蒙藥肉豆蔻五味治療缺血性心臟病的作用機制研究*

賈 鑫,劉紅愛,王玥璇,李斌鑫,朱小玲,董 玉

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院藥學部,呼和浩特 010059;2.內蒙古自治區蒙藥藥效物質與質量控制工程技術研究中心,呼和浩特 010110;3.內蒙古醫科大學藥學院,呼和浩特 010110;4.內蒙古自治區國際蒙醫醫院藥學部,呼和浩特 010065)

缺血性心臟病(IHD)是指由于長期心肌缺血導致心肌局部或彌漫性纖維化,繼而引起心臟功能受損,該病為內蒙古地區常見多發病,近年來其發病率持續上升且危害較大[1]。蒙醫學認為IHD 屬蒙醫“心赫依病”范疇,蒙醫認為心臟為臟腑之首,是全身氣血運行的通道和樞紐,赫依功能變化、氣血運行受阻等是心赫依病發病的主要原因,蒙醫治療心赫依病獨具特色且療效顯著。

肉豆蔻五味蒙語名為“匝迪-5”,是蒙醫臨床治療心赫依病的經典方劑,該方源于《蒙醫藥方匯編》,現收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準(蒙藥分冊)》[2]。該方由肉豆蔻(50 g)、木香(40 g)、土木香(40 g)、廣棗(25 g)、蓽茇(5 g)組成,以味辛,性溫,效膩、重,鎮心赫依之良藥肉豆蔻為主,配以廣棗增強心功能,土木香平氣血不和、止痛,木香行氣止痛、調節脾胃,蓽茇平喘,故對心悸,氣喘,心刺痛,心赫依病等效果顯著。課題組前期研究結果顯示:肉豆蔻五味對大鼠心肌缺血具有較好的保護作用[3]。

研究表明,肉豆蔻揮發油可促進缺血再灌注損傷心肌的恢復,對心臟具有較好的保護作用[4];木香內酯、萜類成分具有解痙鎮痛、保護心血管的作用[5];土木香三萜、黃酮類成分對心肌梗死具有一定的治療效果[6];廣棗是蒙醫治療心血管疾病的常用藥,其發揮治療作用的主要化學成分為黃酮類[7]。蓽茇生物堿和酰胺類化學成分對冠心病、心絞痛有一定的治療作用[8]。課題組前期對肉豆蔻五味的化學成分進行了系統的提取、分離及鑒定[9],但對其治療IHD 的藥效成分及作用機制尚不明確。本研究通過網絡藥理學方法篩選藥效成分、關鍵靶點及通路,從多方面進行了肉豆蔻五味有效成分與生物靶點的交互分析,系統、全面地研究肉豆蔻五味治療IHD 的作用機制,并為肉豆蔻五味治療IHD 的藥效物質基礎研究提供新的思路和方法。

1 方法

1.1 肉豆蔻五味化學成分搜集及其靶點篩選、IHD靶點篩選

通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以“肉豆蔻”“木香”“土木香”“廣棗”“蓽茇”五味藥材為關鍵詞進行搜索和收集,獲取肉豆蔻五味的化學成分。

在生物學中,生物利用度(OB)是一項關鍵的藥動學參數,描述的是口服藥物被人體吸收以及進入血液循環的速率和數量;類藥性(DL)是對藥物設計的一項定性描述,它用于評估化學成分的潛在“藥物化”程度;通常OB值越高,則表明藥物活性分子的類藥性(DL)越好。通過TCMSP平臺,篩選五味藥材中OB≥30%且DL≥0.18的化學成分,同時結合課題組前期研究成果,確定肉豆蔻五味的活性成分。

蒙藥活性成分發揮治療作用是通過與特定的生物分子靶點相結合從而發揮調節其生物活性或轉錄水平的作用。通過系統生物學的方法在PubChem Compound(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中檢索活性成分的SMILE 結構,并在Swiss Target Prediction數據庫檢索其作用靶點,最終建立蒙藥肉豆蔻五味活性化合物靶點數據庫。IHD 靶點篩選:在TTD 數據庫(https://db.idrblab.org/ttd/)、Drugbank數據庫(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET 數據庫(http://www.disgenet.org/web/DisGe NET/menu/home)中輸入關鍵詞Ischemic Heart Disease(IHD),搜索已報道的與IHD 相關的靶點基因,去除重復項,與肉豆蔻五味活性成分靶點進行匹配,搜集肉豆蔻五味活性成分治療IHD 的潛在作用靶點。

