基于礦物元素指紋分析地理標志的品牌腐乳產地溯源*

趙四標，張加穩，王 燦，陳 嫻，刁玉華

(昆明市食品藥品檢驗所 食品檢驗中心，云南 昆明 650034)

腐乳在我國有悠久的歷史[1]，具有儲存時間長、風味獨特、食用方便、營養物質豐富等優點[2].這種發酵食品，以其低廉的價格、美味的口感而被廣泛選用[3]，一直深受消費者的青睞.尤其是油腐乳，它以細膩的口感和香甜的滋味[4]，成為云貴川地區獨具特色的發酵食品，深受當地人民的歡迎.牟定腐乳作為省級地理標志產品[5]，在云南轄區內知名度高，受眾面廣，但在流通過程中，品牌較多、工藝水平差異大、質量參差不齊等食品安全問題日益突出[6-8]，引起消費者和相關部門關注.

越來越多科研工作者通過產地溯源、產地保護、元素指紋鑒定等技術手段參與到地理標志產品和食品安全保護中.隨著礦物元素指紋分析技術的發展，它已經成為一種重要的產地溯源手段，被廣泛應用于各種農產品的生產之中.從馬鈴薯[9]、食用油[10]、葡萄酒[11]、蜂蜜[12]、茶葉[13]、大米[14-16]、大豆[17]、咖啡[18]、苦蕎[19]等植物性農產品，到包括羊肉[20]、牛肉[21]、豬肉[22]在內的動物性農產品，都可以通過這種方式進行溯源，上述研究結果顯示，基于礦物元素的分析技術在產地溯源、元素指紋鑒定等領域，具有科學性、準確性和普遍性，可以有效地幫助企業實現溯源目標.現有關于腐乳的研究主要集中在安全性[23]、微生物種群[24，25]、風味物質[26，27]、營養成分[28]及制作工藝[29，30]等方面，而關于礦物元素指紋分析應用于腐乳產地溯源尚未見相關報道.

本研究擬以不同產區不同品牌的31個腐乳樣品為實驗材料，通過礦物元素含量分析討論，開展腐乳產地判別研究，建立適合于腐乳中礦物元素指紋分析的方法，為地理標志產品牟定腐乳開展產地判別、品牌鑒定及產地溯源保護提供一定的參考與依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ICP分析用26種元素標準溶液，使用Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb多元素標準溶液(內標液)(標液元素質量濃度分別為 100 μg/mL、10 μg/mL，標液介質為15%(V/V)HCl，5%(V/V)HNO3，2%(V/V)HF)；國家標準樣品汞單元素標準溶液(以上標液來源于國家有色金屬分析測試中心，濃度為 1 000 μg/mL，標液介質為 1 mol/L HNO3，唯一標識：211002-7)；硝酸(優級純、川東化工)；過氧化氫；待測樣品腐乳；超純水(18.2 MΩ·cm).

1.2 儀器與設備

電感耦合等離子體質譜儀(廠家：賽默飛，型號：ICP-MS iCAP Q)、微波消解儀(廠家：安東帕、型號Multiwave PRO、聚四氟乙烯消解罐41支)、分析天平(梅特勒、型號AL104，感量為 0.000 1 g)、自動控溫恒溫電熱板(BHW-09A45)、超純水機(賽多利斯ariumbagtank 50)、高純氬氣(純度>99.999%)、高純氦氣(純度>99.999%).

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

隨機采集3個產地，14個品牌的市售腐乳產品，共計31個樣品，采樣相關信息見表1.將隨機采集的腐乳樣品調制均勻待用.

表1 樣品信息表

1.3.2 樣品分析

為了準確地檢測腐乳樣品中各種礦物元素含量，按照現行國標GB 5009.268—2016[31]開展實驗.稱取 0.300 g 腐乳樣品置于消解罐中，加入 7 mL 濃硝酸后放置過夜，之后按照GB 5009.268—2016第一法的升溫方式進行消化處理，以確保消解完全.消解完成后，使用控溫電熱板 80 ℃ 趕酸 1.5 h，純水定容至 50 mL，待測.使用經調諧后，各元素靈敏度、氧化物、雙電荷各參數條件符合的電感耦合等離子質譜儀測定樣品中Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Mn、Ni、Ti、V、Cr、Cd、As、Se、Sr、Tl、Pb、Mo、Co、Sn、Sb、Ba、Hg 24種元素的含量，用外標法進行定量，通過三通在線添加內標進行校正.電感耦合等離子體質譜儀的工作條件參照GB 5009.268—2016附錄B儀器參考條件B.1.檢測過程中實時監測內標回收率在90%～110%之間，偏差高于±10%時，重新測定，單個腐乳樣品采用連續重復測定3次后取平均值進行定值.

