貴州普定土壤酶活性和氮循環功能基因數據集

李丹丹, 張心昱, 楊洋, 劉霜, 張雷明, 郭志明, 劉爍,彭韜

1.中國科學院地理科學與資源研究所，生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室，北京 100101

2.中國石油集團安全環保技術研究院有限公司，石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206

3.河北建筑工程學院，市政與環境工程系，河北省水質工程與水資源綜合利用重點實驗室，河北張家口 075000

4.中國科學院大學，資源與環境學院，北京 100190

5.普定喀斯特生態系統觀測研究站，貴州普定 562100

引 言

由于人為活動的影響，我國西南喀斯特地區石漠化及土地退化問題極其嚴重。為了應對嚴重的土地退化問題，我國自上世紀末開始實施生態恢復工程措施。在退耕還林的政策下，西南喀斯特地區將坡度>25°的農田逐步進行退耕，形成了不同的植被類型，有效改善了喀斯特地區的生態環境[1-2]。

微生物在土壤養分循環中發揮著重要作用，可以作為衡量土壤健康或肥力的綜合指標，成為評價生態系統土壤功能恢復的重要組成部分[3-5]。土壤酶是由含特定功能基因的微生物所編碼的，其活性不僅可以反映土壤理化性質、生物量和生物多樣性的變化，也可以反映土壤養分循環情況[6-10]。不同植被類型下，植被的凋落物數量和質量以及根系分泌物數量和化學成分存在著顯著的差異，這將影響土壤中微生物群落動態，從而影響土壤養分循環[11-16]。因此，加強喀斯特地區不同植被類型下參與土壤養分循環的相關微生物酶活性及群落動態監測，不僅能加強我們對退化生態系統土壤功能恢復的理解，也有助于為喀斯特地區土壤養分管理促進生態恢復提供理論依據。

貴州普定喀斯特生態系統國家野外科學觀測研究站（以下簡稱普定站）位于南方喀斯特典型區域，是我國南方喀斯特石漠化和生態破壞最為嚴重的代表性地區。已有大量研究指出植被恢復有利于該區域土壤養分的提升和微生物功能的恢復。然而，關于喀斯特地區土壤養分含量及其土壤微生物豐度和活性研究中還未有公開的數據集。本研究依托普定站，以陳旗流域的農田、棄耕地、次生林和灌叢以及天龍山的近頂級植被的常綠落葉闊葉混交林土壤為監測對象，匯總了5 種植被類型下剖面土壤、根際土壤關于參與碳、氮、磷轉化的微生物酶活性、氮循環微生物功能基因、活體和殘體微生物量和土壤理化性質的數據，形成了1 個含有8 個數據表單Excel 文件數據集，為喀斯特地區退耕還林對土壤養分循環影響的微生物調控機制研究提供數據支撐。

1 數據采集和處理方法

1.1 采集樣地描述

數據采集樣地位于普定站的陳旗流域典型集水區（26°15'36″–26°15'56″N，105°43'30″–105°44'42″E）和天龍山（26°14′48″ N，105°45′51″ E）。陳旗流域海拔為1140–1523 m，三面環山，屬于典型的喀斯特峰林洼地地貌（圖1）。天龍山海拔為1421–1503 m，是喀斯特峰叢中的一座孤山。兩個小流域相距1.2 km，屬于亞熱帶季風氣候，年平均降雨量為1390 mm，年平均氣溫為15.1 ℃。土壤多為石灰土和黃壤。土壤母質以可溶性的碳酸鹽類巖占優勢，主要是中三疊紀關嶺組形成的石灰巖和泥灰巖，巖溶作用強烈[3-4]。

圖1 普定站陳旗流域和天龍山地貌（A）、不同植被類型的植被群落照片（B）和土壤剖面照片（C）Figure 1 Physiognomy of Chenqi Catchment and Tianlong Mountain at Puding Station (A), photographs of various vegetation types (B) and the photo of a soil profile (C)