1.2 肉豆蔻五味活性成分-IHD潛在靶點網絡構建

運用Cytoscape 3.6.1軟件構建肉豆蔻五味活性成分-IHD 疾病靶點交互網絡圖,并使用其Network analysis插件進行網絡特征分析。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

在STRING 數據庫中,錄入“1.1”項下活性成分與疾病共同靶點,設置蛋白種類“Homo sapiens”及最低相互作用閾值為0.4,獲取蛋白質之間的交流信息后在Cytoscape軟件中構建肉豆蔻五味活性物質關鍵靶點PPI網絡,并對其進行拓撲分析。

1.4 生物過程與通路分析

通過DAVID 數據庫(https://david.ncifcrf.gov/),將所得到的潛在靶點輸入數據庫,進行基因本體(GO)分類富集分析和KEGG 通路分析。最后,將分析得到的靶點通路與肉豆蔻五味活性成分對應,構建活性成分-靶點-通路網絡。

1.5 肉豆蔻五味活性成分-IHD靶點分子對接

選擇得分前五的化學成分作為肉豆蔻五味的主要活性成分,并通過Chem Draw 制圖保存為cdx文件,將這些活性成分放入Chem 3D 中,以便其轉化為三維格式。使用Chem 3D 的MM2力場對所有微小分子進行能級調整,在調整結束后以pdb格式進行保存。從蛋白質晶體結構數據庫(http://www.pdb.org)獲取成分-靶點-疾病網絡中度值前五的目標蛋白數據,并使用Autodock(ADT)4.2軟件計算藥物分子結合該蛋白的可能形態,通過電腦自動評分的方式,選出能量最低的構象作為配體和受體的理想形態,同時采用Discovery Studio(DS)軟件進行可視化的展示。

2 結果

2.1 化學成分-靶點網絡節點圖的構建

運用TCMSP平臺篩選的過程中,識別出28個具有活性的化合物(OB≥30%和DL≥0.18)。前期試驗數據顯示,方劑中木香烴內酯、去氫木香內酯、異土木香內酯、土木香內酯、二氫土木香內酯和珊塔瑪內酯的含量較高[10-12],且具有明顯的藥效,然而由于其OB和DL 數值低于篩選準則,未被系統接收。本次研究中,將這6種成分納入活性化合物的考察范圍(見表1)。

表1 肉豆蔻五味潛在有效成分基本信息Table 1 Basic information of potential effective ingredients of Nutmeg-5

2.2 作用靶點預測及活性成分-作用靶點網絡構建

從Swiss Target Prediction數據庫中獲取了肉豆蔻五味的化學成分靶點,然后去重、篩選、整合,發現有34種活性成分,與其相關的靶點有807個。進一步通過TTD、Drugbank、DisGeNET 數據庫查詢和匯總,發現有476個靶點與IHD 有關聯。最終篩選出104種活性成分-疾病靶點。

借助Cytoscape軟件構建了活性成分-IHD 作用目標網絡(圖1),可知肉豆蔻五味中的活性成分-IHD的作用目標網絡包含138個節點和265條邊。圖1顯示多個活性成分能對多個靶點產生作用,同時,每個靶點與多個活性成分相關聯,說明肉豆蔻五味發揮藥效在于其多成分、多靶點共同作用下的結果。

2.3 蛋白-蛋白互作用網絡構建與分析

PPI網絡分析(圖2)中共有37個節點,167條邊,其中節點表示蛋白,邊表示蛋白之間的關聯程度,度值越大、節點越大,在整個網絡中的作用越大。利用Cytoscape軟件運算每個節點的拓撲性質,并對治療IHD 的肉豆蔻五味關鍵功效目標進行篩選。在蛋白質互作用網絡中挑選出度值超過平均度值的主要節點,并按順序將關鍵功效目標輸入到DisGe NET 數據庫以獲取靶點相應的類型。

