提高釀酒酵母凈化重金屬污染能力的研究進展

徐佳鈺, 崔艷美, 王小利, 王 娟

(北京工業大學 環境與生命學部,北京 100124)

隨著世界工業化程度的提高,越來越多的重金屬被排放到水體和土壤中,有毒重金屬的持久性和不可降解性導致重金屬污染逐漸成為當今最重要的環境問題之一[1].傳統物理和化學修復方法不僅價格昂貴,而且會產生有毒的副產品,對環境造成二次污染.生物凈化因具有低成本、高效率、不產生二次污染等潛在優勢逐漸成為被廣泛認可的重金屬去除方法[2-5].

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一類重要的工業微生物,是常用的生物凈化材料之一.活性釀酒酵母在處理重金屬污染過程中涉及細胞外生物吸附和細胞內生物積累2個過程,2個過程可能單獨發生,也可能同時發生;而非活性釀酒酵母僅涉及生物吸附過程.釀酒酵母具有安全、低成本、易獲得、結構簡單等優勢[6],但酵母細胞的體積小、表面活性位點數量少、對重金屬離子耐受性差、金屬吸收特異性弱、難分離等問題使釀酒酵母尚不能工業化的應用于重金屬離子凈化.近年來,針對提高改造釀酒酵母凈化重金屬污染能力的研究逐步開展.對釀酒酵母用于生物凈化的優勢、機理進行了綜述,并從生物吸附和生物積累2方面對提高改造釀酒酵母凈化重金屬污染能力的方法及研究進展進行了概述.

1 釀酒酵母與生物凈化

1.1 釀酒酵母用于生物凈化的原理

圖1 生物凈化去除重金屬原理[8]Fig.1 Principle of Removing Heavy Metals by Biological Purification

生物凈化是利用生態系統中的各種生物來控制有毒污染物積累的技術,已經被用于去除廢水和土壤中的重金屬[7].釀酒酵母是研究較早的重金屬離子生物凈化材料,應用于處理環境中重金屬污染問題,涉及生物吸附和生物積累2個過程,直觀的凈化重金屬機理如圖1所示[8].生物吸附是指金屬離子與細胞表面,特別是細胞壁組分中的化學基團相互作用,將重金屬離子吸附至細胞表面的被動吸收過程,不需要能量代謝,吸附重金屬的量取決于細胞表面金屬的動力學平衡[8].該機制包括物理吸附、離子交換、表面絡合、無機微沉淀等基礎方法[9-12],物理化學改性和細胞表面展示技術是最常用的增加釀酒酵母吸附重金屬的方法.生物積累是指酵母細胞通過新陳代謝將重金屬離子運送到細胞內部進行沉淀和轉化的過程,這一過程依賴于活細胞的多種物理、化學、生物機制,涉及細胞內和細胞外2個過程[11].改造釀酒酵母細胞表面金屬轉運蛋白、增加釀酒酵母細胞對重金屬的耐受性可以使釀酒酵母細胞積累更多重金屬,如果在增加金屬積累的同時控制積累金屬的位置和結晶度或許有助于重金屬的回收.此外,釀酒酵母菌株的狀態、金屬溶液的化學性質、吸附溫度、吸附時間、重金屬離子濃度、菌體濃度都會對釀酒酵母去除重金屬離子產生影響[12].

1.2 釀酒酵母用于生物凈化的優勢

釀酒酵母,通常被稱為面包酵母或出芽酵母,細胞為球形或者卵形,直徑5～10 μm,是一種以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物[13].釀酒酵母基因組包含1 200萬個堿基對,分成16組染色體,是第一個完成完整測序的真核生物[14],也是最成熟的真核生物表達系統.在工業、化工領域,釀酒酵母最初用于生產面包、啤酒和葡萄酒,近幾年被應用于可再生燃料、食品配料、藥品生產等領域[15-16].在環境應用方面,釀酒酵母是常用的生物凈化材料.釀酒酵母應用于生物凈化具有以下優勢:第一,產量高易培養,使用簡單的發酵技術和廉價的生長培養基可以很容易地擴培酵母;第二,易獲得,與其他類型的微生物相比,釀酒酵母作為釀酒和發酵工業的副產品更容易大量獲取;第三,安全性高,釀酒酵母是非致病性的真核微生物,在釀酒和面包發酵方面的應用歷史悠久,已被美國食品藥物管理局歸類為公認安全(generally recognized as safe,GRAS)產品,釀酒酵母的重組細胞已被構建并用于生產各種生物化學物質;第四,基因序列完整,是分子生物學研究中的模式生物,可通過基因工程進行加工[2,6,17-18].這些優勢使釀酒酵母成為重金屬污染處理領域的重要研究對象.

