固態發酵橄欖渣制備枯草芽孢桿菌微生態制劑研究

林 瑾, 時祥柱, 王芳婷, 陳炳鈿

(1.閩江師范高等?？茖W校 化學與生物技術學院,福建 福州 350109;2.福建省新閩科生物科技開發有限公司 研發部,福建 福州 350007)

0 引言

橄欖是橄欖科橄欖屬喬木植物,含有豐富的膳食纖維、維生素、單寧、黃酮等生物活性物質,具有清熱解毒、利咽化痰、生津止渴之功效[1].隨著加工技術的進步,以橄欖為原料的一系列加工食品受到了消費者的青睞,如橄欖汁、橄欖茶、橄欖酒等[2-5].隨著橄欖產品類型的不斷豐富,其生產過程中的副產物橄欖渣的產量也大幅增加.在一些地中海國家,橄欖渣常被添加進飼料中,用于喂養反芻家畜[6].國內也有研究發現,在飼料中添加一定比例的橄欖渣可以改善動物的營養品質,如提高兔肉的多種不飽和脂肪酸含量[7];提高青腳麻雞的生產性能、免疫功能和新城疫抗體水平[8];改善雞肉的屠宰性能[9];提高水牛乳中天然抗氧化物質的濃度,并降低飽和與不飽和脂肪酸的比例等[10].

枯草芽孢桿菌是常見的飼料益生菌,常被用在制備微生態制劑時替代飼用抗生素[11],目前已被應用于禽類、畜類和水產類養殖中.枯草芽孢桿菌的添加有利于提高動物的免疫功能,維持腸道健康,并促進其生長[1213].目前,通過固態發酵制備枯草芽孢桿菌益生菌制劑的原料主要有麩皮、豆粕、花生粕、醬渣等[14-16],這些原料中膳食纖維的含量較高,而橄欖渣同樣具有豐富的膳食纖維,但目前利用橄欖渣作為制備固態發酵枯草芽孢桿菌制劑的相關研究卻較少.

本研究以橄欖汁生產過程的副產物橄欖渣為培養基,添加尿素作為氮源后接種枯草芽孢桿菌進行固態發酵.通過單因素及正交試驗研究最適宜的發酵條件,并對發酵前后的總膳食纖維、真蛋白、單寧含量的變化進行分析對比,以期探索出一種實用有效微生態制劑的制備方法,同時提高橄欖渣的附加值,為橄欖渣資源回收再利用提供理論依據.

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

橄欖渣來自橄欖汁生產車間.枯草芽孢桿菌(ATC6633)購于上海保藏微生物有限公司.

1.1.2 主要培養基

斜面培養基:牛肉膏1.5 g、瓊脂粉10 g、蛋白胨5 g、NaCl 2 g,定容至500 m L,p H 調至7.0,120℃滅菌20 min.

液體種子培養基:牛肉膏1.5 g、蛋白胨5 g、NaCl 2 g,定容至500 m L,p H 調至7.0,120℃滅菌20 min.

固態發酵培養基:橄欖渣250 g、去離子水250 m L、K2HPO40.2 g、尿素2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g,120℃滅菌20 min.

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

取適量橄欖渣用蒸餾水清洗,4層紗布過濾,置于50℃烘箱中烘干,粉碎,過40目篩,備用.

1.2.2 種子液的制備

在無菌條件下,將保藏的菌株轉接至斜面培養基,37℃恒溫培養24 h后活化.向活化的斜面培養基中加入2 m L生理鹽水洗脫孢子,合并制成菌懸液.準確吸取1 m L孢子懸液至100 m L液體種子培養基中,于37℃和200 r/min 的條件下震蕩培養24 h,獲得種子液.

1.2.3 固態發酵培養

無菌條件下,取30 g固態發酵培養基于錐形瓶中,基礎條件為:溫度37℃,接種量5%,料液比1∶1(g/m L),發酵時間48 h.

1.2.4 培養條件單因素試驗

(1)溫度

控制其他因素不變,以發酵后的菌落數為指標,分別考察在30℃,32℃,34℃,36℃,38℃和40℃下發酵的活菌數.

(2)料液比

控制其他因素不變,以發酵后的菌落數為指標,分別考察料液比為1∶0.5,1∶1.0,1∶1.5,1∶2.0,1∶2.5和1∶3.0(g/m L)的條件下發酵的活菌數.

(3)發酵時間

控制其他因素不變,以發酵后的菌落數為指標,分別考察發酵時間為12 h,24 h,36 h,48 h,60 h和72 h的活菌數.

