基于柵極功能化捕獲甲胎蛋白的溶液柵控石墨烯晶體管生物傳感器

嚴會玲,曹磊,鄒榮,張修華,王升富,何漢平

(湖北大學化學化工學院,湖北 武漢 430062)

0 引言

甲胎蛋白(AFP)是一種多功能糖蛋白生物標志物(Mw=70 000 Da),可作為治療和干預中正常生理、致病或藥理學反應的預后指標[1-2]。其在健康成人血液中的濃度應小于25 ng/mL,如果人體血液中甲胎蛋白的濃度增加,可能預示著肝癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌以及其他胃腸道癌癥的發生[3]。此外,檢測孕婦體內的甲胎蛋白含量有助于發現胎兒的先天缺陷和新生兒疾病[4]。通常肝細胞癌(HCC)占肝癌的85～90 %,在死亡病例中因患肝癌死亡占據主要人數[5]。AFP已被廣泛接受為肝癌細胞的生物標志物。由此可見,監測人體中AFP濃度對早期病變的診斷以及后期治療的分析顯得尤為重要。近幾年AFP的檢測技術發展十分迅速,例如酶聯免疫吸附法[6](enayme-linked immunosorbent assy,ELISA),化學發光法[7-8]、熒光免疫分析法[9-11](fluoroimmunoassay,FIA)和電化學免疫分析[12-14](electrochemical immunoassay)。這些方法具有高精度、選擇性高等優點,但是也存在一定的局限性,包括需要較高的專業要求、耗時的實驗過程和標記過程、以及復雜的實驗測試底液。例如,ELISA方法不能有效地檢測在腫瘤早期低濃度的腫瘤標志物,同時它也需要高技能的技術人員進行實驗[15],無法實現普遍化。傳統的電化學免疫傳感器具有靈敏度低的缺點,雖然可以通過引入各種信號放大來提高靈敏度,例如,滾環擴增(RCA)[16-17]、使用氫供體(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)[18]和酪胺信號放大(TSA)[19],這些技術使診斷過程復雜化。因此,具有靈敏度高、簡單操作且高效的手段來檢測低濃度的疾病標志物是非常有必要,特別是用于即時檢測(POCT)。

無標記型的傳感器能夠減少繁瑣的制備過程,其原理是反應前后的界面電流、電容以及電勢等產生變化,從而得到信號輸出,但是該檢測方法的靈敏度較低,導致不能對低豐度目標物進行檢測。晶體管作為一種新型的信號載體,其無需借助復雜的修飾手段對信號進行放大處理就可以得到較好的信號響應,已成功應用在各種類型的生物傳感器中[20-23]。溶液柵控場效應晶體管由于其能在電解液中進行測試工作,因此決定了該設備的工作電壓要小于1 V[21-22],低電壓的工作電位有效地防止了檢測液的分解、干擾、保護生物體不被破壞等。液體的工作環境滿足了大部分的生物檢測分析,為生物分子檢測提供了一個可靠的平臺。

因此本工作設計了一種無標記電位型溶液柵控石墨烯晶體管生物傳感器對甲胎蛋白的檢測(圖1)。在柵電極上通過電沉積納米金層來捕獲AFP抗體(anti-AFP),牛血清白蛋白(BSA)作為封閉劑,最終分析物AFP被特異性結合到電極上。在pH=7.4的PBS中,生物分子帶有一定的電荷,引起柵極/電解質溶液界面電勢的變化,從而改變了有效柵壓,最終導致轉移曲線中狄拉克點的偏移。根據電位偏移量對甲胎蛋白進行定量分析,實現無標記檢測。

圖1 SGGT的構建過程

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器PMMA/CVD銅基底單層石墨烯、羧基化多壁碳納米管購于南京先豐納米科技有限公司。氯金酸(HAuCl4·3H2O)、癌胚抗原(CEA)購于Sigma-Aldrich公司(北京)。anti-AFP、AFP購于上海領潮生物科技有限公司。20×磷酸鹽緩沖溶液購于生工生物工程股份有限公司。碳酸鉀(K2CO3)、丙酮(C3H6O)、五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)、鹽酸(HCl)均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司。人血清白蛋白(HSA)、凝血酶(TB)和肌紅蛋白(MB)購于上海源葉生物科技有限公司。30% H2O2、辣根過氧化物酶、牛血清白蛋白(BSA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。金絲、鉻購于中諾新材科技有限公司。玻璃基底購于洛陽古玻璃有限公司。

