UPLC-Q-TOF-MS/MS法定性和HPLC法定量分析菟絲子飲片成分

歐余航，張 寬，周 菲，許榕倩，吳金棟

（1.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州 350108；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR. Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子。菟絲子產地分布廣泛，具有補益肝腎、固精縮尿、安胎等功效，目前臨床常用于治療頭暈耳鳴、腰膝酸軟、陽痿遺精、胎動不安等癥狀［1-2］。菟絲子中主要含有黃酮類、有機酸、多糖、生物堿和氨基酸等多種物質成分［3-4］，其中黃酮、酚酸類等有效成分已證實具有抗衰老、抗氧化、保肝益腎增強免疫等作用［5-6］。

中藥菟絲子來源廣泛，質量參差不齊?！吨腥A人民共和國藥典》［1］以金絲桃苷（C21H20O12）含量不得少于干燥菟絲子樣品0.1%作為菟絲子飲片含量測定的質控標準；有文獻采用建立高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜法，對比樣品與指紋圖譜的相關性及差異性對菟絲子飲片質量進行評價［7］，但對于其中主要成分鑒別及含量測定并未進行明確檢測。本研究采用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對菟絲子飲片中分離度高、含量較大的成分進行定性分析，并建立上述成分HPLC 含量測定方法，進一步為菟絲子飲片的評價與質量控制提供數據依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀（美國Agilent Technologies 公司）和micro TOF Ⅱ［布魯克（北京）科技有限公司］；戴安U3000 高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；AL04 型萬分之一電子天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；SB-5200DT 超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料 菟絲子飲片購于安徽省萬生中藥飲片有限公司（產地：內蒙古），經福建中醫藥大學曾建偉副研究員鑒定為菟絲子Cuscuta chinensisLam.干燥成熟種子。對照品綠原酸（純度96.1%）、異槲皮苷（純度97.2%）、金絲桃苷（純度94.7%）、咖啡酸（純度99.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110753-202018、111809-201804、111521-201809、110885-201703）；對照品紫云英苷（純度98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：B21704）。甲醇、乙腈、磷酸和甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1 HPLC 色譜條件 大連依利特SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，7%～12%A；20～50 min，12%～15%A；50～60 min，15%～17%A；60～70 min，17%～17%A；70～90 min，17%～20%A；90～100 min，20%～30%A；流速1 mL/min；紫外檢測波長360 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS 條件 Acclaim UPLC RSLC 120 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）；流動相：乙腈（A）-0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～8 min，7%～7%A；8～20 min，7%～12%A；20～25 min，12%～15%A；25～30 min，15%～17%A；30～37 min，17%～20%A；37～42 min，20%～30%A；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫30 ℃。質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正（+）、負（-）離子模式；氣體流速10 L/min；源電壓3.5 kV；氣體流速10 L/min；噴霧干燥器溫度350 ℃；壓力30 psi；MSbreaking電壓1.0 V；掃描范圍100～1 500 U。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 菟絲子飲片粉碎，過四號篩，精密稱取菟絲子飲片（批號：200501）0.5 g，置于三角錐形瓶中，精密量取70%甲醇溶液50 mL 置于錐形瓶中，密封稱重后浸泡過夜，復稱后用70%甲醇溶液補足重量，置超聲提取器中超聲30 min（功率250 W，頻率50 kHz），置水浴鍋上揮干溶劑，70%甲醇溶液復溶，溶液定容至5 mL量瓶。靜置30 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品貯備液制備 精密稱取綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對照品適量，分別置于量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解后，再加甲醇定容，分別配置成濃度為0.216 0、0.200 0、0.208 0、1.452 0、0.200 0 mg/mL 的綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對照品貯備液，并置冰箱（2～8 ℃）保存。

2.2.3 混合對照品溶液制備 精密吸取“2.2.2”項下對照品貯備液：綠原酸500 μL、咖啡酸70 μL、異槲皮苷200 μL、金絲桃苷70 μL、紫云英苷300 μL，置同一量瓶，混合后配制成濃度分別為94.74、12.28、36.49、89.16、52.63 μg/mL 的綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷混合對照品溶液。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS 定性分析 按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下UPLCQ-TOF-MS/MS 條件進樣檢測，得到菟絲子飲片基準峰色譜圖，見圖1。對對照品、供試品溶液進行UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析，將得到化合物的［M+H］+、［M-H］-與文獻［8-11］中化合物進行信息比對，收集菟絲子飲片中所含化合物，匯總各化合物的名稱、分子式、分子量及化合物結構式等信息，計算正、負離子模式下的常見離子形態的精確質荷比。最終從菟絲子飲片中鑒定出5 個主要成分，與對照品比對確認，經Mass calculator 驗證，見表1。