二十世紀六十年代，陳旗流域的植被遭到嚴重破壞，大面積土地被開墾為農田。直到二十世紀末我國政府實施退耕還林政策，陳旗流域大面積的坡耕地陸續從坡頂到坡下進行退耕，逐漸恢復成灌叢，最終演替為次生林，形成了不同的植被類型[3-4]。灌叢和林地主要分布在山腰至山頂區域，耕地主要分布在溝谷及緩坡地帶。天龍山山頂由于長期以來有佛教寺廟的存在，森林植被保存較好，在黔中高原面已屬于近頂級植被的常綠落葉闊葉混交林[3]。因此，農田、棄耕地、灌叢和次生林4 種植被類型位于陳旗流域，近頂級植被的常綠落葉闊葉混交林位于天龍山。

1.2 樣方設置及樣品采集

（1）不同植被類型下不同發生層土壤樣品采集：2016 年6 月，在陳旗流域選取巖性、海拔和地形等條件相似且相鄰的3 個獨立的、彼此面對面的喀斯特峰叢山丘用于設置農田、棄耕地、次生林樣地。在每個山丘，依照海拔從下到上分別在農田、棄耕地、次生林設置3 個重復樣方，每個樣方大小為5 m×5 m，樣方之間距離10 m 以上。在天龍上從山腳到山頂，設置了4 個5 m×5 m 重復樣方，樣方之間距離超過10 m。在每個樣方內挖掘1 個從地表至基巖的土壤剖面（圖1），參照《中國生態系統研究網絡觀測與分析標準方法-土壤理化分析與剖面描述》[17]，根據剖面特征將土壤發生層次分淋溶層、淀積層和母質層，分別采集各個發生層次的土壤樣品。分析不同發生層土壤樣品的氮循環微生物功能基因豐度及氮轉化速率、微生物酶活性。

（2）不同植被類型下不同土層深度樣品采集：2016 年7 月，在陳旗流域選取農田、棄耕地、灌叢、次生林，在天龍山選取近頂級植被的常綠落葉闊葉混交林，共5 種不同的植被類型。每個植被類型下依照海拔從下往上設置4 個重復樣方，每個樣方大小為5 m×5 m，樣方之間距離10 m 以上，采集0～10 cm、10～30 cm、30～50 cm、50 cm 以下深度的土壤剖面樣品。分析不同土層深度土壤樣品的微生物酶活性、活體微生物量和微生物殘體碳含量。

（3）喀斯特陳旗流域精細調查樣品采集：2016 年7 月，在陳旗流域選擇400 m×400 m 大小的集水區，沿著東北坡和西南坡分別布置4 條樣帶，溝谷布置1 條樣帶，共布置9 條樣帶開展精細調查。每條樣帶內設置4 個距離大致相等的樣方，共計36 個樣方。其中11 個樣方所在研究區的植被類型為次生林，15 個樣方為棄耕地，10 個樣方為農田。每個樣方范圍為5 m×5 m，在樣方范圍內隨機取0～10 cm、10～30 cm、30～50 cm、50 cm 以下深度的土壤樣品，分析土壤樣品的水解酶活性。

（4）天龍山根際土壤樣品采集：2018 年5 月，在天龍山近頂級植被的常綠落葉闊葉混交林中從山頂到山腳隨機設置了三條樣帶，每條樣帶的長和寬分別為50 m×10 m，每條樣帶之間的距離大于100 m。沿著這三條樣帶，采集了成熟且健康生長的優勢木本植物根際土壤及一級根（距離根軸最遠端的吸收根）。分析根際土壤樣品的水解酶活性，并鑒定植物菌根類型。

