量中未被注意到的FA 的作用來解釋。腐殖物質在低pH 值下對金屬有效性的抑制作用的根本原因是，金屬和FA 之間形成的鍵在酸性條件下占優勢。事實上，在腐殖物質中FA 含量為5%或更多的情況下，重金屬的結合和固定能力在中性和偏酸性土壤中特別高。相反，與FA 含量相比，HA 含量很高的腐殖物質會增加重金屬的可用性?？梢哉f，HA 對重金屬的生物修復是有效的，因為HA 可以與金屬相互作用，形成金屬-腐植酸復合物（Tang 等，2014）。另一方面，FA 有抑制金屬可用性的報道，可用于減少金屬在污染的酸性土壤中的積累。HA 對土壤中重金屬的存在有刺激作用并對堿性土壤中的金屬生物修復有很好的效果（Topcuoglu 等，2012；Park 等，2012）。

綜上，Cd 污染對植株鮮重和干重等生長參數有負面影響。然而研究發現，HA+FA 的施用可以減少這種負面影響，且HA+FA 的濃度為7000 mg/L 時效果最佳。本文結果表明，施用高比例的FA，即本研究中的10%，是緩解重金屬脅迫對植株生長不利影響的關鍵。

譯自：Scientif ic Reports，2021，11（1）：1 ～8。