(4)接種量

控制其他因素不變,以發酵后的菌落數為指標,分別考察接種量為2%,4%,6%,8%,10%和12%條件下發酵的活菌數.

1.2.5 正交試驗設計

根據單因素試驗結果,設計L9(34)正交試驗,研究溫度、料液比、發酵時間和接種量4個因素在不同組合條件下對活菌數的影響.具體情況見表1.

表1 正交試驗設計

1.2.6 菌落數的測定

采用平板活菌計數法,稱取1 g發酵后的樣品,加入10 m L 的去離子水,按10倍梯度稀釋成不同倍數.吸取100μL置于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養皿中進行涂布,37℃培養24 h后進行菌落計數.

1.2.7 橄欖渣發酵前后營養成分變化分析

1.2.7.1 總膳食纖維的測定

樣品前處理步驟參考文獻[17]改良后的方法,總膳食纖維的測定步驟參考《GB 5009.88—2014食品中膳食纖維的測定》[18]中的方法.

1.2.7.2 真蛋白含量的測定

采用文獻[19]的方法,將樣品中的蛋白質經沸水提取后在堿性條件下用硫酸銅溶液沉淀,過濾和洗滌后用凱氏定氮法測定.該方法可將純蛋白質和非蛋白質含氮物分離,避免無機氮源尿素對實驗結果的干擾.

1.2.7.3 單寧的測定

采用分光光度法測定樣品中的單寧含量,具體參考GB/T 27985—2011[20].

2 試驗結果

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溫度的對菌落數的影響

溫度是影響微生物生長的主要物理因素之一,不同溫度對枯草芽孢桿菌菌落數的影響結果見圖1.由圖1可知,溫度由30℃升至36℃時,菌落數逐漸增長,而36℃繼續升至40℃,菌落數逐漸減少.其中,36℃時菌落數最多.這是因為枯草芽孢桿菌在較低溫度下生長速度較緩慢,隨著溫度的升高,生長速度會逐漸加快,到達最適溫度時,生長繁殖速度到達峰值,而超過最適溫度后,枯草芽孢桿菌的生長速度受到抑制.因此,本試驗中所用菌株的最適宜生長溫度為36℃.

圖1 溫度的對菌落數的影響

2.1.2 料液比對菌落數的影響

培養基的含水量對微生物的生長及代謝能力有重要影響.水分參與了菌體內重要的生化反應,也影響生物大分子結構的穩定性,因此合適的料液比對發酵的效果具有重要意義.料液比對菌落數的影響情況見圖2.

圖2 料液比對菌落數的影響

從圖2可知,枯草芽孢桿菌菌落數在開始時隨料液比的降低而增加,在料液比為1∶2 時達到峰值,隨后又逐漸下降.這是因為本研究所用的發酵原料主要為橄欖渣,橄欖渣中含有大量的膳食纖維,持水力和膨脹力較強[1,21].當料液比較高時,培養基中的水分少,且大部分水分被橄欖渣吸附,這導致培養基中的自由水含量較低,限制了菌體對營養物質的利用率.而培養基中的自由水含量逐漸升高后,營養物質溶解在這部分自由水中,可以提高菌株對營養物質的利用率,因此,菌落數在開始時隨料液比的降低而增加.而當料液比低于1∶2時,培養基中含水量過高,又會影響培養基內的溶氧量,從而影響菌體的生長[22],所以菌落數又逐漸下降.因此,本研究發酵培養基的最適宜料液比為1∶2.

2.1.3 發酵時間對菌落數的影響

不同發酵時間枯草芽孢桿菌的菌落數變化趨勢見圖3.

圖3 發酵時間對菌落數的影響

由圖3可以看出,在前36 h內,菌落數隨時間的延長而增加,12 h～24 h 內增長速度比較緩慢,24 h～36 h內增長速度變快.這是由于培養基原料為橄欖渣,含有較多的膳食纖維大分子物質,在發酵前期,可供菌體直接利用的小分子糖類濃度較低,因此菌落數增長緩慢,而隨著發酵時間的延長,菌體酶系逐漸活躍,代謝逐漸旺盛.研究表明,枯草芽孢桿菌可分泌纖維素酶[23-25],將部分大分子的膳食纖維分解為小分子糖類,更有利于菌體代謝速率的提高,因此菌落數的增長速度變快.36 h 后,菌體的生長進入穩定期,菌落數變化不大且有微小的下降趨勢,這可能是由于其生長限制因子耗盡、有害代謝物累積或生長空間受到限制等造成的[26].

