正交法優選巖痛方的提取工藝

林滿遍，劉湘杰，林群慧，黃俊偉，張雙勝，宋 煜*

（1.福州市中醫院，福建 福州 350001；2.江門市中心醫院，廣東 江門 529020；3.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

巖痛方為福州市中醫院腫瘤科臨床協定方，由延胡索、川烏、乳香、沒藥、姜黃、白芥子、石菖蒲、冰片組成，具有理氣止痛、化瘀消癥的功效，主要用于改善氣滯血瘀型癌癥患者的癌性疼痛。由于臨床應用此方時未經提取，直接將藥材磨粉加入植物油調成糊狀后敷于疼痛部位，有效成分的釋放較慢，且容易沾染衣物。為進一步提升巖痛方的藥效及使用便利性，本研究擬提取巖痛方藥效物質后制成外用膏貼，因此首先要優選巖痛方的提取工藝。依據前期文獻調研，乳香、沒藥、石菖蒲、白芥子這4 味中藥具有活血行氣止痛的作用［1-3］，能有效緩解癌痛［4］，同時也具有一定的抗腫瘤活性［5-7］，揮發油是其主要有效成分；而延胡索、川烏、姜黃藥性味辛、溫，為中醫臨床癌痛治療的常用藥物，其主要活性成分分別為延胡索生物堿、烏頭生物堿、姜黃類化合物，多采用乙醇回流方式加以提?。?-13］。正交試驗設計是一種能夠減少實驗次數、縮短實驗周期的實驗方法，本研究采用正交試驗優選乳香、沒藥、石菖蒲、白芥子的揮發油提取工藝，優化延胡索、川烏、姜黃的醇提工藝條件，為進一步開發巖痛方的外用制劑提供實驗基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SZCL-2A 電子恒溫電熱套（鞏義市英峪博研儀器設備廠）；揮發油提取器（天津玻璃儀器廠）；DFY-600 高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；HH-S 電熱恒溫水浴鈉（上海錦屏儀器儀表有限公司）；e2695 型高效液相色譜儀（美國Water公司）。

1.2 試藥 乳香、沒藥、白菖蒲、白芥子、延胡索、川烏、姜黃等藥材均購自福州同春中藥有限公司，經福州市中醫院潘鴻貞主任中藥師鑒定為正品，所用藥材均符合2020 年版《中華人民共和國藥典》的規定；苯甲酰新烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品均購自成都普思生物科技有限公司（批號：PS1132-0025、PS1134-0025）；延胡索乙素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y21S7Y1709 1），以上對照品純度均≥98%；乙酸銨、乙腈均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 揮發油的提取及正交設計 參考文獻［14-15］采用水蒸氣蒸餾法提取藥材中的揮發油。按照處方量分別稱取乳香24 g，沒藥24 g，石菖蒲20 g，白芥子20 g，共計88 g，以藥材粉碎度（A）、浸泡時間（B）、加水量（C）和提取時間（D）為4 個實驗因素，每個因素設定3 個水平，設計L9（34）正交試驗表進行實驗，優選最佳提取工藝。以揮發油體積數為評價指標，體積大者為佳。正交試驗因素水平設計見表1，揮發油提取工藝正交試驗設計結果見表2，方差分析結果見表3。從表2 可知，4 個因素對揮發油提取量影響程度排序為D＞C＞A＞B，再結合方差分析，可知D 為最主要影響因素，且對揮發油的提取率產生顯著影響，而A、B、C 影響均不顯著。提取時間越長，揮發油提取量越大，因而選擇了3 h 提取時間；加4 倍水與12 倍量水的提取量差異較小，為了節約成本選擇4 倍量的水。綜合以上分析并考慮生產效率等因素最佳提取工藝確定為：A2B2C1D3，即藥材粉碎過20 目篩，水中浸泡30 min，加水量4 倍，提取時間為3 h。

表1 正交試驗因素水平設計

表2 揮發油提取工藝正交試驗設計結果

表3 揮發油提取工藝方差分析結果

2.2 揮發油提取工藝驗證試驗 稱取處方量乳香、沒藥、石菖蒲與白芥子，按照優化的提取工藝以水蒸氣蒸餾法提取3 次，分別提取了揮發油0.78、0.78、0.79 mL，所提取的揮發油量高于揮發油提取工藝正交試驗設計中的任一實驗組，此驗證試驗表明最佳提取工藝條件穩定可行，且重復性良好。

2.3 醇提工藝考察

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil?C18高效液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 mol/L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫：0～23 min，27%A；23～33 min，27%～55%A；33～50 min，55%～90%A；流速1 mL/min；檢測波長：苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿為232 nm，延胡索乙素為280 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.3.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取苯甲酰新烏頭原堿對照品10.2 mg、苯甲酰次烏頭原堿對照品10.1 mg 和延胡索乙素對照品10.2 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻制成1.02、1.01、1.02 mg/mL 的含苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取正交試驗各方案所得到的乙醇回流提取液，抽濾，60 ℃減壓回收乙醇，收集藥液稱得質量M，然后精密稱取50% M 質量的藥液轉移至50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過取續濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 標準曲線制備 精密吸取混合對照品溶液0.05、0.5、1.0、1.25、1.5、2.0 mL 置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素的濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程。各組分線性回歸方程結果見表4。

表4 醇提組分線性回歸方程

2.3.5 方法學考察

2.3.5.1 精密度試驗 精密量取混合對照品溶液1 mL，置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，連續進樣測定6 次，計算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素峰面積的RSD 分別為0.45%、0.95%、0.79%，說明儀器精密度良好。

2.3.5.2 重復性試驗 分別平行制備6 份供試品溶液，進樣，計算得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素含量的RSD 分別為1.30%、1.53%、0.98%，說明重復性良好。