土壤采集方法參考《土壤樣品的采集、處理和貯存)》（NY/T 1121.1-2006）標準[18]執行。具體來說，去除地表凋落物層，用直徑為2 cm 土鉆在樣方范圍內隨機取8–10 個土芯，混勻后作為1 個土壤樣品。植物的根際土壤采用“追根法”確定每棵目標樹種的根系，利用“抖土法”采集根際土壤。在采樣時，對樣地植被類型、優勢物種及生態系統干擾歷史進行調查，記錄采樣地點位置及地形信息（表1），并拍攝樣地景觀照片（圖1）。將采集的鮮土過2 mm 的土篩，一份直接保存在4 ℃冰箱用于微生物酶活性及土壤理化性質分析，另一份保存在-80 ℃冰箱冷凍用于功能基因分析。此外，利用“追根法”和“抖土法”確定每棵木本植物的根系，采集每棵植物100～200 個一級根，置于FAA固定液中，在4 °C 冰箱內保存，用于菌根類型鑒定[11]。

表1 不同植被類型植物種類的特征和樣地信息Table 1 Characteristics of plant species of different vegetation types and information of the sampled farmlands,abandoned farmlands, shrublands, secondary forests and primary forests

1.3 觀測方法

（1）土壤水解酶活性：參與土壤碳氮磷循環的6 種水解酶活性參考Saiya-cork 等[19]方法，采用微孔板熒光法利用多功能酶標儀（SynergyH4, BioTek）。稱取1 g 鮮土置于250 mL 燒杯內，向燒杯中加入125 mL 與土壤樣品pH 值相近的醋酸鈉緩沖液（濃度為50 mmol L-1），在渦旋振蕩器上震蕩1 min，制備成土壤懸浮液；樣品孔中分別加入200 μL 的土壤懸浮液和50 μL 的底物（濃度為200 μmol L-1）；土壤控制孔中分別加入200 μL 的土壤懸浮液和50 μL 醋酸鈉緩沖溶液；底物控制孔中分別加入50 μL 底物和200 μL 醋酸緩沖液；標準物質孔中分別加入50 μL 的標準物質（濃度為10 μmol L-1）和200 μL 的醋酸鈉緩沖液；在黑暗避光條件下，置于20 ℃恒溫培養箱中培養4 h；隨后，每個孔中加入10 μL 濃度為1 mol·L-1的NaOH 溶液終止反應；熒光值在365 nm 波長處激發，450 nm 波長處進行測定。每個樣品孔、土壤控制孔、底物控制孔、標準物質孔均設置了8 個平行重復。亮氨酸氨基肽酶（LAP）的標準物質為7-氨基-4-甲基香豆素，其他5 種水解酶的標準物質為4-甲基傘型酮。土壤水解酶活性測定的反應底物及功能詳見表2[20]。

表2 水解酶和氧化酶的功能及反應底物Table 2 Functions and substrates of the soil hydrolase and oxidase

（2）土壤氧化還原酶活性：土壤氧化還原酶活性采用微孔板吸收光法，通過多功能酶標儀（SynergyH4, BioTek）測定[4,19]。土壤懸浮液制備方法同上述水解酶測定方法中的土壤懸浮液制備方法一致，稱取1g 鮮土置于250 mL 燒杯內，加入125 mL 與土壤樣品pH 值相近的醋酸鈉緩沖液（濃度為50 mmol L-1），在渦旋振蕩器上震蕩1 min，制備成土壤懸浮液；吸取土壤懸浮液600 μL 于96深孔板中，加入150 μL 的底物（濃度為200 μmol L-1），測定過氧化物酶（PER）的深孔板中再加入30 μL 10% H2O2，所有深孔板在20℃的黑暗條件下培養5 h，停止培養后進行離心2 min，吸取250 μL 上清液至透明的96 微孔板中，在460 nm 下進行吸收光檢測。每個樣品均設置了8 個平行重復。土壤氧化還原酶活性測定的反應底物及功能詳見表2[20]。

（3）氮循環微生物功能基因豐度：通過已知濃度的質粒DNA 進行連續10 倍稀釋用以制作標準曲線，利用實時定量PCR 儀（Eco?, Illumina, USA）分析氮循環功能基因（nifH、chiA、AOAamoA、AOBamoA、napA、narG、nirK、nirS、norB、nosZ）的拷貝數。同時將無DNA 的模板設置為陰性對照，每個樣品設置3 次重復。溶解曲線為單一峰用以鑒定產物的特異性，且PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳進一步檢測無非特異性擴增和引物二聚體的生成。標準曲線R2≥0.999、擴增效率為90%～110%之間的數據被接受。各基因所負責的功能及擴增通用引物信息見表3。