圖2 PPI網絡分析圖Fig.2 Protein-protein interaction network analysis diagram

2.4 基因功能與通路分析

利用DAVID 數據庫對PPI網絡篩選出的活性成分相關的靶標開展GO 和KEGG 分析,設立P＜0.05為閾值,并將P值從小到大排列,選取排名前10的生物過程(共篩選出9個)和途徑,采用Graph Pad Prism 8.0作圖。GO 富集分析主要涵蓋以下幾個方面:生物過程(Biological process,BP)、分子功能(Molecular function,MF)及細胞組分(Cellular component,CC)。

BP富集分析的結果表明,肉豆蔻五味活性成分治療IHD 主要與諸多生物流程相關(圖3)。例如,提升蛋白磷酸化的正向調控,促進血管再生以及血管再生的正向調控,以脂多糖為引導的信號通路,提高胞質鈣離子濃度的正向調控,以及正向調節一氧化氮生物合成過程。經過CC富集分析的研究,發現肉豆蔻的五種活性成分主要是通過與膜蛋白(Plasma membrane)、膜陷阱(Caveola)、細胞器膜(Organelle membrane)、細胞外空間(Extracellular space)、膜筏(Membrane raft)等作用治療IHD。根據MF研究,肉豆蔻五味生物活性成分在IHD 治療上的主要作用包括:結合血紅素(Heme binding)、與酶結合(Enzyme binding)、與胰島素受體底物結合(Insulin receptor substrate binding)、與轉錄因子結合(Transcription factor binding)以及與同一蛋白質結合(Identical protein binding)。

圖3 肉豆蔻五味治療缺血性心臟病的GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis for Nutmeg-5 ingredients in treatment of IHD

KEGG 通路分析結果見圖4,關鍵通路包括:腫瘤壞死因子通路(11個關鍵靶點)、腫瘤蛋白多糖(13個關鍵靶點)、癌癥通路(15個關鍵靶點)、血管內皮生長因子信號通路(8個關鍵靶點)、低氧誘導因子1信號通路(9個關鍵靶點)。闡明肉豆蔻五味治療缺血性心臟病的主要活性成分影響的關鍵作用位置分布在各類代謝途徑中,其治療缺血性心臟病的機制可能是多成分多靶點協同發揮作用。

圖4 肉豆蔻五味治療缺血性心臟病的KEGG 通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis for Nutmeg-5 ingredients in treatment of IHD

2.5 肉豆蔻五味治療IHD活性成分-靶點-信號通路網絡模型

將選出的肉豆蔻五味治療缺血性心臟病的關鍵靶點、活性成分和信號通路匯入Cytoscape 3.7.2軟件中,基于此構建成分-靶點-信號通路網絡模型。該模型圖由78個節點和243條邊形成,圖中節點的大小表示其在缺血性心臟病治療中的影響力度,節點越大作用越大,見圖5。

圖5 肉豆蔻五味治療缺血性心臟病活性成分-靶點-信號通路網絡Fig.5 Active component-target-pathway network of Nutmeg-5

經過分析,推測磷脂酰肌醇-4,5二磷酸肌醇-3激酶(PIK3CA)、非受體酪氨酸激酶2(JAK2)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、血管內皮生長因子受體(KDR)、PIK3CB、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)是網絡圖中的核心節點,很可能是肉豆蔻五味治療缺血性心臟病的主要靶點。每一個活性成分可能影響多個靶點和通路,每個靶點也可能涉及多個活性成分和通路,同時,不同的路徑可能因共享靶點而相互關聯,結果表明各通路可能通過協同作用發揮療效。

2.6 肉豆蔻五味活性成分-IHD靶點分子對接分析

當配體和受體結合的自由能降低時,結合更加牢固,因此可能產生相互作用的概率愈發提高。由圖5看出,肉豆蔻五味中木香烴內酯(MX-3)、去氫木香內酯(MX-4)、異土木香內酯(TMX-1)、土木香內酯(TMX-2)、二氫土木香內酯(TMX-3)5個活性成分與通路及靶點關聯度較高,所以確定這5個成分為肉豆蔻五味治療IHD 的主要活性成分。在成分-靶點-疾病網絡中,5個度值最高的目標蛋白質是PTGS2(PDBID:3TZI)、PIK3CA(PDBID:4A55)、JAK2(PDBID:6E2Q)、MAPK14(PDBID:7BQD)和KDR(PDBID:2P2I)。將5種活性成分和這5個靶點分別進行對接,對接的具體結果見表2。篩選出的5個活性成分與5個關鍵靶點對接時的結合自由能均為負值,說明結合能量低,成分與靶點容易結合,故兩者易產生關聯;如果結合自由能為正值或數值越大則結合能量高,成分與靶點不容易結合,二者也就不會產生關聯。因此,肉豆蔻五味中此5種活性成分可通過不同的代謝通路作用于多個靶點上,發揮治療IHD 的作用。

