miR-5188 在肝癌細胞中的作用及網絡調控機制研究

全養雅 黎慧娟 陳 仕 周 艷

【關鍵字】 miR-5188；肝細胞癌；DIDO1；NEAT1；pri-miRNA

在亞洲肝細胞癌（HCC）的發病率居惡性腫瘤的第5 位，在中國HCC 也是一種常見的惡性腫瘤[1]。雖然近年來手術切除、射頻消融、肝移植等多種治療方法不斷發展，但是HCC 治療的遠期效果仍不理想，經治愈性切除術后患者的5年復發和轉移率高達70%，并且多在術后2年內復發[2]。因此，亟需探究HCC 發生和進展的分子機制，從而研發新的診療方案，以期改善HCC 患者的預后并提高總體生存率。miRNA 是在真核生物中發現的一類內源性的、長度為20～25 個核苷酸的非編碼RNA，能通過與靶mRNA 的互補配對從而在轉錄后水平調控靶基因表達，導致mRNA 的降解或翻譯抑制，進而參與腫瘤的發生和進展過程[3]。研究報道，miR-5188 在HCC 組織中表達上調，乙型肝炎病毒X 蛋白（HBx）可以誘導miR-5188 表達并刺激β-連環蛋白（β-catenin）核轉位，從而促進HCC 的腫瘤干性[4]。由于HBV 感染并非是HCC 的充分必要條件，其他因素也可以導致HCC 發生（如丙型肝炎病毒感染等），因此內源性miR-5188 在HCC 發生和進展中的作用仍需進一步探索。本研究探討了內源性miR-5188 在肝癌細胞中的作用及網絡調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中所用的質粒購自山東維真生物科技有限公司；小干擾RNA（siRNA）、miR-5188 mimics和miR-5188 inhibitor 均由廣州瑞博生物醫藥科技有限公司設計并合成；正常肝細胞LO2 購自北京邁瑞達科技有限公司（貨號M186652-125 mL×4）；肝癌細胞HepG2 購自深圳市優里生物科技有限公司（貨號BN-CC338070）；DMEM 培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司（貨號XB01-08）；LipofectamineTM2000 轉染試劑盒購自北京鼎泰博揚科技有限公司（貨號11668027）；MTT 試劑購自深圳市益百順科技有限公司（貨號T818538-5g）；抗NONO 抗體購自廣州市文?？茖W儀器有限公司（貨號DF7254-100）；抗GAPDH 抗體購自廣州德為生物科技有限公司（貨號AP0066）；抗PSF 抗體購自北京拜爾迪生物技術有限公司（貨號bs-19683R）；抗DIDO1 抗體購自廣州偉然生物科技有限公司（貨號DF3612-100）；G 蛋白 Dyna 珠子購自深圳拓山生物科技有限公司（貨號10003D）；潮霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司（貨號A600230-0250）；熒光素酶檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司（貨號11402XY60）；RNA 提取試劑盒購自廣州基準科技服務有限公司（貨號R4132-03）；反轉錄試劑盒購自北京泰合通生物科技有限公司（貨號4387406）；RIPA 裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司（貨號P0013B）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和處理 LO2 細胞和HepG2 細胞均培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，并置于37 ℃、5% CO2的環境中培養。轉染前，將指數生長期的細胞接種于培養板或培養皿中，使用LipofectamineTM2000 轉染試劑盒將質粒、siRNA、miR-5188 mimics 和miR-5188 inhibitor 分別轉染至細胞，轉染后48～72 h 收集細胞，用于后續實驗。

1.2.2 細胞增殖能力檢測 采用MTT 法檢測細胞增殖能力。分別將指數生長期的LO2 細胞和HepG2 細胞接種至培養基中的96 孔板，孵育過夜。使用MTT 試劑（5 mg/mL）檢測細胞的增殖能力，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 NONO、DIDO1 和PSF 的表達水平檢測 采用蛋白質印跡法檢測NONO、DIDO1 和PSF 的表達水平。于裂解緩沖液中獲得HepG2 細胞裂解物，使用 BCA 蛋白測定試劑盒檢測蛋白質濃度。通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白并轉膜，使用相應的抗體（抗GAPDH、NONO、DIDO1 和PSF 抗體）對其進行免疫探測。使用ECL 試劑盒檢測蛋白質，使用ChemiDocTMXRS+分子成像儀獲取圖像。