2450數字源表,美國吉時利儀器有限公司。CHI660E電化學工作站,上海辰華儀器有限公司。V22-300熱蒸發鍍膜儀,北京中科科技股份有限公司。Tecnai G20透射電子顯微鏡,美國FEI公司。UV-2700紫外可見分光光度計,日本Shimadzu公司。3-18KS冷凍離心機,美國Sigma公司。Milli-Q超純水儀器,美國Millipore公司。玻碳電極、飽和甘汞電極、銀/氯化銀電極和鉑電極,武漢高仕睿聯科技有限公司。

1.2 石墨烯溶液柵場效應晶體管的制備首先對玻璃基底(10×10×0.7 mm)進行清洗處理,將其分別用丙酮、乙醇、H2O超聲清洗各30 min,并用N2吹干。并使用7%的氫氟酸進行刻蝕1 min,使用超純水沖洗干凈,并用N2吹干。隨后把玻璃基底放置在掩膜板中在熱蒸發鍍膜儀中進行蒸鍍。先蒸鍍金屬鉻作為粘接層,再蒸鍍金層作為源漏電極,鉻層讓金層更好地貼合于玻璃基底上。最終其厚度為5 nm左右鉻層,70 nm左右的金層。該器件的溝道長度和寬度分別為6 mm和0.25 mm。將購買的石墨烯裁剪成5×5 mm大小,放入由H2O、HCl和CuSO4·5H2O組成的刻蝕液中(50 mL∶50 mL∶10 g)大約30 min后,銅基底被刻蝕干凈,變成透明的PMMA/石墨烯。利用載玻片將PMMA/石墨烯轉移到超純水中清洗三次,再將PMMA/石墨烯覆蓋在鍍有源漏極的玻璃基底的溝道位置,過夜干燥。最后,把轉移好石墨烯的器件浸入丙酮溶液,依次浸泡3 min,5 min,10 min以除去PMMA層,浸泡完成后,用乙醇沖洗器件,再放置在95 ℃的加熱臺上加熱10 min。SGGT石墨烯溝道制備完成,儲存在干凈的表面皿中。

1.3 柵極的修飾首先將玻碳電極在麂皮上用Al2O3進行拋光,再通過循環伏安法對PBS和鐵氰化鉀進行掃描(PBS中無雜質峰,鐵氰化鉀的氧化還原電位差值小于75 mV),分別在水、乙醇、水中超聲清洗5 min。然后在底液濃度為0.5 %的HAuCl4·3H2O中,以-0.2 V,60 s的實驗條件下進行電沉積。電極在室溫下干燥后,取10 μL,50 μg/mL的anti-AFP于電極表面,4 ℃下放置一夜。使用PBS溶液沖洗電極去除多余抗體,電極表面吹干后,滴10 μL,1%BSA封閉電極,室溫下放置30 min。最后,電極用PBS清洗3次,吹干電極,滴加10 μL不同濃度的AFP抗體,37 ℃,1.5 h。待測電極浸沒在10 mmol/L PBS中保存。

1.4 甲胎蛋白的檢測利用兩個半導體參數分析儀Keithley 2450聯用分析SGGT生物傳感器的性能(圖1),并且通過LabView程序進行控制。SGGT裝置在0.01 mmol/L PBS底液中進行測試。通過半導體參數分析儀,以0.01 V/s的掃描速率得到SGGT的轉移曲線(IDS/VGS),在柵極范圍在0～1 V,固定的溝道電壓為VDS= 0.05 V下工作。采用電化學阻抗譜(EIS)的方式對電極的修飾過程以及電極上anti-AFP最大捕獲量進行了測試。EIS在含有0.1 mol/L KCl的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中采用傳統的三電極體系(玻碳電極、飽和甘汞電極和鉑電極)進行檢測。