2 生物吸附

釀酒酵母細胞對重金屬離子的親和力與細胞表面官能團的類型和數量直接相關[19].物理化學改性和細胞表面展示技術能夠增加釀酒酵母細胞表面涉及重金屬吸附的表面基團、電荷,從而增加胞外重金屬離子吸附.此外,細胞自體納米材料是一種新興的增加重金屬吸附的技術,具有很好的發展前景.活性酵母細胞和滅活釀酒酵母細胞均具有生物吸附作用,其中滅活釀酒細胞受溫度和pH的影響較小且不需要營養供應,易于儲存為干燥的生物質,容易從發酵工業中大量獲得.結合物理化學改造釀酒酵母的方法具有低成本、易操作等基礎優勢,使改造釀酒酵母工業化應用于重金屬凈化具有良好的理論和應用基礎.

2.1 物理化學改性

物理或化學方式處理釀酒酵母細胞提高釀酒酵母對重金屬吸附能力主要涉及物理吸附和表面絡合機制.物理吸附發生在細胞表面上,通常是帶電溶質顆粒與吸附劑之間的吸引產生的靜電吸附[10].環三磷酸鈉(Na3P3O9)可以磷酸化釀酒酵母細胞使其帶有強負電荷,從而通過物理吸附從水溶液中回收重金屬離子.Na3P3O9處理過的細胞對鎘(Cadmium,Cd)、銅(Copper,Cu)、鉛(Lead,Pb)和鋅(Zinc,Zn)離子的吸附容量達到1.0 mmol/g細胞干重(gram of cell dry weight,gDCW),是目前使用干酵母研究中的最高水平.同時磷酸化酵母細胞可以選擇性吸附稀土離子釹(Neodymium,Nd)、鐿(Ytterbium,Yb)[20].陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)處理的釀酒酵母能夠去除水溶液中鉻酸鹽陰離子(CrO42-),去除率高達99.5 %,是未修飾細胞的4倍[21].

絡合作用是生物質表面金屬與配體相互作用從而吸附重金屬的過程.細胞表面的氮、氧、硫、磷原子可以作為配體與重金屬離子絡合使土壤和水中的重金屬保留在釀酒酵母細胞壁表面的官能團(羧基、氨基、硫醇、羥基、磷酸鹽)上[22].釀酒酵母凈化鍶(Strontium,Sr)時,細胞表面的羧基或氨基的氫鍵會斷裂,氮或氧可以提供配位電子,這些電子可以與Sr2+絡合形成新的配體如: -O-Sr,-N-Sr,-CO-Sr,可降低Sr污染[23].釀酒酵母暴露輻照后,細胞表面配體增多,在Sr壓力下能夠存活并恢復正常形態的釀酒酵母,能夠絡合更多的Sr2+[24].乙醇和燒堿預處理的釀酒酵母體系中羧基和氨基濃度更高,容易與Cu2+形成穩定的絡合物,增強Cu2+的生物吸附[25].45 ℃熱處理滅活釀酒酵母會導致細胞膜完整性喪失,暴露出細胞內更多的金屬結合位點,研究顯示熱處理后的釀酒酵母對鎳(Nickel,Ni)和Zn的結合能力是相同條件下活釀酒酵母細胞的17倍和12倍[26].乙二胺四乙酸二酐(ethylenediaminetetraacetic Dianhydride,EDTAD)是一種可生物降解的活性物質,分子中含有2個酸酐基團,一般通過?；揎椛镔|.EDTAD修飾的釀酒酵母中暴露出更多電離形式的羧基,羧基與Pb2+和Cu2+形成絡合物被迅速吸收[27].

