植物蛋白飲料中蛋白質含量的測定結果不確定度評價

劉順

（荊州職業技術學院，湖北荊州 434000）

植物蛋白飲料的蛋白質含量是目前我國市場監督抽檢項目的重要理化指標，涉及的產品種類主要有豆乳飲料、椰子乳、杏仁乳、核桃乳[1]，其依據的判定要求為產品明示標準或產品明示質量要求。通過總結國家市場監管總局關于食品抽檢不合格情況的通告，發現植物蛋白飲料的質量指標[2,3]不達標問題主要集中于蛋白質項目，為保障食品檢驗項目的準確性有必要探究檢測蛋白質結果的不確定度[4-8]。

目前植物蛋白飲料中蛋白質含量的測定方法[9]為GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（第一法 凱氏定氮法），相較于GB 5009.5-2010 版標準，增加了常見食物中氮折算成蛋白質的折算系數，新標準對產品不同產品類別的計算結果更加具有針對性、科學性。標準中規定的第一法可采用自組裝的定氮蒸餾裝置或者自動凱氏定氮儀[10]，自組裝蒸餾裝置結束蒸餾后再通過手動滴定法滴定至終點，自動凱氏定氮儀可實現自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數據的過程，兩種滴定方法均是通過混合指示劑顏色變化確定滴定終點。標準中對于液體試樣要求稱樣量為10 g～25 g（約相當于30 mg～40 mg 氮），植物蛋白飲料標稱的蛋白質含量換算為30 mg 含氮量，而一般市場銷售的自動凱氏定氮儀配置的滴定儀在滴定體積達到40.00 mL 后可能出現滴定杯液溢出，進而導致滴定終點的體積測定不準確影響最終結果的準確度。對于自組裝定氮蒸餾裝置因采用傳統手動滴定法，通過選擇合適體積的接受瓶及四氟滴定管即可保證滴定至終點。本文擬采用自動凱氏定氮儀的蒸餾部分與手動滴定部分結合后，依據CNAS-GL006《化學分析中不確定度的評估指南》[11]和RB/T 030《化學分析中測量不確定度評估指南》對植物蛋白飲料中蛋白質含量的測定結果不確定度進行分析[12-15]，通過對測量過程中不確定度來源分析，減小對檢測結果產生較大影響的不確定度，進而提高食品檢驗過程的質量控制能力和檢測結果的準確度。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

全自動凱氏定氮儀：K-360 型，瑞士步琦實驗室儀器有限公司；電子天平：ME204/02 型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；能力驗證樣品（豆奶飲料）：中位值蛋白質1.90 g/100 g，中國食品藥品檢定研究所；硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、氫氧化鈉、95%乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；無水碳酸鈉：基準PT，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 蛋白質的測定

參照GB 5009.5-2016（第一法）：食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量計算氮含量，再乘以換算系數，即為蛋白質的含量。

1.3 計算公式

根據標準檢測方法，食品中蛋白質的測定按式（1）進行計算：

式中：m-試樣質量，g；V1-試樣消耗硫酸標準溶液體積，mL；V2-空白消耗硫酸標準溶液體積，mL；C-硫酸標準溶液的實際濃度，mol/L；0.014 0-1.0 mL 硫酸標準滴定溶液相當的氮的質量，g；100-換算系數；F-氮換算為蛋白質的系數（各種食品中氮換算系數見標準附錄A）；X-檢測結果，g/100 g。

1.4 蛋白質測定不確定度影響因素分析

根據GB 5009.6-2016 第一法測定質控樣品中蛋白質含量的測量不確定度分析來源主要有檢測過程重復性引入的不確定度urel(r1a)、試樣質量引入的不確定度urel(m1a)、滴定管滴定引入的不確定度urel(V1a)、硫酸標準溶液引入的不確定度urel(c1a)。

2 結果與分析

2.1 檢測過程重復性引入的不確定度urel(r)評定

對于檢測過程重復性引入的不確定度urel(r)，依據檢驗標準檢驗方法，指示劑滴定法8 次測得豆奶樣品蛋白質含量的均值為1.851 g/100 g（1.841，1.837，1.859，1.838，1.841，1.832，1.882，1.875），計算標準偏差S和檢測過程重復性引入的不確定度urel(r)。

2.2 質量稱量引入的不確定度urel(m)

天平校準產生的不確定度一般由天平計量證書給出，按標準要求準確稱量樣品精確至0.001 g，最大允許誤差±5 mg，按均勻分布評定，取，則：

2.3 配制硫酸標準溶液的不確定度urel(c)

根據GB/T 601-2016 進行硫代硫酸鈉標準溶液的配制及標定：

式中：m-基準試劑質量，g；V-試樣消耗硫酸標準溶液體積，mL；V0-空白消耗硫酸標準溶液體積，mL；M-無水碳酸鈉的摩爾質量濃度，g/mol；硫酸標準溶液的實際濃度，mol/L。