2.3.5.3 穩定性試驗 取供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，計算得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素含量的RSD 為0.93%、0.48%、0.65%，說明供試品溶液12 h內穩定性良好。

2.3.5.4 加樣回收率試驗 分別取6份已知含有苯甲酰新烏頭原堿6.04 mg、苯甲酰次烏頭原堿2.62 mg、延胡索乙素6.48 mg 的供試品溶液，分別加入含302.0 μg/mL 苯甲酰新烏頭原堿、131.5 μg/mL 苯甲酰次烏頭原堿和323.4 μg/mL 延胡索乙素的對照品溶液20 mL，制備供試品溶液，進樣，測定，結果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素平均回收率為98.70%、96.70%、103.8%，RSD分別為2.88%、1.41%、2.51%，故方法準確度較高。

2.3.6 出膏率測定 取“2.3.3”項下正交試驗各方案提取液回收乙醇后的收集藥液，精密稱取20%M 質量的藥液置于恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105 ℃下干燥3 h，移至干燥器中冷卻30 min，及時稱重干浸膏，計算出膏率。

2.3.7 考察指標 根據延胡索、川烏類藥材相關文獻［8，13，16-17］，以出膏率和延胡索乙素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿含量為指標，采用綜合評分法，以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素含量和出膏率占權重系數0.15、0.15、0.6、0.1 計算各評分。

各組分提取率評分=（各組分提取液濃度/各組分提取液濃度最大值）×100

各組出膏率評分=（各組出膏率/出膏率最大值）×100

綜合評分=苯甲酰次烏頭原堿提取率評分×0.15+苯甲酰新烏頭原堿提取率評分×0.15+延胡索乙素提取率評分×0.60+出膏率評分×0.10

2.3.8 正交法優化提取工藝 按巖痛方處方比例，稱取藥材延胡索12 g，川烏15 g，姜黃15 g。共計42 g，以提取次數（A）、乙醇濃度（B）、溶劑量（C）、提取時間（D）為4 個因素，每個因素3 個水平，設計L9（34）正交試驗表（表5）進行實驗，依據表6 中的正交設計實驗所設置的醇提工藝進行提取得提取液，并進一步測定提取液中各組分含量和出膏率，計算綜合評分，優選最佳乙醇回流提取工藝。

表5 正交法考察醇提工藝因素水平

表6 醇提工藝正交試驗設計結果

醇提工藝正交試驗設計結果見表6，醇提工藝方差分析結果見表7。由方差分析結果可知，4 個因素對提取效率的影響均無統計學意義（P＞0.05）。4 個因素對綜合評分影響程度排序為：提取次數（A）＞溶劑量（C）＞乙醇濃度（B）＞提取時間（D）。最大影響因素為提取次數，回流提取3 次的綜合評分值最高，但回流提取3 次與2 次的差別不大，為節約成本與時間，確定回流提取次數為2 次；其次是加溶劑量（C），加乙醇達8 倍量時綜合評分最高，因而采用加8 倍量溶劑；第3 為乙醇濃度（B），依據結果采用90%乙醇為提取溶劑；提取時間（D）的影響最小，選擇回流提取1 h。根據分析結果確定優選工藝為A2B3C2D2，即提取2 次，加8 倍量90%乙醇為提取溶劑，每次1 h。

2.4 醇提工藝驗證實驗 巖痛方按處方各藥材量稱取延胡索、川烏、姜黃，平行3 份，按最佳回流提取工藝條件進行實驗，濾過，合并藥液，依法測定各組分的含量與出膏率，以正交試驗中的各指標最大值為分母計算綜合評分，驗證優化工藝的結果見表8。實驗結果顯示：各組分的含量與出膏率均較高，綜合評分均在90 分以上，高于任一醇提工藝正交試驗設計實驗組的綜合評分值，提示優化的工藝參數是適宜的。

表8 醇提工藝驗證結果

3 討 論

揮發油提取結果分析中顯示，粉碎度、浸泡時間、加水量的影響因素均較小。其中加水4 倍量與12 倍量所蒸餾的揮發油較高，但兩者的差異不大，考慮到節約溶劑，且12 倍量水使得固定體積容器所容納的提取藥材量顯著下降，因而最終選擇4倍量水。揮發油的提取量雖然隨著提取時間的延長而增加，但在預實驗中發現提取時間達到2 h 后揮發油提取增加量已明顯下降，達到3 h 后提取揮發油量基本不變，因而最終將揮發油的提取時間的高水平設為3 h。

在設置權重時，延胡索作為君藥占權重最大，所占權重設為60%，川烏在本方中作佐藥，權重相對較小，其2 個指標成分苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿總占比為30%，中藥成分較為復雜，除了指標成分外考慮到其他有效成分極有可能與所提取的膏量相關，因而設定了干膏重作為另一項提取工藝的指標，并設定10%為其權重占比。另外，在選擇指標成分時，也曾嘗試將川烏的新烏頭堿、次烏頭堿與烏頭堿的提取濃度作為考察指標，結果在實驗中發現這3 個成分出峰時間較長，且在梯度洗脫中與姜黃類化合物難以分離，因而最后選擇了苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿為指標成分考察川烏的提取率。

本研究以揮發油提取量與延胡索乙素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量及出膏率為指標，通過正交試驗設計優選出巖痛方的最佳提取工藝，采用優化后的提取工藝能夠大幅度地提高巖痛方中有效成分的提取率，從而為進一步的制劑研究與開發提供了便利性，一方面它有利于提高外用制劑的載藥量，另一方面藥用成分無須通過植物細胞擴散出來，縮短了藥物吸收的路徑，從而更有利于臨床藥效的發揮。