2 結果與討論

2.1 實驗原理當施加柵壓時,溶液柵控場效應晶體管體系具有兩個雙電層:柵極/電解質溶液(CG-E)和電解質溶液/溝道(CE-C),可以模擬成兩個平行板電容器的等效電路,如圖2(A)所示。蛋白質由兩性離子氨基酸化合物組成,每種蛋白質都具有它們自己的等電點(pI)。當蛋白質處于不同pH值的溶液環境時,它們可以帶正電荷或帶負電荷。AFP的等電點是4.9,因此在中性的PBS溶液中帶負電荷。柵電極的表面電位會受到帶電分子的影響,當柵極捕獲目標物AFP后,帶負電荷的AFP在柵極界面產生電偶極子(在圖2(A)藍色箭頭標識的位置),從而改變晶體管的有效柵電壓。

圖2 (A)雙電層中電位降以及偶極子分布圖和(B)捕獲目標物前后轉移曲線的變化

(1)

(2)

ΔQ為捕獲目標物后的改變電荷,C為SGGT的總電容。CG-E為柵極/電解質溶液界面電容,CE-C為電解質溶液/溝道界面電容,S活性層的面積。溝道電流IDS的公式如下:

(3)

(4)

式中,VDirac為電中性時的柵極電壓,此時的空穴和電子的濃度相等,為最低的電流。電極界面形成的偶極子,誘導電位Δφ可表示為:

(5)

2.2 柵極修飾表征本研究在電化學工作平臺上通過EIS研究了柵極界面修飾過程。如圖3(A)所示,裸電極的阻抗值為200 Ω,電沉積一層納米金層時,阻抗值從200 Ω減小到50 Ω,這是因為納米金能加速電子傳遞的速度,導致阻抗值減少。當anti-AFP被捕獲在電極上時,阻抗值從50 Ω增加到950 Ω,抗體作為電惰性物質,降低了電子的傳輸速度,導致阻抗值增大(圖3(B))。同樣,牛血清白蛋白和抗原分子均為非導電生物分子,當牛血清白蛋白進行封閉后,其阻抗值增加到1 163 Ω。修飾柵極捕獲目標物AFP后,其阻抗值進一步增加到4 500 Ω。上述分析表明柵極修飾以及對AFP的捕獲是成功的。

圖3 柵極修飾過程的電化學阻抗圖譜

2.3 實驗條件優化對納米金界面捕獲抗體的最大量進行了優化來保證足夠的檢測范圍。GCE電沉積納米金層后,滴加不同濃度的anti-AFP濃度(10 μg/mL,20 μg/mL,30 μg/mL,40 μg/mL,50 μg/mL)到該修飾電極上,于4 ℃下培育12 h,隨后通過電化學阻抗法研究最優濃度。如圖4(A)所示,當anti-AFP的濃度達到50 μg/mL時,阻抗值的變化值可忽略不計,因此為了保證anti-AFP有足夠的量去捕獲抗原,選擇anti-AFP的濃度為50 μg/mL。

圖4 (A)抗體固載量和(B)測試底液PBS濃度的優化(n=3)

對于場效應晶體管,電解質溶液的離子強度對傳感器的靈敏度影響很大。在電解質溶液中,由于靜電相互作用,帶負電荷的抗體分子被陽離子包圍,這些表面電荷在雙電層的德拜長度(Debye length)內是可以被屏蔽的。因此,與柵極的距離大于Debye長度的蛋白質對柵極電位的影響很小。由此可見,與電解質的離子濃度相關的Debye長度會影響傳感器的性能。在電解質溶液中的Debye長度(Debye length)可以由下面的公式定義:

(6)

式中,ε為電解質的絕對介電常數,κ是玻耳茲曼常數,T是溫度,NA是阿伏伽德羅常數,I是溶液的離子強度,q是電荷量。為了檢測Debye長度對器件性能的影響,分別在不同離子濃度的PBS(20 mmol/L、10 mmol/L、5 mmol/L、1 mmol/L、0.1 mmol/L)中檢測同一濃度的AFP(100 ng/mL)。如圖4(B),當離子濃度從1 mmol/L開始增加時,柵壓的偏移量隨著PBS離子濃度的變化有很大的差距,這說明PBS離子濃度超過1 mmol/L時,德拜長度較短,很大程度上影響器件性能變化,不適合該傳感的檢測分析。然而發現低于1 mmol/L時,柵壓偏移量的差距幾乎可以忽略,這表明Debye長度的進一步增加將不會再明顯影響器件的性能。因此選擇測試液PBS的離子濃度為0.1 mmol/L。

