基于改進G-四鏈體DNA酶的電化學適配體傳感器構建及卡那霉素高靈敏檢測

伍永梅,朱肖倩,方嬌,白艷紅

1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院,河南 鄭州 450001;2.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室,河南 鄭州 450001;3.食品生產與安全河南省協同創新中心,河南 鄭州 450001

0 引言

卡那霉素(Kanamycin,KANA)是一種氨基糖苷類抗生素,可以抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌蛋白質的合成,常作為獸藥廣泛用于畜牧業中奶牛的飼養[1]。但過量使用會導致牛奶中的抗生素殘留,殘留的KANA通過食物鏈進入人體,經過長時間的體內積累對人體造成損傷。傳統的抗生素檢測技術主要包括高效液相色譜(HPLC)法[2]、液相色譜-質譜(LC-MS)法[3]、毛細管電泳(CE)法[4]、酶聯免疫分析(ELISA)法[5]、氣相色譜-質譜(GC-MS)法[6]。但這些技術均存在預處理步驟繁瑣、操作成本高昂等問題[7]。因此,開發一種快速、可靠、便捷的抗生素檢測方法具有重要意義。

G-四鏈體(G4)是由一段富含鳥嘌呤(G)堿基的寡核苷酸序列組成[13],可以在單價陽離子(如Na+、K+)的作用下與卟啉鐵(Hemin)結合,形成具有辣根過氧化物酶(HRP)活性的模擬酶,即Hemin/G4 DNAzyme[14]。Hemin/G4 DNAzyme具有成本低、穩定性好、催化活能高等優點,可催化底物H2O2加速電子轉移,顯著增強電化學信號[15],但比天然HRP活性低。鑒于此,本文擬以KANA為目標物,將多肽(Peptide)與G4 DNAzyme共價組裝得到高活性的G4 DNAzyme-peptide復合物,以Hemin為電子媒介體構建電化學適配體傳感器,考查該復合物對電化學適配體傳感器響應性能的影響,并將該傳感器應用于牛奶中KANA的檢測,以期為食品中抗生素的高靈敏檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

牛奶,鄭州市高新區大張超市;卟啉鐵(Hemin)、6-巰基己醇(6-Mercaptohexyl Alcohol,MCH)、三(2-羧乙基)膦酸鹽(Tris-(2-carboxyethyl)-phosphine Hydrochloride,TCEP)、氯金酸(HAuCl4),均為分析純,Sigma-Aldrich公司;組氨酸多肽(Peptide),上?？齐纳锛夹g有限公司(中國);卡那霉素(KANA)、妥布霉素(Tobramycin,TOB)、鏈霉素(Streptomycin,STR)、四環素(Tetracycline,TET),均為標準品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;5×TBE緩沖液,海生工生物工程有限公司;抗生素適配體序列[16](Aptamer,Apt:5′-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3′,解離常數為78.8 nmol/L)、模板DNA序列(Template,TP:5′-CCCGCCCTACCCACAGTGAT-CGGCTTAGAGGACTACCCCCA-3′)、輔助探針序列(Assistant Probe,AP:5′-GTCCTCTAAGCCGATCACTGTGGGTAGGGCGGG-3′)、捕獲探針序列(Capture Probe,CP:5′-SH-AGTGATCGGAAAAAA-SH-3′)、疊氮(N3)標記的含G堿基的DNA序列(N3-G4 DNA:5′-N3-CCGATCACTGTGGGTAGGGCGGGTTGG-3′)、二苯并環辛炔(Dibenzocyclooctyne,DBCO)標記的多肽序列(DBCO-peptide:5′-HHHHHHAAA-DBCO-3′),上海生工生物工程有限公司。其他實驗常用試劑均為分析純。

1×TE緩沖液(pH=8.0):由10 mmol/L Tris-HCl與1.0 mmol/L EDTA混合配制,用于溶解和保存寡核苷酸;PBS緩沖液(pH=7.4):由0.1 mol/L KCl、0.1 mol/L Na2HPO4與0.1 mol/L NaH2PO4混合配制。

1.2 主要儀器與設備

CHI660e型電化學工作站,上海辰華儀器有限公司;三電極體系(由玻碳電極、鉑絲電極和Ag/AgCl電極組成),上海辰華儀器有限公司;ME204/02型電子分析天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ5200DE型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;PHS-3C型酸度計,上海儀電科學儀器股份有限公司;Sub Cell GT型核酸電泳儀,伯樂生命醫學產品有限公司;Image Lab 4.0型凝膠成像系統,美國Bio Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1Apt+TP+N3-G4復合探針的制備分別取5 μL濃度均為200 μmol/L的 Apt、TP和N3-G4混合于485 μL的 1×TE緩沖液中進行退火雜交,即得Apt+TP+N3-G4復合探針。