1.4 數據處理

使用Excel 2019與SPSS 19兩種不同的數據處理軟件，解析出不同的分析結果，包括方差分析、主成分分析、判別解析以及聚類分析.

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

對不同元素的線性方程、相關系數、相關標準偏差、檢出限和定量限進行考察，見表2，結果顯示：各種元素的標準工作曲線的線性關系好，相關系數R2均大于等于 0.999 5，檢出限和定量限都很低，該檢測方法科學、準確、可行，能夠準確測定腐乳中24種元素含量.

表2 各元素的線性回歸方程及相關參數

2.2 不同產地腐乳中礦物元素含量差異分析

不同產地腐乳中無機元素含量對比見表3，該表中均值是指同一產地中同一元素的含量平均值，先通過平均值算出標準差，再通過均值、標準差計算得到表4中的平方和、均方、F值和P值.P值是一個關鍵指標，根據表3、表4的數據可以看出，24種礦物元素中，有11種元素(Na、V、Cr、Mn、Fe、Zn、As、Se、Sn、Ba、Tl)的P值超過了0.05，這意味著它們之間的差異并不顯著，而另外13種元素的P值則低于0.05，這意味著它們之間的差異顯著，由此可見：腐乳中部分元素的含量會因地域不同而有顯著的差異.

表3 不同產地腐乳中無機元素的含量對比 mg/kg

表4 不同產地腐乳中無機元素的含量方差分析結果統計

續表4

2.3 礦物元素含量主成分分析

主成分分析是指應用礦物元素含量數據基礎上計算得到的初始特征值、提取平方和載入結果等參數，找出數據群體中主要影響因子，用數據群體中的少數關鍵性、特征參數、重要指標或單個因素可以用來代表數據群體中的其余眾多指標或因素，從而將問題簡化的一種多元統計分析方法[32，33].采集31個腐乳樣品中礦物元素的主成分分析如表5所示，提取匯總數據中初始特征值大于1的成分作為基礎數據進行成分分析研究，得到前8個主成分貢獻率分別為17.439%、16.532%、15.377%、8.732%、6.941%、5.899%、5.681%、4.351%(表5)，篩選出的8個主成分的累積貢獻率達到了80.957%，它們能夠完整地展示、重現、描述各種來源的腐乳樣本的各種元素的含量及其構成，從而更好地把握其本質特征.

通過對礦物元素的主成分分析，可發現了表6中的前8個主要因子，對這些因子進行了特征向量劃分，以便更清晰地識別出其中的關鍵元素，目的在于能夠更準確地分析出這些元素.

表5 腐乳樣品中礦物元素含量的主成分分析

表6 腐乳樣品中24種礦物元素的主成分貢獻率分析 %

續表6 %

通過分析礦物元素的主成分，可以從表5中獲取信息.按照張新昕[9]、鹿保鑫[34]的方法，一一挑選出腐乳樣品中的各種元素.將第1個、第2個因子的載荷值分開，并將它們的絕對值分布在圖1、圖2上(原數據見表6)，以便更好地理解它們的特性.這些因子的載荷值有助于更準確地識別出各種元素，從而更好地分析出腐乳的組成成分.隨著載荷值的增加，元素的方差貢獻也會增加，從而使得分析結果更加準確.根據圖1，Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn、K、Na、Ca、Pb的載荷值均超過了0.40，表明這10個元素的載荷值相對更高，能夠更好地反映第1個主成分的特征.K、Ca、Sr、Pb 4個重要的金屬元素的載荷值絕對值不僅在第1主成分載荷值超過0.40，且在第2個主成分因子中介于0.48～0.75之間，值較大，4個元素也能夠準確地揭示出第2個主要組成部分的含量.結合第1、2主成分因子的載荷值絕對值含量，Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn、K、Na、Ca、Pb這10個元素不僅能提供有價值的區域性信息，而且還能提供有效的腐乳產地追蹤依據.

