人脂肪間充質干細胞來源外泌體聯合黃芪多糖對心肌損傷保護機制研究

郭彩茹, 劉欣欣, 牛宇杰, 賈富鑫

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)發病急,病死率高,嚴重威脅人類健康。再灌注治療可使AMI患者預后得到改善,但缺血再灌注也會損傷機體組織。有研究發現,AMI患者即使接受及時的再灌注治療,住院死亡率仍有5.4%,住院期間心力衰竭發生率達14.2%,缺血再灌注損傷是影響患者最終梗死面積和預后的重要因素[1]。因此,減輕AMI患者缺血再灌注損傷,改善患者的預后,是目前心血管領域亟待解決的難題。有研究顯示,人脂肪間充質干細胞來源外泌體(human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomes,Exosome-HADSCs)可通過促細胞存活,促進血管生成、抗炎、免疫調節和抑制纖維化,改善心肌功能,在預防或治療心血管疾病方面具有巨大的應用潛力[2-4]。但是,Exosome-HADSCs治療仍存在治療靶向性欠佳的問題,且在心肌缺血、缺氧的環境下,僅憑少量的外泌體難以從根本上改善心肌梗死區以及梗死邊緣區惡劣的微環境。黃芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是從豆科植物黃芪干燥根莖中提取的一種水溶性雜多糖,已被證實具有降血脂、抗炎和抗氧化等作用[5]。本課題組的前期研究表明APS對心肌細胞過氧化氫損傷有保護作用[6]。也有研究應用APS來干預干細胞,結果顯示APS可通過動員干細胞遷移、促進增殖、誘導分化及干預外泌體的方式,增強干細胞移植修復梗死心肌的治療效果,改善心臟功能[7-9]。因此推測APS有可能通過改善局部微環境的炎癥反應、降低細胞凋亡、促進血管再生等方面,提高Exosome-HADSCs治療的有效率,從而加強Exosome-HADSCs的心肌保護作用。本研究通過心肌細胞AC16體外氯化鈷(CoCl2)損傷模型探索Exosome-HADSCs聯合APS在心肌損傷修復中的作用,旨在為進一步改善AMI患者預后提供新的思路和治療靶點?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及主要試劑 AC16細胞購自賽百慷(上海)生物技術股份有限公司。DMEMF/12細胞培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Gibco公司。人脂肪間充質干細胞(human adipose mesenchymal stem cells,HADSCs)、人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),以及無外泌體的HADSCs專用培養基、HUVECs專用培養基購自OriCell賽業(廣州)生物科技有限公司。外泌體提取試劑盒購自于鄭州貝貝生物科技有限公司。CD63、腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)、CD9一抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關x蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)、蘇氨酸-絲氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,Akt)、GAPDH一抗,以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG H&L購自北京博奧森生物技術有限公司。ECL化學發光檢測試劑盒購自蘇州新賽美生物科技有限公司。APS、CoCl2、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、CCK8試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)購自北京索萊寶科技有限公司。細胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)購自上海碧云天生物技術有限公司。PVDF膜購自Millipore公司。Matrigel基質膠購自于美國BD公司。

1.2主要儀器 二氧化碳培養箱(Thermo,型號:3111)。透射電鏡(Hitachi,型號:HT7700)。熒光顯微鏡(徠卡,型號:DMI4000B)。酶標儀(PerkinElmer,型號:VICTOR X3)。電泳儀(Bio-Rad,型號:Bio-Rad Mini-PROTEANTetra Systems)。蛋白轉印儀(Bio-Rad,型號:Bio-Rad Mini Trans-Blot)。凝膠成像儀(上海天能,型號:Tanon 5200 Multi)。

1.3細胞培養 AC16細胞使用含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEMF/12培養基進行培養,HADSCs和HUVECs使用對應的專用培養基進行培養。細胞培養箱條件設置為37 ℃,5% CO2。每2～3 d換一次液,待細胞生長密度達80%～90%時進行傳代。

1.4Exosome-HADSCs提取、鑒定及內化實驗 收集傳代培養48 h、處于對數生長期的HADSCs細胞培養上清液,按照外泌體提取試劑盒說明書步驟提取Exosome-HADSCs。使用透射電鏡對提取的Exosome-HADSCs進行形態學觀察。通過Western blot實驗檢測Exosome-HADSCs特異性標志物CD9、CD63、TSG101的表達情況。按照細胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)說明書步驟標記外泌體,將標記的外泌體與AC16細胞共孵育4 h,棄上清。以DAPI核染5 min,PBS清洗3次,熒光顯微鏡下拍照,觀察AC16內化外泌體情況。