表2 蒙藥肉豆蔻五味主要活性成分與關鍵靶點蛋白分子對接自由能Table 2 Docking conformations of the main bioactive chemical constituents in Nutmeg-5 and target protein

3 討論

肉豆蔻五味為蒙醫臨床治療心赫依病的常用方劑,但實際應用中仍存在藥效物質不清晰、功能主治不明確的現象?！靶暮找馈奔膊≡诿舍t臨床上包括了心悸、心神恍惚、頭暈眼花、神經過度疲憊、失眠和體力疲憊等多種病癥,其涵蓋的范圍廣泛且并不明確。本研究以蒙醫臨床治療心肌缺血常使用的方劑肉豆蔻五味作為研究對象,在早期研究的基礎上,運用網絡藥理學的方法從蒙藥配方整體角度收集和篩選與藥物化學成分相互作用的生物靶標,以及與疾病相關的關鍵靶點,從而構建了“藥物-疾病-靶點-通路”的網絡藥理學研究模型。研究結果系統地展現了肉豆蔻五味活性成分、關鍵靶點、通路與IHD 之間的相互對應關系,通過分析疾病、化學成分、靶點、通路之間的關聯性可探索肉豆蔻五味相關信號通路及其作用機制。

經過網絡分析,篩選到的活性成分可能會影響與缺血性心臟病相關的主要靶點,推斷這些元素可能是治療缺血性心臟病的關鍵,這些活性成分將為后期藥效作用的驗證提供必要的物質支持。篩選到的靶點包括PIK3CA 和PIK3CB,這是磷脂酰肌醇3激酶(PI3Ks)的催化產物,其通過磷酸化過程可以觸發一系列的細胞內信號傳遞[13]。研究報告指出,Nedd4L 可以增加PIK3CA 的泛素化并推動其蛋白質降解,以此通過抑制PI3K/Akt通道的信號傳輸來發揮對心肌肥厚的治療作用[14]。PTGS2可以將花生四烯酸轉化為前列腺素H2,這對動脈硬化、血栓、血管重塑、高血壓等疾病有重要影響[15]。MAPK14在炎癥、腫瘤、缺血/再灌注傷害、心肌重組等領域也起到關鍵作用[16]。Khan等人的研究顯示再灌注心肌會上調絲氨酸-蘇氨酸激酶,下調p38MAPK 活性[17]。因此,MAPK 在缺血性心臟病和體外循環心肌保護方面具有重要的臨床意義。通過PLCG1的激活,產生了二?；视秃图〈?,4,5-三磷酸這兩種細胞信號分子,并對NOS2和NOS3進行調節,使得內皮細胞產生信號分子一氧化氮(NO)。一氧化氮(NO)作為主要的活性成分,具有介導心肌、血管平滑肌、血管內皮細胞等的程序性死亡的功能,從而在缺血性心臟病中起了核心驅動的作用[18-19]。此外,這些靶點與眾多IHD 調控通路和多個活性成分相關聯,進一步推斷這些靶點與IHD 有關系,為將來在細胞和分子層面上驗證藥物效果提供了基礎。

利用網絡藥理學方法,研究明確了蒙藥肉豆蔻五味中的34個活性成分和35個重要靶點通過TNF等多條通路對治療缺血性心臟病發揮作用。揭示了多靶點有可能同時與多條調控路徑和多種活性成分關聯,篩選到的活性成分可能同時作用于多個靶點,并且在關鍵調控通路中存在多個與IHD 關聯的靶點。此研究充分展示了蒙藥的多成分、多靶點、多通路同步發揮治療作用的優點,為深入研究肉豆蔻五味治療缺血性心臟病的藥效物質基礎及作用機制研究提供了重要的參考和依據。