（1）標定重復性引入的不確定度分量：平行測定8 次所得硫酸標準溶液濃度均值為0.102 12 mol/L（0.102 17，0.102 08，0.102 18，0.102 05，0.102 08，0.102 18，0.102 09，0.102 16），對于檢測過程重復性引入的不確定度ur(rep)：

（2）稱量Na2CO3引入的不確定度分量：天平校準產生的不確定度一般由天平計量證書給出，按標準要求準確稱量樣品精確至0.000 01 g，最大允許誤差±0.05 mg，按均勻分布評定，取，則：

基準試劑無水碳酸鈉引入的不確定度主要來源于純度和摩爾質量，根據標準證書記錄的純度（99.99±0.02）%，摩爾質量的相對不確定度由國際理論（化學）與應用化學聯合會（IUAPC）查表得到在實際應用時可忽略不計，按均勻分布計算得純度和摩爾質量的不確定度：

（3）滴定基準物質消耗硫酸標準溶液體積引入的不確定度分量

①50 mL A 級滴定管：校準證書誤差為0.05 mL，按三角形分布考慮，則u1(V)=0.05=0.020 4 mL。

②實驗室溫度波動引入的不確定度分量u2(V)：標準情況下溫度為20℃，而實驗室溫度在±4℃波動，水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1，溫度效應引起的體積變化為均勻分布，，則u2(V)=39.98×2.1×10-4=0.004 85。

③將u1(V)、u2(V)兩個分量合成，得到：

（4）玻璃量器引入的不確定度分量：依據GB 5009.5-2016 所用硫酸標準滴定溶液濃度為0.050 0 mol/L，因此將0.102 1 mol/L 硫酸溶液稀釋至0.051 05 mol/L，具體操作：取50 mL 0.102 1 mol/L 硫酸標準溶液至100 mL 容量瓶，100 mL A 級容量瓶最大允許誤差±0.10 mL；50 mL A 級移液管最大允許誤差±0.05 mL，服從均勻分布，包含因子，換算成標準不確定度為：

不確定度合成為：

2.4 滴定體積引起的不確定度urel(V)

2.5 合成標準不確定度及擴展不確定度

（3）擴展不確定度：

采用置信概率為95%（k=2）計算，U=kux。

植物蛋白飲料中蛋白質含量各不確定度分量如表1 所示。

表1 不確定度分量匯總

植物蛋白飲料中蛋白質含量測定的不確定度主要由測量重復性、稱量、滴定管、標準溶液（標定和稀釋）產生，由表1 可知，測定蛋白質含量的第一法測定影響大小為測量重復性>標準溶液>滴定管>稱量；蛋白質含量測定結果為=(1.851±0.013 3) g/100 g。

（1）合成相對標準不確定度：

（2）合成標準不確定度：

采用國家標準方法檢測植物蛋白飲料中蛋白質含量中測量重復性和標準溶液的不確定度影響較大，本文將GB 5009.5-2016 第一法中自動凱氏定氮儀的蒸餾部分與手動滴定相結合，排除因自動凱氏定氮儀自動滴定部分帶來的不確定度分量，同時節約因自組裝蒸餾裝置消耗的時間，提高基層檢測機構試驗效率，可通過合理增加測量次數達到減小測量重復性引起的不確定度分量，采用GB/T 601-2016 對硫酸標準溶液進行標定后再依據GB 5009.5-2016 進行適當稀釋所產生的不確定度分量需由購買已有擴展不確定度的標準溶液來減小，而基層檢驗檢測機構對于標準物質的期間核查和保質期核查方面存在工作疏忽，即通過增加標定次數和采取精密度較高的稀釋容器也可減小標準溶液產生的不確定度分量。

3 結論

本文通過結合GB 5009.6-2016 第一法自動凱氏定氮儀和手動滴定法對植物蛋白飲料中蛋白質含量進行不確定度分析。結果表明，影響植物蛋白飲料中蛋白質含量測定的不確定度主要來源分為測量重復性、稱量、滴定管、標準溶液，通過對不確定度分量進行分析得出植物蛋白飲料中蛋白質含量的擴展不確定度，其中測量重復性和標準溶液的不確定度分量占比較大。因此，對于購買自動凱氏定氮儀附加自動電位滴定儀有限制的基層檢驗檢測機構，可優先選擇本文中的自動凱氏定氮儀和手動滴定法相結合的方法，增加標準溶液標定和蛋白質含量檢測試驗的次數，也可按照CNAS-GL035《檢測和校準實驗室標準物質標準樣品驗收和期間核查指南》對試驗中涉及的標準物質進行驗收和期間核查，提高對檢驗檢測結果的質量控制能力。本文未涉及GB/T 27418-2017《測量不確定度評定和表示》中不確定度的通用分析方法，計劃在今后的工作研究中可將該標準引入檢驗檢測過程質量控制，進一步提高檢驗檢測結果的可信度。