1.3.2 電化學適配體傳感器的構建與工作原理圖1為基于改進G4 DNAzyme的電化學適配體傳感器的構建及其工作原理。由圖1可知,首先設計1條包含立足點(toehold)區域的單鏈DNA模板(TP),使其能夠部分雜交抗生素Apt和N3-G4,以形成穩定的Apt+TP+N3-G4復合探針;然后進行玻碳電極(GCE)預處理,用氧化鋁拋光粉(0.5 μm)對GCE進行打磨,用水和乙醇超聲清洗以除去殘留鋁粉,于室溫下晾干,備用;再將GCE置于HAuCl4中進行電化學沉積實驗(沉積電位為-0.2 V,時間為30 s)得到AuNPs/GCE電極;于4 ℃條件下用CP(2 μmol/L,10 μL)孵育該電極表面16 h,得到CP/AuNPs/GCE電極;最后用MCH(1 mmol/L,10 μL)封閉電極表面剩余的活性位點,即得MCH/CP/AuNPs/GCE電極。

圖1 基于改進G4 DNAzyme電化學適配體傳感器的構建及其工作原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the fabrication of the electrochemical aptasensor based on the improved G4 DNAzyme and its working principle

傳感器的工作原理如下:當目標物KANA存在時,KANA與Apt+TP+N3-G4復合探針中的Apt進行特異性結合,導致 toehold 區域的暴露;引入 AP后,AP與toehold序列開始進行雜交,通過鏈置換反應置換出N3-G4;釋放出的 N3-G4與電極表面的CP雜交而被固定至MCH/CP/AuNPs/GCE電極上;將DBCO-peptide孵育至電極后,peptide末端修飾的DBCO與G4末端的N3發生點擊化學反應,使peptide與G4 共價組裝,從而在K+和Hemin存在下形成G4 DNAzyme-peptide復合物。Hemin具有較強的氧化還原活性,可以提供電化學信號,DNAzyme-peptide催化底物H2O2則可進一步放大電化學信號,從而實現對KANA的高靈敏檢測。

1.3.3 凝膠電泳實驗凝膠樣品的制備:分別將5 μL濃度為5 μmol/L的Apt、TP、N3-G4、Apt+TP+N3-G4、Apt+TP、TP+N3-G4于95 ℃水浴鍋中加熱5 min;于25 ℃金屬振蕩器中振蕩2 h;采用1×TBE配制12%非變性聚丙烯酰胺凝膠。每份樣品取10 μL,將其與2 μL 6×上樣緩沖液混合,之后轉移到凝膠電泳系統中,在120 V恒定電壓下電泳70 min,并用 1%的Gel Red染色液染色30 min;使用凝膠成像系統成像。

1.3.4 電化學測量方法利用循環伏安(CV)法,在含有5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的PBS緩沖液中對電化學適配體傳感器的制備過程進行表征。其中,掃描速率為50 mV/s,電位范圍為-0.2～0.7 V。

采用差分脈沖(DPV)法測量電化學適配體傳感器對卡那霉素檢測的響應性能,掃描電位范圍為0.1～-0.6 V,振幅為0.05 V,脈沖寬度為0.05 s,采樣寬度為0.016 7 s。

采用CV法在含有5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的PBS(pH=7.4,0.1 mol/L)緩沖液中,考查不同濃度CP(0.2 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L、2.5 μmol/L)對電流信號的影響。

為了考查電化學適配體傳感器的選擇性,在相同條件下,將該傳感器應用于同類抗生素妥布霉素(TOB,50 nmol/L)和鏈霉素(STR,50 nmol/L),非同類抗生素四環素(TET,50 nmol/L)及KANK與上述抗生素的混合物(KANA+Mixture)的檢測,采用差分脈沖(DPV)法考查傳感器對不同抗生素的響應性能。

1.3.5KANA的檢測將10 μL不同濃度的KANA目標物(0 pmol/L、0.06 pmol/L、0.10 pmol/L、2.00 pmol/L、2.00×102pmol/L、2.00×103pmol/L、2.00×104pmol/L)與10 μL Apt+TP+N3-G4(2 μmol/L)復合探針進行混合,于37 ℃恒溫搖床中孵育90 min。加入10 μL AP(1 μmol/L),繼續孵育30 min,得到含有N3-G4的混合溶液。將混合溶液孵育至MCH/CP/AuNPs/GCE電極上,接著滴涂5 μL的DBCO-peptide(1 μmol/L)。將所得電化學適配體傳感器置于含有H2O2(2 mmol/L)的PBS緩沖液中進行檢測。檢測限LOD的計算公式為3δ/k,其中,δ為3個空白樣品的標準差,k為標準曲線的斜率。