表3 各功能基因的主要功能和PCR 擴增引物信息Table 3 Functions and primer pairs of the nitrogen-cycling functional genes used in PCR

（4）氮轉化速率：氮轉化速率包括固氮速率和反硝化速率。固氮速率參照Li 等[30]方法，通過室內培養實驗，利用乙炔還原法測定28 °C 條件下乙炔（C2H2）還原生成乙烯（C2H4）的量。潛在反硝化速率和基礎反硝化速率參照Shrewsbury 等[31]的方法，利用乙炔抑制法通過室內培養實驗進行測定。潛在反硝化速率測定厭氧培養條件下微生物在可利用性碳和氮源供應充分情況下產生N2O 的最大量；基礎反硝化速率測定厭氧培養條件下微生物在田間養分狀態下產生N2O 的量。C2H4和N2O 的濃度均采用氣相色譜（Agilent GC 7890A, Agilent, USA）測定。微生物固氮速率和反硝化速率分別用單位時間內每克干土產生的C2H4和N2O 的量表示。在培養過程中，每個樣品設置3 次重復，同時將僅添加土樣和乙炔設置為對照。

（5）活體微生物量：磷脂脂肪酸（PLFA）是微生物活體細胞膜的成分，可作為活體微生物生物量的指標。采用脂肪酸19:0 作為內標，參考Frostegard 等[32]和Bossio 等[33]方法，利用氣相色譜通過MIDI 軟件系統(Version 4.5)分析微生物細胞膜PLFA 各組分含量。稱取相當于8 g 干重的鮮土，依次加入3.0 mL 磷酸緩沖液、6.0 mL 氯仿、12 ml 甲醇，避光震蕩2 h 后，在3000 r min-1下離心10 min，將上清液轉移到裝有12 mL 三氯甲烷，12 mL 磷酸緩沖液的分液漏斗中，搖動分液漏斗2 min，避光條件下，靜置過夜。次日，用50 mL 試管收集分液漏斗下層溶液，收集的液體在30 ℃水浴中用氮氣吹干以獲得濃縮磷脂樣品，用1000 uL 三氯甲烷將試管內濃縮的樣品分兩次轉到萃取硅膠柱上。采用5 mL 三氯甲烷、10 mL 丙酮、5 mL 甲醇依次對硅膠柱上磷脂樣品進行洗脫，收集甲醇相，并用氮氣吹干。在吹干后的樣品中加入1 mL 的1:1 甲醇甲苯及1 mL 0.2 mol L-1氫氧化鉀，在37 ℃水浴加熱15 min，最后用正己烷萃取，再用氮氣吹干儲存在4℃冰箱待上機測定。用于指示革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、細菌、真菌、放線菌種群的磷脂脂肪酸標志物見表4[34-36]。

表4 用于表征微生物類型的磷脂脂肪酸（PLFA）標志物Table 4 Common phospholipids biomarkers representing different types of microbes

（6）微生物殘體碳：根據Indorf 等[37]方法，采用鄰苯二甲醛柱前在線衍生-高效液相色譜法測定土壤中氨基胞壁酸（MurN）、氨基甘露糖（GalN）、氨基葡萄糖（GluN）三種氨基糖的含量。利用氨基胞壁酸和氨基葡萄糖分別計算細菌和真菌殘體碳，利用三種氨基糖的總和計算土壤中微生物殘體碳[12,38]。標準樣品平行樣、土壤樣品平行樣和重復樣的相對標準偏差均<5%，且標準曲線性R2>0.999 時獲得的數據被接受。