1.2.4 PSF 與NONO 相互作用的檢測 采用免疫共沉淀技術和蛋白質印跡法檢測PSF 與NONO 的相互作用。免疫共沉淀的操作步驟：取2 μg 特異性抗體于4 ℃下在 200 μL 裂解緩沖液中與G 蛋白Dyna 珠子偶聯2 h，用裂解緩沖液洗滌3 次后，加入300 μL 全細胞提取物（用RIPA 裂解液制備的HepG2 細胞）。將混合物于4 ℃下旋轉孵育2 h，將珠子用裂解緩沖液洗滌4 次后，重新懸浮于1×SDS 上樣緩沖液中，煮沸用于免疫印跡分析。

1.2.5 miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188 和長鏈非編碼RNA NEAT1 的表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR 法檢測LO2 細胞和HepG2 細胞中miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188 和長鏈非編碼RNA NEAT1（下文簡稱NEAT1）的表達水平。使用RNA 提取試劑盒分離LO2 細胞和HepG2 細胞的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA合成cDNA，以cDNA 作為模板，使用特異性引物進行擴增。PCR 的反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min；然后95 ℃ 15 s，57 ℃ 60 s，共計40 個循環。使用Bio-Rad T100 型和Bio-Rad CFX96 型PCR 儀分別進行cDNA 合成及PCR 反應。

1.2.6 NONO/PSF 與pri-miR-5188 相互作用的檢測 采用紫外交聯免疫沉淀技術檢測NONO/PSF與pri-miR-5188 的相互作用。將15 cm 培養皿中的貼壁細胞在冰冷的PBS 中沖洗2 次，在 254 nm波長的紫外燈（120 mJ/cm2）下交聯，在1 mL Tris-HCl 裂解緩沖液中于冰上刮擦并裂解10 min，輔以蛋白酶抑制劑和RNase 抑制劑。將裂解物渦旋，然后在4 ℃下以17 000×g 離心5 min。上清液與5 μg抗NONO 抗體、抗PSF 抗體或對照同種型G 蛋白Dyna 珠子在4 ℃下旋轉90 min。用于每個反應的G 蛋白Dyna 珠子（80 μL）用1 mL 裂解緩沖液沖洗2 次，并在4 ℃下用1 mg/mL 的牛血清白蛋白封閉2 h。將珠子重新懸浮于100 μL 裂解緩沖液中，然后添加至反應管中，在4 ℃下旋轉孵育2 h。然后用高鹽緩沖液將珠子洗滌2 次，并用裂解緩沖液洗滌3 次。免疫沉淀的樣品用脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）處理，然后用蛋白酶K 消化。使用RNeasy MinElute 柱試劑盒純化RNA。

1.2.7 敲除NEAT1 的細胞系構建 構建敲除NEAT1 的HepG2 細胞，以探究NEAT1 在pri-miR-5188 加工中的作用。 使用CRISPR 基因編輯工具（http://crispr.mit.edu） 設計小向導RNA（sgRNA）。將4 對 sgRNA 序列克隆到PiggyBac 質粒（PBC2）中，每對sgRNA 均應用U6 啟動子。使用LipofectamineTM2000 轉染試劑將含有sgRNA 的PBC2 質粒和表達Cas9 的質粒共轉染至HepG2 細胞中。轉染后24 h，使用潮霉素處理敲除NEAT1的細胞4 d?；罴毎囵B于含有10%胎牛血清且不含抗生素的新鮮DMEM 培養基中，以便在分離單個克隆之前恢復1～2 d。采用直接測序法驗證敲除成功與否。

1.2.8 miR-5188 與DIDO1 靶向關系的檢測 利用miRNA 靶基因預測數據庫miRDB 獲取miR-5188潛在的靶基因，包括DIDO1、PARP8、WDR11、SGCB、CLDN10、WASF2、SBSPON、RUFY3 和RPS6KA2 基因。采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-5188 與DIDO1 的靶向關系。擴增DIDO1 3'非翻譯區（3'-UTR）野生型（WT）片段，用于驗證miR-5188 是否靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR。應用GeneTailorTM定點誘變系統進行miR-5188 結合位點的定點誘變（MT）。將3'-UTR-WT 或3'-UTRMT 克隆至psiCHECKTM-2 載體中用于熒光素酶檢測。將載體與miR-5188 mimics 或對照序列共轉染至HepG2 細胞中，并在轉染后48 h 應用雙熒光素酶報告基因分析系統檢測HepG2 細胞中熒光素酶活性。