1.3.6 加標回收實驗為了驗證電化學適配體傳感器在食品中抗生素的檢測能力,在牛奶樣品中加入不同濃度梯度(1.0×10-4nmol/L、2.0×10-3nmol/L、0.2 nmol/L、2.0 nmol/L、5.0 nmol/L)的KANA進行加標回收實驗。

1.4 數據處理

所有實驗均重復 3 次,通過 Origin 2019 軟件繪制圖表,使用Adobe Photoshop CS6繪制傳感器的工作原理圖。

2 結果與討論

2.1 凝膠電泳實驗結果分析

為驗證Apt+TP+N3-G4復合探針的成功制備與目標物誘發的鏈置換反應,進行了聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)實驗,結果見圖2。其中,M為DNA標準參照物的電泳條帶,泳道1、泳道2和泳道3分別為TP、Apt和N3-G4的電泳條帶,泳道4是Apt+TP+N3-G4復合探針的電泳條帶,泳道5是將KANA與Apt+TP+N3-G4復合探針孵育后的電泳條帶。由圖2可知,泳道4上方有一條明亮清晰的條帶,滯后于泳道1、泳道2和泳道3的條帶,說明Apt+TP+N3-G4復合探針成功制備;泳道5上方出現一條亮帶,下方出現一條暗帶,證明KANA可以特異性結合Apt+TP+N3-G4復合探針中的Apt,使Apt從復合探針中釋放,導致toehold區域暴露,進一步引發后續的鏈置換反應。

2.2 適配體傳感器的電化學表征

圖3為適配體傳感器的CV曲線,其中a為裸玻碳電極(GCE),b為 AuNPs/GCE,c為CP/AuNPs/GCE,d為MCH/CP/AuNPs/GCE,e為N3-G4/MCH/CP/AuNPs/GCE,f為DBCO-peptide/ N3-G4/MCH/CP/AuNPs/GCE。由圖3可知,在裸玻碳電極上可以觀察到[Fe(CN)6]3-/4-電子對的特征氧化還原峰(a曲線);將AuNPs沉積于裸玻碳電極,由于AuNPs能夠促進電子傳輸,CV響應電流值有所增加(b曲線);當CP被固定在AuNPs/GCE電極表面時,由于磷酸骨架帶負電荷,對[Fe(CN)6]3-/4-起排斥作用,峰電流顯著降低(c曲線);用MCH封閉CP/AuNPs/GCE電極后,又因MCH是電惰性小分子,峰電流再次降低(d曲線);當卡那霉素目標物與Apt+TP+N3-G4復合探針中的適配體發生特異性識別后,釋放的N3-G4通過堿基互補配對原則與CP進行雜交,從而被組裝至MCH/CP/AuNPs/GCE電極表面,導致電極表面負電荷磷酸骨架數量的增多,使峰電流再次降低(e曲線);在N3-G4/MCH/CP/AuNPs/GCE電極上孵育DBCO-peptide后,由于探針上的磷酸骨架和多肽都會阻止電極表面的電子傳遞,導致峰電流進一步降低(f曲線)。

2.3 適配體傳感器的電化學性能分析

采用DPV法考查不同適配體傳感器在含有H2O2(2 mmol/L)的PBS(pH=7.4)中的電化學響應性能,以驗證實驗方案的可行性,結果如圖4所示。由圖4a)可知,適配體傳感器在未孵育抗生素時,由于傳感器界面缺乏電活性物質,因此沒有觀察到明顯的電流信號。當將抗生素(5 nmol/L,10 μL)孵育至傳感器后,產生了顯著的電流信號,這是由于抗生素可以和Apt+TP+N3-G4復合探針中的適配體(Apt)進行特異性識別,導致 N3-G4的釋放,而釋放的N3-G4 通過與傳感器表面的CP進行雜交,并與Hemin進一步結合,從而將電化學活性物質Hemin捕獲至傳感器的界面上,這也證明了傳感器對抗生素具有良好的響應性能。由圖4b)可知,傳感器在無Peptide時產生的電流信號較小,與之相比,將Peptide引入傳感器系統后,電流信號顯著增強,證明多肽能顯著增強傳感器對抗生素的響應電流,大大提高抗生素檢測的靈敏度。

圖4 不同適配體傳感器在含有H2O2的PBS中的電流響應Fig.4 Current responses of different aptasensors in PBS containing H2O2