1.5血管形成實驗評估HUVECs成管能力 將Matrigel基質膠用無血清培養基按1∶2稀釋,在冰上鋪于96孔板內,60～70 μl/孔,置于37 ℃培養箱中孵育30 min。取對數生長期HUVECs,分別用培養基(control組)、含20 μg/ml Exosome-HADSCs培養基(Exo組)、含100 μg/ml APS培養基(APS組)、含20 μg/ml Exosome-HADSCs+100 μg/ml APS培養基(Exo+APS組)進行重懸,調整密度為4×105cells/ml,取100 μl接種于Matrigel基質凝膠表面,培養箱中繼續孵育4 h后在顯微鏡下觀察、拍照。使用ImageJ軟件對各組形成血管網格數量進行統計,每組3個復孔,行3次獨立重復實驗。

1.6劃痕實驗評估HUVECs細胞遷移能力 取對數生長期HUVECs進行胰酶消化,離心后按方法1.5的分組方法進行處理,調整細胞密度為3×105cells/ml,每孔2 ml,種植于6孔板中。待細胞貼壁后用無菌1 ml移液槍頭在細胞中央均勻劃1條痕,用PBS洗去漂浮細胞,換新鮮培養基,顯微鏡下拍照記錄。將6孔板放置于培養箱繼續培養,于24 h、48 h時間點在顯微鏡下拍照記錄。使用ImageJ軟件計算不同時間點的劃痕面積,48 h細胞遷移率=(0 h劃痕面積-培養48 h后劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。每組3個復孔,行3次獨立重復實驗。

1.7心肌缺氧損傷構建與修復實驗分組 通過500 μmol/L氯化鈷(CoCl2)處理AC16心肌細胞12 h構建心肌缺氧損傷模型。取對數生長期AC16細胞用不含FBS的DMEMF/12培養基進行饑餓處理12 h后按下述方法進行干預。(1)control組:正常培養AC16細胞,不進行CoCl2損傷處理;(2)CoCl2組:CoCl2(500 μmol/L)損傷處理12 h后,用不含Exosome-HADSCs和APS的培養基繼續培養48 h;(3)CoCl2+Exo組:CoCl2(500 μmol/L)損傷處理12 h后,用含Exosome-HADSCs(20 μg/ml)的培養基修復48 h;(4)CoCl2+APS組:CoCl2(500 μmol/L)損傷處理12 h后,用含APS(100 μg/ml)的培養基修復48 h;(5)CoCl2+Exo+APS組:用CoCl2(500 μmol/L)損傷處理12 h后,用含Exosome-HADSCs(20 μg/ml)和APS(100 μg/ml)培養基修復48 h。

1.8CCK8實驗評估AC16細胞存活率 取對數生長期AC16細胞5×104cells/ml,100 μl/孔接種至96孔板,按照方法1.7的分組及干預方法進行處理,結束后每孔加10 μl CCK8試劑,培養箱中孵育2 h。用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值(OD值)。細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(control組OD值-空白孔OD值)×100%。每組3個復孔,行3次獨立重復實驗。

1.9Tunel細胞凋亡實驗檢測AC16細胞凋亡情況 取對數生長期AC16細胞1×105cells/ml,1 ml/孔接種至24孔板,按照方法1.7的分組及干預方法進行處理,結束后棄上清液,PBS清洗3次。加入200 μl/孔Tunel工作液,室溫下避光孵育30 min,棄工作液。加入DAPI,室溫避光染色5 min,PBS清洗3次。立即于熒光顯微鏡下進行觀察、拍照,視野中DAPI藍染為細胞核,Tunel紅染為發生凋亡的細胞。使用ImageJ軟件統計細胞數量,細胞凋亡率=每個視野中紅染凋亡細胞數/藍染細胞數×100%。每組細胞計數5個視野,取平均值。每組3個復孔,行3次獨立重復實驗。

