夾竹桃天蛾胚胎細胞的原代培養

李江懷,占智高,王金昌,鄭國華,關麗梅,況文東,陳俊暉,楊 健,靳 亮

(1.江西省科學院微生物研究所,330096,南昌;2.江西省科學院生物資源研究所,330096,南昌)

0 引言

從Grace首次建立昆蟲細胞系以來[1],昆蟲細胞培養得到了快速的發展。昆蟲細胞系成為了生理學、發育生物學和遺傳學等學科的重要研究工具[2]。昆蟲細胞與桿狀病毒表達系統是目前重要的外源蛋白表達工具,對特定病毒敏感的細胞系是探索病毒侵染機制的重要研究材料。昆蟲細胞原代培養是一項經典的細胞生物技術, 從2009年到2018年的十年間,昆蟲細胞系從500多株增長到了1 000多株,這些細胞系分別來自于100多種昆蟲[3],這其中有多種成功被用于商業的昆蟲細胞系,例如Sf-9、Sf-21和BTI-TN-5B1-4(High Five)。但目前仍然有大量的昆蟲并未建立細胞系,且缺少可供研究的細胞株。

夾竹桃天蛾(Oleander Hawkmoth,Daphnisnerii(Linnaeus)),又名粉綠白腰天蛾、鷹紋天蛾、夾竹桃白腰天蛾,屬鱗翅目Lepidoptera,天蛾科Sphingidae,是夾竹桃重要害蟲[4]。該蟲低溫適應能力強,成蟲有較強的遷越能力,在全球范圍內均有分布,其幼蟲能夠對夾竹桃等植物造成大面積的侵害,影響夾竹桃生長,甚至造成植株死亡[5]。江西省科學院微生物研究所2015年分離到包含質型多角體病毒DnCPV-NC[6]在內的多株新病毒株[7-8],同時發現DnCPV-NC具有廣泛的殺蟲譜,具有開發為新型天蛾科害蟲生物殺蟲劑的潛力[9]。但目前缺乏有效感染的細胞系,因此,本文意在建立一株對上述昆蟲病毒敏感的細胞系,為后續開展病毒入侵宿主感染機制提供有效工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗用蟲和細胞系 夾竹桃天蛾蟲卵采自江西省南昌市艾溪湖濕地公園夾竹桃林;Sf-9,Tnh5,C6/36細胞系由中科院武漢病毒研究所惠贈,本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 Grace’s insect cell medium(美國Gibco公司),RPMI 1640(美國Gibco公司),TNM-FH insect cell medium(Procell公司),DMEM(Sigma公司),Schneider’s Drosophila Medium(Gibco公司),胎牛血清(美國Gibco公司),三抗(100 μg/mL 硫酸鏈霉素, 100 U/mL 青霉素,2.5 ug/mL兩性霉素B,上海生工)。

1.1.3 設備 倒置相差顯微鏡(上海儀圓光學YYE-700),恒溫培養箱(上海新苗GZX-150BS-III),生物安全柜(蘇州蘇凈BHC-1300IIA/B2)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代細胞分離 將新鮮采集的夾竹桃天蛾蟲卵浸泡于70%乙醇(含1%次氯酸鈉)進行表面消毒,然后用雙蒸水清洗3遍,用消毒刀片削破卵殼,將胚胎組織釋放到無血清培養基當中。用眼科剪小心地切成小塊,輕輕吹打,用紗布濾去其中大塊的組織。將細胞懸液低速離心后,除去細胞碎片,并加入2 mL含15%FBS及1%三抗的培養基,重懸沉淀,轉移至細胞培養板中。

1.2.2 原代細胞和細胞系的培養 28 ℃靜置培養,根據培養物的狀態,每5—7 d天對原代細胞進行換液,每次更換一半培養基。Tnh5和Sf-9細胞在含10 % FBS的Grace’s培養基中,28 ℃恒溫培養,隔3—4 d天傳代一次。C6/36細胞用添加15 % FBS的RPMI1640培養基,置于5%的CO2培養箱,28 ℃恒溫培養。

1.2.3 細胞形態觀察 采用Grace’s培養基?倎28 ℃培養在倒置相差顯微鏡下,觀察細胞形態。

2 結果與分析

2.1 結果

2.1.1 夾竹桃天蛾原代胚胎細胞的分離 采集到蟲卵后,將其中色澤鮮艷和卵殼飽滿的挑選出來作為同一批次進行原代培養(圖1(a))。對新獲取的原代培養物進行鏡檢,可觀察到不同的細胞形態,多以圓形油滴狀的胚胎干細胞 (圖1(b))為主,細胞大小不一,還能觀察到較小的細胞團和未成形的組織塊(細胞團)。剛轉移到培養基中的胚胎細胞以離散狀態均勻漂浮在培養液中,其中部分干細胞和細胞團會在最初的24 h內逐漸貼壁。整個原代培養初期,培養液中都懸浮著一定量的離散或成團的細胞,這些細胞幾乎不增殖,在一個月內隨著培養液的更換而被清除出培養板。