（7）菌根類型鑒定：在90 °C 條件下，將一級根用10%的KOH（w/v）溶液透明化30 min；在室溫條件下，用2%的HCl 溶液（v/v）酸化30 min；再用0.1%的酸性品紅溶液分別在90 °C 和60 °C條件下進行染色30 min 和60 min；染色結束后，用等體積的乳酸-甘油-水混合溶液脫色。利用顯微鏡（DM500, Frankfurt, Germany）觀察根系解剖結構。根系皮質細胞中若出現線圈或叢狀的結構被認定為內生菌根，根系根尖若有黃棕色或金棕色的菌絲鞘且腫脹認定為外生菌根。

（8）土壤的基本理化性質：土壤容重、含水量、pH、有機碳、全氮、全磷、溶解性有機碳、銨態氮、硝態氮、速效磷的測試方法參照《土壤農化分析》進行測定[39]。

2 數據樣本描述

本數據集的數據儲存于1 個Excel 文件中的8 個數據表單中，包含了采樣點信息，2016 年不同土壤發生層土壤酶活性、氮循環功能基因豐度、氮轉化速率、土壤理化性質數據，2016 年不同土層深度土壤酶活性、活體微生物量、微生物殘體碳數據，2016 年陳旗流域精細調查土壤水解酶活性、理化性質數據和2018 年天龍山近頂級植被的常綠落葉闊葉混交林根際土壤樣品采樣點、理化性質和酶活性數據。采樣點信息涵蓋了樣品編號、采樣深度、采樣時間、采樣點坐標、優勢種、海拔、坡度和坡向等；土壤酶包括水解酶（βG、βX、CBH、NAG、LAP 和ALP）和氧化酶（PPO 和PER）；氮循環功能基因包括nifH、chiA、AOAamoA、AOBamoA、napA、narG、nirK、nirS、norB和nosZ，氮轉化速率包括固氮速率、基礎反硝化速率和潛在反硝化速率；活體微生物量包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、細菌、真菌和放線菌生物量；土壤理化性質包括土壤容重、含水量、pH、有機碳、全氮、全磷、溶解性有機碳、銨態氮、硝態氮、速效磷。具體的字段名稱、類型及示例見表5、表6。

表5 本數據集Sheet 1 內容及字段含義Table 5 Data content and description in Sheet 1

表6 本數據集Sheet 2-Sheet 8 內容及字段含義Table 6 Data content and description from Sheet 2 to Sheet 8

3 數據質量控制和評估

為確保調查數據具有代表性、準確性，本數據集在建立過程中主要從調查采樣過程、樣品分析與數據精度三個方面進行質量控制和評估。

3.1 調查采樣過程質量控制

沿海拔梯度在陳旗和天龍山兩個小流域選擇研究區域內具有代表性的植被類型，涵蓋了坡上、中、下以及不同坡向。由于陳旗流域和天龍山在地形上存在差異，兩流域采取差異化樣地設置方式。同時，在陳旗流域選擇400 m×400 m 大小的集水區開展精細調查，建立地形和植被類型相結合的垂直剖面土壤取樣體系。在樣地設置方面綜合考慮了地形和地勢等環境因素，使得數據采集更加全面和具有代表性。此外，在各樣方內隨機設置重復樣地并隨機取樣，在各個樣地內將8–10 個土芯混勻作為1 個樣品，降低空間異質性對數據結果產生的影響。在土壤樣品采集時，仔細去除土壤表面凋落物層，對所不同土層土壤樣品進行準確標記。采樣結束后，仔細核實樣品數量與樣品記錄信息。

3.2 樣品室內分析質量控制

土壤樣品帶回實驗室后，盡快測定相關指標，針對不同的檢測指標采取特定的樣品保存方式。在樣品檢測前，再次核實樣品信息，包括樣地名稱、樣方編號、樣品數量等。在測定過程嚴格按照方法規范操作，在每一批次樣品檢測過程中，均設置獨立的空白對照，并插入標樣、盲樣，將標準曲線R2>0.999 進行數據校正，以保證原始數據采集結果的準確性。