1.10Western blot檢測凋亡相關蛋白及PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達水平 取對數生長期AC16細胞按照6×105cells/孔接種于6孔板中,按照方法1.7的分組及干預方法進行處理AC16細胞,胰酶消化細胞。按照全蛋白提取試劑盒步驟提取各組細胞蛋白,使用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度,調整各組蛋白濃度一致。取15 μg蛋白,用10%的SDS-PAGE凝膠電泳(80～120 V)分離蛋白,在300 mA、90 min的條件下將蛋白轉移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉處理PVDF膜1 h。加入caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、GAPDH一抗液(1∶1 000稀釋),4 ℃條件下避光孵育過夜。TBST液洗膜3次,10 min/次,加入二抗液(1∶1 000稀釋),室溫避光孵育1 h。TBST溶液洗膜3次,10 min/次。滴加ECL發光液后用凝膠成像儀進行拍照,以GAPDH為內參,使用ImageJ軟件對蛋白條帶進行定量分析。重復3次獨立實驗。

2 結果

2.1Exosome-HADSCs鑒定及內化結果 經過磷鎢酸染色,透射電子顯微鏡下可見的Exosome-HADSCs直徑70～150 nm,呈圓形或橢圓形,呈“杯托”樣結構的囊形小泡,見圖1?。Western blot實驗結果顯示其外泌體標記蛋白CD9、CD63和TSG101呈陽性表達,見圖1?。提示成功提取到外泌體。紅色熒光染料DiI標記的外泌體與AC16細胞共孵育4 h后,熒光顯微鏡下顯示外泌體分布在AC16細胞核周圍,提示外泌體被AC16細胞攝取,見圖2。

?透射電子顯微鏡下所見(箭頭所指為Exosome-HADSCs);?Werstern blot實驗結果圖

圖2 DiI標記的Exosome-HADSCs內化實驗結果圖(×400)

2.2Exosome-HADSCs聯合APS對HUVECs血管形成的影響結果 與control組相比,Exo組、APS組和Exo+APS組形成血管網格數量顯著增多(P<0.05),且Exo+APS組形成血管網格的數量顯著多于Exo組和APS組(P<0.05)。見圖3。

?HUVECs細胞血管形成實驗結果圖(×100);?四組形成血管網格數量比較(F=312.400,P<0.001;*P<0.05)

2.3Exosome-HADSCs聯合APS對HUVECs遷移能力的影響結果 劃痕實驗結果顯示,與control組相比,Exo組、APS組和Exo+APS組的HUVECs細胞遷移率更高,差異有統計學意義(P<0.05),且Exo+APS組細胞遷移率較Exo組和APS組更高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

?劃痕實驗結果圖(×50);?四組細胞遷移率比較(F=87.010,P<0.001;*P<0.05)

2.4Exosome-HADSCs聯合APS對心肌細胞存活率的影響結果 與control組相比,CoCl2組細胞存活率顯著降低(P<0.05)。與CoCl2組相比,CoCl2+Exo組、CoCl2+APS組和CoCl2+Exo+APS組的細胞存活率提高,且CoCl2+Exo+APS組的細胞存活率較CoCl2+Exo組和CoCl2+APS組更高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注:F=175.600,P<0.001;*P<0.05

2.5Exosome-HADSCs聯合APS對AC16心肌細胞凋亡的影響結果 Tunel實驗結果顯示,與control組相比,CoCl2組細胞凋亡率顯著增高(P<0.01),提示心肌缺氧損傷模型構建成功。與CoCl2組相比,CoCl2+Exo組、CoCl2+APS組和CoCl2+Exo+APS組的細胞凋亡率更低,且CoCl2+Exo+APS組的細胞凋亡率較CoCl2+Exo組和CoCl2+APS組更低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。Western blot實驗結果顯示,與control組相比,CoCl2組caspase-3、Bax蛋白表達水平增高,Bcl-2蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與CoCl2組相比,CoCl2+Exo組、CoCl2+APS組、CoCl2+Exo+APS組caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),且CoCl2+Exo+APS組表達水平變化趨勢更明顯。見圖7。

?Tunel實驗結果圖(×100);?五組細胞凋亡率比較(F=250.700,P<0.001;*P<0.05)

?Western blot實驗結果圖;?五組caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較(F=632.200,P<0.001;F=194.600,P<0.001;F=260.300,P<0.001;*P<0.05,ns為P>0.05)

2.6Exosome-HADSCs聯合APS對PI3K-Akt信號通路的影響結果 Western blot實驗結果顯示,與CoCl2組相比,CoCl2+Exo組、CoCl2+APS組和CoCl2+Exo+APS組的PI3K、p-PI3K、Akt蛋白表達水平均顯著上升(P<0.05),且CoCl2+Exo+APS組的表達水平上升趨勢更明顯(P<0.01)。見圖8。