2.2 細胞表面展示技術

酵母細胞表面展示技術通過將具有良好的金屬結合能力的天然肽或模擬肽與瞄定蛋白融合表達,展示在酵母細胞表面,從而改善酵母細胞處理重金屬離子的性能[28].抗汞(Mercury resistance,Mer)操縱子系統中的轉錄調控因子(mercury resistance transcriptional regulator,MerR)對汞(Hydrargyrum,Hg)離子具有高親和力和選擇性.為了提高釀酒酵母對Hg2+的吸附能力,Wei等[29]首次采用基于α-凝集素展示系統在釀酒酵母表面展示MerR,使酵母工程菌不僅表現出更高的Hg耐受性,而且其吸附能力約為原始菌株和對照菌株的3倍.de Oliveira等[30]用編碼金屬硫蛋白的毛果楊基因(two versions of a populus trichocarpa gene coding for a metallothionein,PtMT2b)的原始序列(PtMT2b′C′)和具有氨基酸取代的突變序列(PtMT2b′Y′)轉化釀酒酵母,其中PtMT2b′Y′的生長菌落數比PtMT2b′C′菌株高37 %,能夠吸附溶液中約80 %的Cd.攜帶PtMT2b′Y′的突變酵母在錳(Manganese,Mn)和鐵(Ferrum,Fe)缺乏培養基中的生長略高于非轉基因酵母,說明該轉基因蛋白質可以螯合這些金屬.Sreeshma等[31]研究發現蛋白質結構中針對重要污染物Hg和鉻(Chromium,Cr)的特定金屬結合基序是寡肽,將寡肽展示在大腸桿菌和釀酒酵母等微生物的表面,菌株可以通過生物吸附有效去除天然Hg(Ⅱ)和Cr(Ⅵ).這些研究為釀酒酵母通過表面展示技術吸附重金屬離子提供良好的科學依據.

2.3 細胞內自體納米材料

微生物細胞的細胞膜能夠保持細胞內部離子與周圍環境平衡,細胞內部不產生任何金屬納米材料.然而,人為打破平衡可以在微生物細胞內產生納米材料.Ma等[32]將釀酒酵母在麥芽糖溶液中活化,通過呼吸作用產生二氧化碳,然后向培養劑中添加氫氧化鈣(Ca(OH)2)的飽和溶液使Ca2+和OH-進入酵母細胞內部.在堿性環境下,酵母細胞內的二氧化碳可以形成CO32-離子,Ca2+離子可以與來自細胞的生物分子如蛋白質和多糖相互作用,最后形成碳酸鈣(CaCO3)晶體.收集、洗滌和干燥產物可以得到含有CaCO3納米顆粒的改造釀酒酵母細胞.納米修飾酵母細胞對Cd的生物吸附能力是原始酵母細胞的2倍以上,對Pb的生物吸附能力是原始酵母細胞的3倍以上[33].細胞內部的CaCO3可作為儲存器,在pH值合適時可轉化為PbCO3或CdCO3,從而進一步增強酵母細胞吸附重金屬能力[34].含有納米礦物質的微生物吸附重金屬時充分利用了微生物內部晶體結構吸附重金屬,使吸附效率大大提高.

3 生物積累

細胞膜轉運體、細胞器存儲系統和螯合劑分子等幾個基本的金屬運輸組件對釀酒酵母吸收金屬離子是必不可少的.增加釀酒酵母對重金屬的生物積累涉及增加釀酒酵母細胞對重金屬吸收和耐受性.改造或異源表達細胞表面金屬轉運蛋白能夠增加釀酒酵母細胞對重金屬的吸收,設計對金屬轉運特異性的釀酒酵母,這將對礦區、油田等地區的特定重金屬污染有重要的意義.生物細胞內重金屬的抗性系統包括排斥、區室化、合成復合物或結合蛋白[35],促進重金屬離子區室化、增加金屬螯合和過表達金屬抗性的相關基因能夠增強酵母細胞對重金屬的耐受性.此外,在增加胞內金屬積累過程中,如果能夠控制重金屬積累位置和結晶度,將有利于重金屬的回收和再利用.