2.4 電極表面CP濃度的優化

電極表面CP濃度的優化結果如圖5所示 。由圖5可知,隨著CP濃度的增加,AuNPs/GCE電極的電流信號先降低后逐漸趨于平穩,這是因為CP的負電荷磷酸骨架會對[Fe(CN)6]3-/4-產生電子排斥現象,從而使響應電流下降。當CP濃度超過2.0 μmol/L時,電流信號基本保持不變,所以CP的適宜濃度為2.0 μmol/L。

圖5 CP 濃度對電流信號強度的影響Fig.5 Effect of capture probe concentration on current intensity

2.5 適配體傳感器對KANA的響應性能

圖6為適配體傳感器對不同濃度KANA的電化學響應圖,其中a—g分別對應KANA濃度0 pmol/L、0.06 pmol/L、0.10 pmol/L、2.00 pmol/L、2.00×102pmol/L、2.00×103pmol/L、2.00×104pmol/L。由圖6可知,隨著KANA濃度的提高,峰電流強度越來越大,表明釋放的N3-G4不斷增加,使電極表面Hemin的固載量增加,電流信號不斷增強。

圖6 電化學適配體傳感器對不同濃度KANA的DPV響應曲線Fig.6 DPV response curves of the aptasensor to different concentrations of KANA

圖7為KANA濃度對數值與電流信號強度間的線性關系圖。由圖7可知,KANA濃度對數值與電流信號強度具有良好的線性關系,線性回歸方程為Ι=-1.591 0 lgc-13.574 2,線性相關系數R2=0.995 6,檢測限(LOD)為0.02 pmol/L。

圖7 KANA濃度對數值與電流信號強度間的線性關系圖Fig.7 The linear relationship between the logarithm of KANA concentration and the current signal strength

表1為本文方法與其他KANA檢測方法的分析對比結果。由表1可知,與其他KANA檢測方法相比,本文方法的LOD更低,這說明所構建的電化學適配體傳感器有望成為一種高靈敏檢測食品中抗生素殘留的新方法。

表1 本文方法與其他KANA檢測方法的分析對比結果Table 1 The analysis performance of this method is compared with other KANA detection methods

2.6 電化學適配體傳感器的選擇性

圖8為電化學適配體傳感器對不同抗生素電化學響應結果。由圖8可知,KANA存在時電化學適配體傳感器產生了明顯的電化學信號,而在干擾物TOB、STR和TET中,電化學信號微乎其微。然而,當這些干擾物與KANA共存時,與單獨存在的KANA相比,電化學信號沒有明顯的變化。以上結果表明,該適配體傳感器對檢測KANA具有良好的選擇性,這歸因于適配體對KANA的特異性識別作用。

圖8 適配體傳感器的選擇性Fig.8 The selectivity of aptasensor

2.7 電化學適配體傳感器在實際樣品中的驗證試驗

牛奶樣品中KANA的加標回收實驗結果見表2。由表2可知,該方法在牛奶中的加標回收率為97.1%～105.5%,相對標準差(RSD)為3.60%～5.74%,表明該電化學適配體傳感器適用于牛奶中KANA的檢測。

表2 牛奶樣品中KANA的加標回收實驗結果Table 2 Sample labeling recovery experiment

表3為該電化學適配體傳感器與ELISA法測定牛奶樣品中KANA的對比實驗結果。由表3可知,兩種方法的相對偏差為-3.90%～2.83%,表明本方法與ELISA法結果相一致,說明該電化學適配體傳感器能夠實現牛奶中KANA的快速準確檢測。

表3 電化學適配體傳感器與ELISA法測定牛奶樣品中KANA的對比實驗結果Table 3 Comparison experimental results of the aptasensor and ELISA method for determining KANA in milk nmol/L

3 結論

本文將Peptide與G4 DNAzyme共價組裝得到高活性的DNAzyme-peptide復合物,以Hemin為電子媒介體成功構建了一種新型電化學適配體傳感器,采用DPV法考查該傳感器的電化學響應性能,并將其用于牛奶中KANA的檢測分析。結果表明:與傳統的G4 DNAzyme相比,G4 DNAzyme-peptide的催化性能明顯增強,可以顯著提高傳感器的靈敏度;在CP最優濃度(2.0 μmol/L)下,該傳感器用于KANA檢測時呈現較寬的檢測范圍(0.06 pmol/L～20 nmol/L)和較低的檢測限(0.02 pmol/L),優于其他KANA檢測方法;該傳感器對KANA具有良好的選擇性,用于牛奶實際樣品分析時,加標回收率為97.1%～105.5%,RSD為3.60%～5.74%,且檢測結果與ELISA法相一致。因此,所構建的電化學適配體傳感器在實際食品安全檢測中具有良好的實用性,為抗生素殘留檢測提供了一種新方法。