表1 菟絲子飲片UPLC-Q-TOF-MS/MS 質譜分析結果

圖1 菟絲子飲片基準峰色譜圖

2.4 HPLC 定量分析

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，見圖2。供試品溶液與對照品溶液色譜峰的保留時間一致，且空白溶劑在相應保留時間無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 菟絲子飲片HPLC 圖譜

2.4.2 線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.3”項下混合對照品溶液各2.5、5、10、20、40 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。以進樣濃度（μg/mL）為橫坐標X，色譜峰面積（A）為縱坐標Y，結果如表2 所示。

表2 菟絲子5 個成分回歸方程及線性范圍

2.4.3 精密度試驗 精密稱定菟絲子飲片粉末（批號：200501）約0.5 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，連續進樣6 次。結果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的峰面積RSD 分別為0.74%、0.40%、0.49%、0.86%、0.76%，說明該色譜條件下儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取“2.4.3”項下供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的峰面積RSD 分別為0.79%、0.93%、0.77%、0.82%、0.75%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗 精密稱取菟絲子飲片粉末（批號：200501）6 份（約0.5 g/份），按“2.2.1”項下制備供試品溶液，依次進樣檢測，計算樣品中各組分含量。結果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的平均含量分別為0.691 3、0.061 4、0.528 5、1.107 3、0.629 9 mg/g，RSD 分別為0.49%、0.63%、1.04%、0.48%、0.53%，表明該方法的重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取菟絲子飲片粉末（批號：200501）6 份（0.5 g/份），分別精密加入與樣品含量近似相等的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，最終用70%甲醇定容于10 mL 量瓶。按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，計算各組分的加樣回收率和RSD。見表3。

表3 加樣回收試驗結果

2.4.7 樣品含量測定 取10個批次菟絲子飲片粉末（批號：200501、210401、210701、2003004、2007007、2011010、200901、200701、210601、201202），每個批次平行取樣3 份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，取混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL分別進樣，測定峰面積，按外標法計算不同批次樣品含量，各個批次樣品間各成分的含量差異較大。見表4。

表4 10 批次菟絲子飲片5 個成分平均含量測定結果 mg/g

3 討 論

中藥成分復雜多樣，有效成分難以全部明確，如何在成分不完全明確情況下對中藥進行質量評價顯得十分重要。目前研究對于菟絲子的成分分析，或通過HPLC 法比較保留時間一致性對成分進行定量測定［12］；或通過質譜檢測對菟絲子成分進行定性分析［13］，但未建立定量方法。本文通過質譜對菟絲子飲片中化學成分進行分析，通過數據庫、軟件對化學成分精確分子量、保留時間、碎片離子峰等信息進行比對，從中選擇含量較高且有文獻報道明確藥理活性的5 個化學成分，進一步通過對照品綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對結果進行驗證，保留時間、碎片離子峰等吻合，且通過質譜定性可排除保留時間相同但不同化學成分的干擾。在質譜基礎上，再應用HPLC 法建立菟絲子飲片中5 個成分的含量測定方法，為研究菟絲子的藥效物質基礎提供依據。

本實驗所測10 批樣品的5 個成分含量，批次間差異較大，黃酮苷中金絲桃苷、紫云英苷含量最高與最低相差近1 倍；咖啡酸的含量波動變化最大。根據樣品的含量測定結果，菟絲子飲片中黃酮苷的含量較大，又以金絲桃苷的含量最高。若以2020 版《中華人民共和國藥典》作為評價標準，僅有3 份樣品合格。但本研究旨在尋找一種可檢測菟絲子飲片多種成分的快速、靈敏、準確方法，以期為菟絲子飲片質量控制提供更全面的評價，由于在流動相比例、檢測波長及樣品前處理等方面與《中華人民共和國藥典》中的方法均有差異，因此不能簡單將其結合本研究的檢測結果作為直接評價樣品是否合格的依據。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 對菟絲子飲片中的成分進行定性分析，根據定性分析結果，建立了綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷5 個成分的HPLC 含量測定方法，并采用該方法對10 批樣品進行定量檢測，結果穩定可靠，重現性良好，可為進一步提高該藥材的質量標準提供參考。