圖1 第1主成分因子載荷值的絕對值

圖2 第2主成分因子載荷值的絕對值

2.4 不同產地腐乳礦物元素含量判別分析

2.4.1 不同產地腐乳礦物元素含量的判別和分類分析

通過對不同產地腐乳樣品中24種礦物元素含量分析，可以準確識別云南省楚雄州牟定縣、昆明市石林縣、貴州省貴陽市三大主要食品產區的腐乳，利用Fisher函數、交叉檢驗，采取逐步判別法進行判別分析[15，33]，分析結果表明：楚雄牟定、昆明石林、貴陽判別正確率分別為100%、100%、96%，利用24種礦物元素之間的含量差異，可以將貴州省和云南省楚雄州兩大生產區進行區分，以此實現昆明市石林縣、楚雄州牟定縣原產地的溯源，能夠滿足腐乳產品的溯源要求.

在產地判別應用中，如果同時測定24種礦物元素含量，對儀器設備、標準物質、試劑耗材等消耗較大，檢測周期長，經濟成本較高.為了更有效地識別產地，可使用SPSS軟件的識別功能，篩選出有效的礦物物元素.在確保識別準確性的前提下，可采用逐步識別的方法來追蹤不同地區的腐乳樣品的產地.經過分析，發現6種元素被納入了判別模型，它們分別是Co、Cu、Cd、Hg、Sr和Sn.經過回代檢驗，這些元素的正確判別率達到了93.5%，可以滿足實際工作需求.根據這些元素的特性，建立了一個線性判別函數，具體系數參見表7.

表7 判別式分類函數系數

2.4.2 驗證判別分析結果

為驗證主成分分析的可靠性，采集楚雄牟定腐乳6份，貴陽腐乳2份，并將3個產區的31個腐乳樣品的礦物元素數據以及用于判定的8份腐乳樣品作為分組變量進行結果判別.通過判別6個礦物元素指標、6個判別組樣品均判別準確，昆明石林、楚雄牟定2個產地樣品存在錯判率，交叉檢驗的錯判率為3.3%小于10%，錯判率較小，可以實現對腐乳產地判別的實際應用價值，證明6種礦物元素Co、Cu、Cd、Hg、Sr、Sn，對貴州貴陽和云南省內腐乳，以及楚雄牟定和昆明市石林生產的腐乳都具有有效的判別能力，可以很好地把楚雄牟定腐乳區分出來.

2.5 基于礦物元素含量的聚類分析

圖3 不同腐乳產地的礦物元素聚類分析

使用SPSS 19.0軟件，將不同產地的31個參試腐乳樣品(包含14個腐乳品牌)中24種元素進行聚類分析，采用Ward聚類方法計算歐式距離，用最短距離法得到樹狀圖[9]，結果如圖3所示.以最小分類級別為分割線，所有樣品可以分為6類，其中牟定與貴陽產地腐乳元素含量的歐式距離較遠，被完全分離，其礦物元素組成差異較大，牟定與石林樣品存在交叉現象，同時也發現牟定樣品也被劃分為5類，石林不同地區在礦物元素的組成上存在較大差異，證明了礦物元素的組成也可應用于石林不同品牌腐乳的品牌鑒別、產地區分.

3結論

通過對腐乳樣品中礦物元素含量和組成進行分析，說明不同產地腐乳中不同礦物元素組成和含量均存在顯著差異.使用Fisher函數和逐步判別分析法，可以準確地識別出腐乳中礦物元素含量，再通過對腐乳中礦物元素含量的方差分析、主成分分析、判別分析進行礦物元素特征指標確認，結合Ward聚類分析計算歐式距離，并使用最短距離法生成樹狀圖.通過判別分析結果的驗證，結果表明：

96.7%的樣本中含有Co、Cu、Cd、Hg、Sr和Sn 這6種重要的金屬元素，判別結果良好，可以作為楚雄州牟定縣腐乳產地區分、品牌溯源的關鍵指標.本研究利用微波消解進行樣品前處理，結合電感耦合等離子體質譜法同時測定腐乳中的24種礦物元素，由于腐乳加工工藝成熟，具有地域特色，影響因素較小，數據準確、結果可信度高、可行性強，故該技術可以作為腐乳的產地溯源和質量控制的有效指標，實現對腐乳的產地溯源、質量控制、特色地理標志食品的保護、真偽鑒別等目的.