2.4 甲胎蛋白檢測如上所述,該SGGT對AFP進行檢測時,優化了柵極的固載量和電解質溶液的濃度來提高靈敏度。根據檢測原理可知,中性電解質環境下,帶負電荷的抗原分子,在柵極界面產生偶極子,使柵極界面的電位下降,為了保持有效柵壓一致,則需要施加更大的柵壓(VDirac向正方向偏移)。因此,柵極上存在不同數量的目標物對柵極界面的電位影響不同,柵壓的偏移量也會不同,可根據不同濃度目標物與柵壓偏移量之間的關系擬定線性關系。在固定溝道電壓(VDS= 0.05 V),柵壓范圍從0～1 V,測定轉移曲線。如圖5(A-G)所示,隨著目標濃度的增加(5 ng/mL至200 ng/mL),轉移曲線偏移量逐漸增加,并且呈現了較好的線性關系ΔVDirac= 45.42lgc+ 4.98(R2= 0.990 1),檢測限為1.00 ng/mL(圖5(H))。相比于其他的生物傳感器,SGGT生物傳感器具有高的靈敏度(表1)。

表1 其他AFP免疫傳感器的性能比較

圖5 (A～F)不同目標物濃度下SGGT的轉移曲線測試圖,(G)轉移曲線測試匯總圖和(H)SGGT的線性圖

2.5 傳感器的選擇性與穩定性這里我們選取血液中常見的四種干擾物質凝血酶(TB)、人血清白蛋白(HAS)、肌紅蛋白(MB)和癌胚抗原(CEA)對該SGGT傳感器選擇性進行評估。實驗過程中,除了將目標物AFP替換成干擾物質,其他實驗條件及步驟均不變,記錄下VDirac,其中AFP的實驗濃度為10 ng/mL,其他干擾物質的濃度均為50 ng/mL。如圖6(A)所示,當存在目標物AFP時,其輸出信號遠大于干擾物所產生的信號。該結果表明,SGGT對AFP的檢測具有較高的選擇性。使用同一器件在5天內隔天重復測試同一根電極(目標物濃度為5 ng/mL)來測試器件以及柵極修飾的穩定性。如圖6(B)所示,五天內的重復檢測結果與初始檢測信號相差不大,可忽略不計,實驗結果表明了SGGT整體具有較好的穩定性。綜上所述,表明該溶液柵控石墨烯晶體管生物傳感器對甲胎蛋白的檢測具有很高的選擇性和穩定性。

圖6 (A)SGGT傳感器的選擇性測試(n=3)和(B)同一個器件連續五天測試的穩定性測試(n=3)

2.6 血清中AFP的加標回收臨床樣品中AFP目標物的檢測是在血清中進行,血清作為一個十分復雜的生理環境,含有很多的酶、蛋白質、激素、無機物等,因此實驗中非常有必要驗證該傳感在血清中是否受到這種復雜生理環境的影響。這里我們使用稀釋10倍的人血清作為背景培養液體進行人血清加標實驗,其中AFP的濃度分別為5 ng/mL、30 ng/mL、100 ng/mL。如表2可知檢測結果準確,回收率在100.6%～108.0%范圍內,相對偏差在0.6%～1.3%之間。這些檢測結果表明,該SGGT生物傳感器可以應用于復雜的血清環境中進行甲胎蛋白的檢測。

表2 人血清中對甲胎蛋白的加標回收測試 (n=3)

3 結論

本工作構建了無標記電位型溶液柵控石墨烯晶體管并對甲胎蛋白進行檢測。采取簡單的抗體功能化柵極捕獲目標物,實現了甲胎蛋白的高選擇性、高靈敏的分析檢測。柵極的成功修飾保證了器件的穩定性,并且器件溝道部分實現了重復利用。研究表明檢測液離子濃度會顯著影響柵極界面的德拜長度進而影響器件對AFP的檢測,發現PBS離子濃度低于1 mmol/L沒有明顯影響。電位型策略主要是根據轉移曲線中性點的偏移量對甲胎蛋白進行定量測試,結果表明在5 ng/mL至200 ng/mL濃度范圍內,偏移量與AFP的對數濃度呈現良好的線性關系:ΔVDirac= 45.42lgc+ 4.98(R2= 0.990 1),檢測限達到了1.00 ng/mL。綜上所述,SGGT生物傳感器在免標記的檢測方面具有很好的應用前景,同時該方法簡單穩定、易于集成化,有望實現高通量檢測。