圖1 (a)從夾竹桃樹葉上采集到的夾竹桃天蛾蟲卵 (b)夾竹桃天蛾胚胎細胞形態(100×)(標尺 = 50 μm)

2.1.2 原代培養一周后細胞形態觀察結果 選擇最適合的培養基是原代培養的關鍵之一,昆蟲細胞系的成功建立高度依賴于培養基和起源組織,尤其是適合細胞類型的培養基[9]。在Grace’s培養基中原代細胞呈長梭型和圓形(圖2(a)),和TNM-FH培養基中均有不少胚胎細胞以細胞團的形式貼壁(圖2(b)),而Schneider培養基中的細胞貼壁少只能觀察到少數細胞團(圖2(c)),DMEM和RPMI1640培養基中則難以貼壁(圖2(d),(e))。

圖2 培養7 d的夾竹桃天蛾胚胎原代細胞(100x) aGrace’s bTNM-FH cSchneider dDEME eRPMI 1640(標尺 = 50 μm)

2.1.3 夾竹桃天蛾原代培中胚胎細胞的分化和形態觀察結果 整個原代培養過程,胚胎細胞在形態分化上展現了高度的多樣性,多種不同形態的細胞依次出現在培養物當中,最早出現的是長梭形細胞和圓形細胞(圖3(a)),通常在細胞貼壁一周后陸續出現在培養物中。紡錘形細胞(圖3(b))只存在較短的時間,成纖維狀細胞(圖3(c))通常在原代培養的第一個月有較快的生長速度,然后就陷入長期的靜止狀態。少量的豆莢形細胞曾短暫存在過(圖3(d)),這些細胞的個體相對其他類型要大出數倍。原代培養初期,可觀察到部分肌肉細胞在有節律地跳動(圖3(e)),頻率約為每分鐘20～30次,但這些跳動的細胞通常在2—3個月的培養后逐漸消失在培養物中。此外,還有少量的扁平的圓形細胞(圖3(f))和相對較小的顆粒型細胞(圖3(g))也被觀察到。而成團的細胞周圍通常會有些離散出來的多邊形細胞(圖3(h)),這類細胞大小中等,可明顯看到細胞核,細胞的偽足呈不規則多邊形。夾竹桃天蛾原代培養細胞與本實驗室培養的多種昆蟲細胞系,包括Tnh5、sf-9和C6/36等細胞系(圖3(i),(j),(k)),在形態與生長速度上存在顯著差異。

(a)類脂肪細胞;(b)肌肉細胞;(c)長梭形細胞;(d)成纖維狀細胞;(e)圓形細胞;(f)豆莢形細胞;(g)顆粒狀細胞;(h)多邊形細胞;(i)Tnh5細胞系;(j)Sf-9細胞系;(k)C6/36細胞系(標尺 = 50 μm)圖3 夾竹桃天蛾原代細胞培養初期的細胞形態以及與其它昆蟲細胞系對比(100×)

2.1.4 長期培養后的細胞狀態觀察結果 夾竹桃天蛾原代細胞在經過長達一年的原代培養過程,處于相對靜止的狀態,與外界交換緩慢,培養每7 d更換一次培養液。經過長期的換液后,原代細胞主要呈現肌肉型(圖4(a))與多邊形(圖4(b)細胞為主的混合形態。

圖4 夾竹桃天蛾原代細胞培養12Mo(100×)(標尺 = 50 μm)