3.1 釀酒酵母對重金屬的吸收

3.1.1 改造金屬轉運蛋白

改造釀酒酵母重金屬轉運蛋白的表達水平能夠提高釀酒酵母對重金屬離子的攝取.Luk等[36]和Sun等[37]在酵母中用酵母半乳糖激酶(galactose metabolism,GAL1)啟動子過表達轉運Zn,Cu,Fe,Mn金屬離子的一組膜金屬轉運蛋白.研究發現過表達鋅轉運蛋白(Zinc-regulated transporter,Zrt)Zrt1,Zrt2和銅轉運蛋白(Copper transport,Ctr)Ctr1,Ctr3能夠使釀酒酵母對Zn和Cu的攝取量增加10倍[36];過表達鐵轉運蛋白(low-affinity Fe(Ⅱ) transport protein,Fet4)和錳轉運蛋白(Manganese transporter,Smf1)能夠使釀酒酵母對Zn,Cu,Fe,Mn的攝取量增加3～5倍[37].細胞中砷(Arsenic,As)和Cr通常以含氧鹽的狀態存在,如砷酸鹽、鉻酸鹽.由于磷酸鹽和砷酸鹽、硫酸鹽和鉻酸鹽具有空間相似性[38],過表達磷酸鹽通透酶(inorganic phosphate transporter,Pho)Pho84,Pho87,Pho89和硫酸鹽通透酶(sulfate permease,Sul)Sul1,Sul2能夠分別使砷酸鹽吸收增加3～5倍、鉻酸鹽吸收增加10倍以上.改造金屬轉運蛋白增強金屬吸收,需要注意增加蛋白質產量和提升蛋白質存在的穩定性以延長其表達壽命,同時應限制釀酒酵母因過量攝取重金屬離子導而致細胞功能受損.將SMF1的泛素化位點K33,34突變為精氨酸有助于減少Smf1蛋白降解,同時敲除泛素連接酶(bypass SOD defects protein 2,BSD2)可提高Smf1在細胞內的穩定性.通過甘油醛三磷酸脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)啟動子進行整合,進一步提高對Cd和Mn的吸收[37].

3.1.2 異源表達金屬轉運蛋白

研究發現在酵母細胞中異源表達水稻中對鋁(Aluminium,Al)具有選擇性吸收的植物天然抗性相關巨噬細胞蛋白(natural resistance-associated macrophage protein,Nramp)家族鋁轉運蛋白(NRAMP aluminum transport,Nrat1),與野生型相比,對Al的吸收增加了5倍以上,但是對Fe2+,Mn2+,Cd2+等二價金屬的吸收沒有明顯變化[39].因此,將其他物種中細胞表面金屬轉運蛋白在釀酒酵母細胞異源表達可以有效增加金屬離子的吸收.

3.1.3 設計吸收特異性金屬的釀酒酵母

采礦、紡織、石油行業會涉及特定金屬產生的污染,獲得對特定金屬吸附效率高的酵母細胞對解決環境重金屬污染具有重要意義.已有研究報道通過改造釀酒酵母膜蛋白,可以設計出轉運特定金屬的釀酒酵母.NRAMP在維持細胞內金屬穩態和應對環境重金屬壓力方面發揮著重要作用[40],NRAMP家族中的跨膜結構域(transmembrane domains,TM)TM1,TM4和TM6參與金屬選擇性吸收和轉運.同源分析發現釀酒酵母中SMF1與耐輻射奇球菌(Deinococcusradiodurans)和頭狀葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)中NRAMP家族蛋白具有同源性.Sun等[37]結合NRAMP點突變的晶體學和已有研究的信息,對SMF1跨膜結構域進行設計改造構建突變體庫,經過高通量篩選、測序分析并驗證確定有效突變位點后獲得SMF1突變體,該突變體可以特異性的轉運Cd和Sr,但對Mn的吸收降低10倍以上.這一研究為設計釀酒酵母特異性回收環境污染中的重金屬提供了新思路.

3.2 釀酒酵母的重金屬耐受性

3.2.1 促進金屬離子區室化

研究發現過表達液泡鐵轉運蛋白(cross-complementer of CSG1 protein,Ccc1)和金屬陽離子轉運體(cobalt uptake protein,Cot1)等能夠增加Cd2+在釀酒酵母的液泡儲存.過表達液泡轉運蛋白和改造釀酒酵母細胞表面金屬轉運蛋白能夠在增加重金屬離子吸收時具有疊加作用[37].因此,可以同時設計優化細胞表面和細胞器重金屬離子轉運蛋白,增加重金屬在酵母細胞內區室化和細胞的重金屬吸收量,降低重金屬對細胞的毒性影響,增強細胞的耐受性.