3.3 數據精度質量控制

完成檢測后，認真記錄原始數據，所有數據的原始記錄不得涂抹、刪改，以備數據后續核查。當數據出現異常值時，應嚴格核實。核對數據計算過程，如發現數據計算過程錯誤導致結果偏差較大時，立即溯源原始數據。此外，通過對數據離散程度分析，以組內不超過測定指標均值3 倍標準差為正常樣，剔除數據的異常樣本。

4 數據價值

本研究公開發表了貴州普定喀斯特區域的陳旗流域和天龍山5 種不同植被類型下參與土壤碳、氮、磷循環相關微生物酶活性及功能基因的數據。微生物酶活性數據揭示了喀斯特生態系統植被在恢復前期存在氮、磷養分限制，而在恢復后期存在磷養分限制的問題，為植被恢復過程中制定合理的養分管理策略提供參考價值[8]。氮循環微生物功能基因豐度及微生物氮轉化速率數據進一步揭示植被恢復改善了土壤物理結構，實現了土壤對氮循環功能微生物在水、碳、氮和磷養分方面的可持續供給，進而提高氮循環微生物活性，為喀斯特生態系統可持續氮素管理提供科學依據[9-10,14]。利用基礎反硝化速率和潛在反硝化速率的比值揭示了喀斯特地區植被恢復過程中土壤氮循環狀態的變化，為“退耕還林”背景下土壤N2O 排放控制機制研究提供數據參考[13]。通過微生物量數據量化了活體微生物與殘體微生物對土壤有機碳庫的貢獻，對提高喀斯特地區植被恢復過程中維持土壤碳庫的穩定性機制的認識具有重要意義[12]。不同樹種根際土壤酶活性數據揭示了外生菌根與叢枝菌根養分獲取能力和途徑上的差異，為喀斯特森林中物種的共存和樹種多樣性的維持提供數據支撐[15]。

總之，本數據集為探究喀斯特地區植被恢復對土壤碳氮磷循環過程的微生物調控機制研究提供新的認識。此外，本數據集的公開也是進一步系統性地研究脆弱生態系統在“退耕還林”背景下土壤養分循環及微生物功能活性研究的重要數據來源，為未來區域生態環境治理提供重要的數據支撐。

致 謝

感謝普定站在數據采集過程中關于樣方設置及樣品采集方面給予的支持。

數據作者分工職責

李丹丹（1988—），女，黑龍江哈爾濱人，博士后，研究方向為土壤氮循環過程及其微生物機制。主要承擔工作：數據整理與論文撰寫。

張心昱（1973—），女，遼寧桓仁人，研究員，研究方向為陸地生態系統土壤碳、氮、磷循環的微生物機制。主要承擔工作：總體方案設計與組織實施，樣品采集與分析的質量控制、數據質量控制與評估，技術指導與論文修改。

楊洋（1991—），女，黑龍江哈爾濱人，講師，研究方向為土壤養分循環及微生物機制。主要承擔工作：根際土壤樣品的采集與分析工作。

劉霜（1995—），女，河南永城人，博士生，研究方向為土壤磷循環及微生物機制。主要承擔工作：樣品采集與土壤酶活性分析工作。

張雷明（1974—），男，河南開封人，副研究員，研究方向為陸地生態系統碳水交換、土壤溫室氣體通量、植被物候。主要承擔工作：技術指導與論文修改工作。

郭志明（1992—），男，湖南醴陵人。博士生，研究方向為土壤碳生物地球化學過程。主要承擔工作：剖面樣品采集，土壤微生物碳標志物及土壤養分分析工作。

劉爍（1992—），男，河北南宮人。碩士，研究方向為土壤酶活性空間分布特征。主要承擔工作：樣品采集，土壤酶活性分析。

彭韜（1984—），男，貴州省貴陽人，研究方向為喀斯特地區生態環境研究、土壤侵蝕與水土保持、水文水資源研究。主要承擔工作：采樣指導與論文修改工作。