2.1.4 接種量對菌落數的影響

接種量對枯草芽孢桿菌菌落數的影響見圖4.

圖4 接種量對菌落數的影響

由圖4可知,接種量由2%增至8%時,菌落數逐漸增加,這是因為接種量越大,菌株生長的延滯期越短,因此接種量過小不利于提高生產效率.而接種量超過8%時,菌落數略微下降,這是因為接種量過大可能會導致溶氧量不足或移入代謝廢物.因此在單因素試驗中,最適宜的接種量為8%.

2.2 正交試驗優化結果

本文的正交實驗結果見表2.

表2 正交試驗結果

從表2可知,影響菌落數的因素從大到小的順序為:發酵時間、料液比、溫度、接種量.其中,試驗組中的最優組合為A2B2C3D1,但根據試驗K值計算出的最優組合為A2B2C2D1.因此,對這兩個組合條件進行驗證試驗,試驗結果為,A2B2C3D1組合條件的菌落數為7.26×109CFU/g,而A2B2C2D1組合條件的菌落數為7.02×109CFU/g.因此,最優的組合條件為A2B2C3D1,即發酵溫度為36℃,料液比為1∶2,發酵時間為48 h,接種量為6%.

2.3 發酵前后培養基部分營養成分變化情況

在正交試驗優化的固態發酵條件下,對發酵前后的橄欖渣固態培養基中的膳食纖維、蛋白質、單寧3種成分進行分析,結果見表3.

表3 發酵前后營養成分變化情況/%

由表3可知,發酵后總膳食纖維含量降低.經枯草芽孢桿菌固態發酵后,橄欖渣中大分子膳食纖維含量降低,由起始的81.5%下降至74.5%.這可能是由于枯草芽孢桿菌能夠分泌纖維素酶,將大分子纖維素分解為小分子的可溶性糖和還原糖造成的.國內一些研究結論也證明了枯草芽孢桿菌具有良好的產纖維素酶能力,如文獻[23]利用枯草芽孢桿菌制作麩曲可產β-葡聚糖酶等3 種纖維素酶;文獻[24]對一株枯草芽孢桿菌的培養條件進行優化后,其纖維素酶產量大幅提高;文獻[25]在探究枯草芽孢桿菌對雷竹筍膳食纖維含量的影響時發現,枯草芽孢桿菌可以增加可溶性糖和還原糖的含量.從這一角度來看,枯草芽孢桿菌有助于將橄欖渣中大分子膳食纖維分解為易于利用的營養物質,從而提高微生態制劑的營養價值.

發酵后真蛋白含量有所提高.發酵產物中的真蛋白含量由發酵前的4.52%提高至5.06%.這是因為枯草芽孢桿菌可利用培養基中的無機氮源合成蛋白質或小分子肽.這有利于提高微生態制劑整體的營養價值.

發酵后單寧含量顯著下降.單寧是一種多酚類物質,在橄欖中含量較高,也是苦澀味產生的重要原因,會影響飼料的風味和適口性[27-28].此外,單寧也是飼料中的一種抗營養因子,含量過高會降低飼料的利用率[1].本研究中,橄欖渣原料經120℃滅菌后,單寧含量由最初的0.85%下降至0.14%,經枯草芽孢桿菌發酵后繼續下降至0.04%,比未處理前降低顯著,一方面是因為單寧易在高溫條件下降解;另一方面是由于微生物可能分泌單寧酶,隨著發酵時間的延長,導致單寧含量進一步降低.

3 結論

本研究以橄欖汁生產中的副產物橄欖渣為原料,接種枯草芽孢桿菌制備益生菌飼料并對其固態發酵條件進行優化.試驗結果表明,最佳發酵條件為:溫度36℃,料液比1∶2,發酵時間48 h,接種量6%,發酵后的枯草芽孢桿菌菌落數可達7.26×109CFU/g,此外,橄欖渣中的總膳食纖維含量降低,真蛋白含量上升,單寧降解率提高.而這有利于提高飼料的品質.

本文探究的枯草芽孢桿菌最適的生長條件是指其生產速率最快時的發酵條件,并不一定是代謝產物積累最快的生長條件.因此,以橄欖渣為主要固態培養基發酵益生菌,其產生蛋白質、纖維素酶等生物活性物質的最佳條件還有待于進一步探究.