3.2.2 增加金屬螯合

谷胱甘肽、金屬硫蛋白和植物螯合素等金屬螯合劑能夠結合金屬,將重金屬離子從敏感的代謝功能中移除.設計釀酒酵母增加金屬螯合,能夠使釀酒酵母吸收更多的金屬離子.在發酵條件下,釀酒酵母硫酸鹽同化途徑會產生硫化氫(H2S),通過中斷釀酒酵母產生的硫化物的進一步轉化可以用于誘導金屬硫化物沉淀.研究發現敲除硫酸鹽同化途徑的天冬氨酸-半醛脫氫酶(aspartate-semialdehyde dehydrogenase,HOM2)、O-乙酰絲氨酸/O-乙酰高絲氨酸巰解酶(bifunctional cysteine synthase/O-acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase,MET17)和胱硫醚β合成酶(Cystathionine beta-synthase,CYS4)會迫使中間產物H2S排出,抑制硫化物向半胱氨酸和蛋氨酸等含有硫醇的生物分子的正常轉化,使得Cu,Cd,Hg和Pb的吸收量接近對照組的2倍[41].人類金屬硫蛋白2A(metallothionein 2A,MT2A),也稱MT2,是人類金屬硫蛋白家族的主要亞型.Geva等[42]通過誘導型CUP1啟動子(CUP1 promoter,pCUP1)異源表達人類金屬硫蛋白基因hMT2,產生改造的釀酒酵母菌株,能夠去除細胞中過多的Cu2+.來自小麥的植物螯合肽合成酶1(phytochelatin synthase 1,TaPCS1)通過GAP啟動子整合到釀酒酵母基因組進行蛋白表達,使Cd耐受性達到對照組的10倍,Cu,Zn,Mn和鈷(Cobalt,Co)的耐受性提高2～10倍[37].

3.2.3 篩選金屬耐受性相關基因

增加釀酒酵母對重金屬離子的耐受性的基因主要涉及谷胱甘肽代謝過程基因調控、緩解氧化應激相關的基因或蛋白、將重金屬從胞內運出或封閉在液泡內的轉運蛋白以及結合重金屬降低細胞毒性的金屬硫蛋白和植物螯合肽.表1列出了幾種典型的金屬耐受性相關基因及其功能.此外,篩選其他金屬耐受性相關的基因也能有效提高酵母細胞對重金屬耐受性.研究發現在重金屬壓力下,釀酒酵母中誘導減數分裂相關調節因子(signal transduction response regulator of IME2,RIM15)損傷會導致細胞對重金屬的耐受性增加[43].Chen等[44]對釀酒酵母工業菌株CEN.PK2-1c進行了基因組規模的過表達篩選,得到已知能夠提高鎘耐受性的鎘抗性基因(cadmium resistance,CAD1)和CUP1,以及研究較少的鎘抗性抑制子(copper-resistant suppressor,CRS5)、葡萄糖抑制基因負調控因子(negative regulator of glucose-repressed genes,NRG1)、蛋白質磷酸酶(protein phosphatase,PPH21)、14-3-3家族蛋白1(14-3-3 family protein 1,BMH1)和泛素醇-細胞色素c還原酶亞基(ubiquinol-cytochrome-c reductase subunit,QCR6),將篩選得到的Cd抗性相關的基因構建PRS416質粒并在酵母細胞中過表達,Cd的添加激活了CAD1,CRS5,CUP1和NRG1基因轉錄,將這4個基因進行兩兩組合優化,結果顯示CAD1和NRG1共表達時酵母細胞Cd耐受性最高,為進一步提高酵母抗Cd能力提供新途徑.