?Western blot實驗結果圖;?五組Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達水平比較(F=184.400,P<0.001;F=25.240,P<0.001;F=236.500,P<0.001;*P<0.05,ns為P>0.05)

3 討論

3.1外泌體是主動或被動釋放到細胞外的直徑30～150 nm的納米級囊泡,其生成以后便以胞吐形式從細胞內釋放到細胞外[10-12]。干細胞主要是通過旁分泌途徑發揮作用,其中外泌體起到重要作用,外泌體通過介導miRNA與相關蛋白或靶基因的表達,在抑制心肌細胞凋亡、抗心肌組織纖維化、促進血管新生、促進內源性細胞修復、減緩心室重構、改善心功能方面發揮作用[13-15]。APS由豆科植物蒙古黃芪的干燥根莖無菌提取,具有抗氧化、抗炎、免疫調節、抗腫瘤及抗病毒等多重作用[16-18]。

3.2AMI是一種危重疾病,通常伴有血管生成功能障礙[19]。在心肌缺血期間,為心臟供血的血管變窄,導致心臟血液和營養供應不足[2]。有研究表明,間充質干細胞外泌體中的缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)過表達能夠促進受損的血管生成、遷移和增殖,并通過上調促血管生成因子和促進新血管形成來發揮心臟保護作用[19]。本研究HUVECs血管形成實驗結果顯示,與control組相比,Exosome-HADSCs、APS干預均可增加HUVECs生成血管網格的數量,且Exosome-HADSCs聯合APS處理的效果更加顯著。HUVECs劃痕實驗結果顯示,與control組相比,Exosome-HADSCs、APS均可促進HUVECs的遷移,Exosome-HADSCs聯合APS干預可進一步促進HUVECs遷移。因此推測在心肌缺血再灌注損傷過程中,Exosome-HADSCs聯合APS可能通過促進內皮細胞血管生成和遷移,從而減少心肌細胞凋亡。

3.3細胞凋亡是由多基因調控的細胞自主的有序的死亡過程。其中Bcl-2為抑凋亡因子,Bax為促凋亡因子。Bcl-2主要在凋亡的上游發揮作用,它能夠與Bax蛋白結合形成異二聚體,抑制Bax蛋白的促凋亡作用[20]。caspases家族是細胞凋亡過程中的調控因子,其中caspase-3被認為是介導細胞凋亡的重要因子之一[21]。有研究顯示,間充質干細胞外泌體可顯著降低凋亡標志物caspase-3、Bcl-2關聯死亡啟動子(Bcl-2 associated death promoter,Bad)和Bax的表達水平,并上調心肌梗死大鼠的抗凋亡因子Bcl-2的水平[22]。本課題組的前期研究發現APS能夠有效降低過氧化氫引起的心肌細胞凋亡并調節凋亡相關基因和蛋白的表達[6]。本研究也得出相似的結論,Exosome-HADSCs聯合APS干預可降低經CoCl2損傷處理的AC16心肌細胞的凋亡率,且作用效果較單獨使用Exosome-HADSCs或APS干預更加顯著。這可能是因為APS具有抗炎、抗氧化應激作用,可以協同提高Exosome-HADSCs抗心肌細胞凋亡的效果。

3.4PI3K/Akt途徑是一種細胞內信號轉導途徑,響應細胞外信號,促進代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等生物學行為。有研究表明骨髓間充質干細胞來源的外泌體通過PI3K/Akt途徑減輕過氧化氫誘導的心肌損傷[23]。間充質干細胞外泌體可通過提升腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)水平,減少氧化應激并激活PI3K/Akt通路增強心肌活力,減輕缺血再灌注后的不良心臟重塑[24]。陳廣琴等[25]的研究發現APS可通過PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路抑制自噬改善心肌細胞凋亡。本研究也觀察到Exosome-HADSCs聯合APS在修復CoCl2損傷的心肌細胞過程中,PI3K、p-PI3K、Akt蛋白的表達水平均顯著升高,說明Exosome-HADSCs聯合APS可能通過PI3K/Akt途徑抑制心肌細胞的凋亡和促進心肌細胞增殖。

綜上所述,Exosome-HADSCs聯合APS可能是一種潛在的心血管疾病治療方式,其保護作用可能是通過激活PI3K/Akt通路實現,研究結果為臨床中西醫結合治療缺血再灌注后的心肌損傷提供了理論依據。