3 討論與結論

污染和培養基結晶是原代培養失敗的重要原因[10]。以往的研究者對昆蟲原代細胞培養的各個技術環節都做了大量的研究和實驗,培養基的選擇、血清濃度、滲透壓、pH等培養條件對細胞貼壁、遷移、增殖的影響[11]。鱗翅目昆蟲胚胎細胞系的建立已經比較成熟,基于Grace’s 昆蟲培養基和TNM-FH培養基,棉鈴蟲[12]、小菜蛾[13]、玉米螟[14]等多種昆蟲的細胞系得以建立。本研究利用這2種培養基,成功對夾竹桃天蛾卵來源的胚胎細胞進行了持續培養,其中Grace’s培養基中的培養物多為離散分布的細胞,平鋪生長,呈現出豐富多樣的細胞形態(圖3(a)～(f)),其中,纖維狀細胞、梭形細胞、肌肉細胞分別約占原代細胞總數的30%、30%和20%,這些細胞在增殖過程中具備一定的遷移能力[15]。TNM-FH中則以聚集的細胞團為主,新生細胞以細胞團為中心呈放射狀生長,約占到細胞總量的60%,對于細胞形態多樣性的維持弱于Grace’s培養基。由于不確定哪種形態的細胞對昆蟲病毒是易感細胞,為保持原代細胞中盡可能多的細胞種類,因而選擇Grace’s培養基作為夾竹桃天蛾胚胎細胞的最佳培養基。實驗中分離到夾竹桃天蛾胚胎細胞中由大量離散的干細胞組成,因此未進行胰酶消化和機械分散。在對蟲卵解剖后,釋放到培養液中的即是胚胎干細胞和發育中的組織塊。

胚胎、卵巢等的組織是昆蟲細胞原代培養最常用到的材料,具有易于獲取和分化潛力強等優點。目前已經建立的1 200株昆蟲細胞系而言,其中一半來源于胚胎組織,這可能源于胚胎干細胞巨大分化潛能[16]。而中腸、神經系統等組織則難度較大,一方面是因為原代培養過程中的污染難以控制,另一方面可能是分化成熟的組織難以適應體外的培養環境。國內目前僅有一株來源于棉鈴蟲中腸的細胞系建立成功[17]。雖然昆蟲生物學的研究人員在細胞原代培養上取得了很多成果,但并不是每一株細胞系都能成為合適的實驗材料。細胞在原代培養過程中的遺傳物質可能會發生不確定性的改變,使得原代細胞特性產生與昆蟲體內的細胞差異,這些差異對于后續的研究也存在著諸多不可預測的影響。本研究中選擇夾竹桃天蛾的蟲卵作為原代培養的材料,因其胚胎由堅硬厚實的卵殼保護,最大程度降低了原代培養過程中消毒操作的難度和污染的幾率,且成功地在Grace’s培養基中維持了原代細胞存活超過12個月。由于目前夾竹桃天蛾的人工養殖難度較高,原代培養獲取的材料主要來自于野生環境,選擇蟲卵作為原代培養的材料也可盡可能降低被昆蟲病毒感染的幾率,從而在源頭上降低了原代細胞被昆蟲病毒感染的風險,在漫長培養過程中持續的觀察也證實了這一點。

哺乳動物細胞可通過對腫瘤細胞進行原代培養的方式以快速得到相應的細胞系[18],或采用慢病毒定向整合基因的方式對原代細胞實現永生化[19]。昆蟲細胞取材等原因及基礎研究不足,難以快速建立需要的細胞系。Li等[20]通過MNNG處理原代細胞實現了化學誘導昆蟲細胞轉化并建立了細胞系,說明化學誘導的方法對昆蟲細胞的轉化是可行的。張欣等[21]通過重組桿狀病毒在培養體系中引入端粒酶逆轉錄酶獲得了可連續傳代的美洲大蠊的細胞系,并顯著縮短了原代培養所需的時間。張寰等[22]通過物理或化學低氧的方式來處理原代細胞可誘導其加快轉化的進程。這些新開發的手段均為極具潛力的快捷建系方法,并有待于廣大研究者的應用和檢驗。唐凱等[23]通過轉錄組測序發現原代細胞在離體培養的過程中,cdk4,cycd,skp2和mad1等多個基因與細胞的轉化相關,在分子生物學層面為昆蟲細胞建系提供了創新的理論基礎。本研究探索了對夾竹桃天蛾的胚胎細胞原代培養的條件,通過機械破碎卵殼分離的原代細胞在多種培養基中順利貼壁,在Grace’s培養基中維持了原代細胞12個月,觀察到原代細胞分化出的多種形態,細胞緩慢增殖。原代細胞的鑒定包括DAF-PCR、染色體核型分析及對桿狀病毒和DnCPV的敏感性實驗需在原代細胞開始傳代后展開。以胚胎組織為材料建立的細胞系,細胞形態具備較高的多樣性,若能通過單細胞克隆分離出混合在夾竹桃天蛾原代細胞中肌肉細胞、脂肪細胞等細胞株,將為昆蟲細胞離子通道和脂類代謝調節機制的研究奠定基礎。

建立新的昆蟲細胞系和發現新的昆蟲病毒一直在昆蟲病理研究當中發揮著相輔相成的作用,二者缺一不可。對于昆蟲病毒方面的研究人員來說,發現一株新的昆蟲病毒,就至少需要有一株相應的敏感細胞系來實現細胞水平的機理研究,這也是下一步開展的工作內容。