表1 釀酒酵母中典型金屬耐受性相關基因Tab.1 Metal Tolerance-related Typical Genes in Saccharomyces cerevisiae

3.3 釀酒酵母與重金屬回收

解吸劑解吸、焚燒等方式可以實現釀酒酵母和重金屬的分離.理論上通過合適的生物質解吸劑可以使吸附重金屬的釀酒酵母細胞再生并回收有價值的重金屬,但是針對不同的吸附條件,需要通過大量的實驗進行解吸劑的篩選,已有研究中采用的無機酸、有機酸、螯合劑等解吸劑的解析率可以達到85 %,但是這些方法的實用性低,會對釀酒酵母造成損傷,不適用于積累在釀酒酵母細胞內的重金屬回收.考慮到釀酒酵母價格比較便宜,結合重金屬后的釀酒酵母也可以直接采用強酸、高溫等方式處理.研究顯示550 ℃焚燒釀酒酵母與金屬的結合體4 h后,釀酒酵母的量減少98 %,燃燒后的灰燼可以通過微波輔助過程進行酸消化,得到的金屬溶液濃度是未處理時的170倍,最后將所得溶液進行堿性沉淀獲得高產率、高純度的金屬,得到的重金屬可以重復利用[51-52].

在化學沉淀中容易形成難以分離的大塊無規則形狀的物質,通常被傾倒在垃圾場填埋或焚燒[53-54].因此,控制沉淀物的形態和結晶度將有助于金屬離子分離.研究發現較慢的硫化氫產生速率有助于金屬擴散并成核到酵母細胞表面上,但此時這些沉淀是無序的非晶體結構.Sun等[41]敲除將硫化物轉化為氨基酸的基因使硫化物的產生速度減慢,并在酵母細胞中展示生物礦化肽促進金屬成核,使非晶體結構的沉淀轉化為更利于提取的硫化鎘點狀納米顆粒.其中金屬成核技術已經成功應用于病毒細菌等生物有機體,通過成核肽促進金屬硫化物的生長,有利于金屬硫化物的萃取和回收[55].今后的研究中如果能夠控制沉淀物的大小和結晶度,開發通過細胞壁直接進行金屬提取的方法,將會簡化金屬的回收,促進資源重復利用,為發展綠色生態提供新途徑.

4 結論與展望

上世紀90年代,生物學家開始開展用特定生物去除重金屬離子的研究.但是目前,生物凈化技術仍難以商業化.與傳統的物理、化學方式處理重金屬離子的方法相比,生物凈化雖然吸收重金屬的量有限,但是具有成本低、易獲得、不產生二次污染等優勢.釀酒酵母安全、經濟實惠、容易大量培養,已應用在各種有益的工業中,如被改造用于青蒿素、丁二酸、乳酸等的大規模生產,改造釀酒酵母提高其生物凈化效率的研究也一直在進行.

從增加釀酒酵母對重金屬的生物吸附和生物積累2個角度總結了改造釀酒酵母提高其生物凈化效率的方法.關于生物吸附,可以采用簡單的物理化學方法改造釀酒酵母,暴露重金屬吸附的表面基團、電荷.目前,全球發酵行業每年使用300萬噸酵母,酵母市場預計在未來5年將增長35 %,結合釀酒酵母的可降解性,發酵工業中殘留或剩余的酵母可以作為低價值資源大規模應用于去除水中的微量污染物,也可以減少資源浪費;生物積累角度,如果能夠通過改造釀酒酵母實現重金屬的大量攝取或貴重金屬的特異性回收,同樣存在重大的經濟效益.由于處理實際污染的復雜性,應用生物凈化處理重金屬污染仍然存在挑戰.開發高吸附力、高抗性、吸收特異性金屬的釀酒酵母工業菌株有待于進一步研究.基于以上方法,如果將改造釀酒酵母提高其生物凈化能力的多種方法進行總結、融合或許是一個有前景的研究方向.

釀酒酵母在處理重金屬污染領域還處于實驗和中試階段,實驗中采用的離心、過濾的方法分離釀酒酵母與重金屬結合物的方式成本較高,不適用于工業化的應用.開發無毒、傳質性能好、性能穩定的釀酒酵母固定載體在今后的研究中或許能有效的實現釀酒酵母的回收利用.釀酒酵母大規模用于生物凈化,特別是重金屬的沉淀和轉化,將對重金屬廢物的回收和再利用產生深遠的影響.