1.2.9 pri-miR-5188 的加工水平檢測 采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測pri-miR-5188 的加工水平。構建pri-miR-5188 加工雙熒光素酶報告系統，若pri-miR-5188 被加工，則熒光素酶因缺失Poly（A）尾而無法被翻譯。將報告載體轉染至HepG2細胞中，并在轉染后48 h 應用雙熒光素酶報告基因分析系統檢測經不同處理的HepG2 細胞中熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

應用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，2 組間比較采用Student'st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。采用一般線性模型重復測量方差分析比較MTT 測定結果的差異。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-5188 靶向DIDO1 對HepG2 細胞增殖能力的影響

過表達miR-5188 后，HepG2 細胞的增殖能力增強；敲低miR-5188 表達后，HepG2 細胞的增殖能力減弱，差異均有統計學意義（P均＜0.05）， 見圖1。 結果顯示， 敲低PARP8、WDR11、SGCB、CLDN10、WASF2、SBSPON、RUFY3 或RPS6KA2 表達后，HepG2 細胞的增殖能力無顯著變化；敲低DIDO1 表達后，HepG2 細胞的增殖能力增強；過表達DIDO1 后，HepG2細胞的增殖能力減弱，差異均有統計學意義（P均＜0.05），見圖2 和圖3。過表達miR-5188 后，HepG2 細胞中DIDO1 的表達水平降低；敲低miR-5188 表達后，HepG2 細胞中DIDO1 的表達水平升高，差異均有統計學意義（P均＜0.05），見圖4。雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，miR-5188 靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR（P＜0.05），見圖5。同時過表達miR-5188 和DIDO1 后，HepG2 細胞的增殖能力無顯著變化，見圖6。

圖1 過表達或敲低miR-5188 表達對HepG2 細胞增殖能力的影響

圖2 敲低DIDO1 表達對HepG2 細胞增殖能力的影響

圖3 過表達DIDO1 對HepG2 細胞增殖能力的影響

圖4 過表達或敲低miR-5188 表達對HepG2 細胞中DIDO1 表達水平的影響 A 過表達miR-5188 B 敲低miR-5188 表達

圖5 miR-5188 與DIDO1 3'-UTR 的靶向關系

圖6 過表達miR-5188 或同時過表達miR-5188 和DIDO1 對HepG2 細胞增殖能力的影響

2.2 NEAT1 介導NONO/PSF 復合體形成并促進pri-miR-5188 的加工

與LO2 細胞相比，HepG2 細胞中miR-5188和pre-miR-5188 的表達水平均顯著升高，而primiR-5188 的表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P均＜0.05），見表1。與LO2 細胞相比，HepG2 細胞中NEAT1 的表達水平顯著升高（P＜0.05），而NONO 和PSF 的表達水平差異均無統計學意義（P均＞0.05），見表1 和圖7。敲低NEAT1、NONO 或PSF 表達后，HepG2 細胞中pri-miR-5188的表達水平均顯著升高（P均＜0.05），熒光素酶活性均顯著升高（P均＜0.05），見圖8、9。敲除NEAT1 后，HepG2 細胞中pri-miR-5188 的表達水平升高，NONO 與PSF 的相互作用減弱，并且NONO/PSF 與pri-miR-5188 的結合減少，見圖10、11 和12。

表1 LO2 和HepG2 細胞中miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188和NEAT1 的表達水平比較

圖7 LO2 細胞和HepG2 細胞中NONO 和PSF 表達的蛋白電泳圖

圖8 敲低NEAT1、NONO 或PSF 表達后對HepG2 細胞中primiR-5188 表達的影響

圖9 雙熒光素酶報告基因實驗檢測NEAT1、NONO 或PSF 對pri-miR-5188 的加工水平

圖10 敲除NEAT1 后對HepG2 細胞中pri-miR-5188 表達水平的影響

圖11 敲除NEAT1 后對HepG2 細胞中PSF 與NONO 相互作用的影響 A 蛋白質印跡法檢測親本細胞和NEAT 敲除細胞中NONO 和PSF 的表達水平 B 免疫共沉淀和蛋白質印跡法檢測親本細胞和NEAT 敲除細胞中NONO 與PSF 的相互作用

圖12 敲除NEAT1 后對HepG2 細胞中NONO/PSF 與pri-miR-5188 相互作用的影響

3 討論

本研究結果顯示，過表達miR-5188 可增強HepG2 細胞的增殖能力；而敲低miR-5188 表達后，HepG2 細胞的增殖能力減弱；此外，miR-5188 靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR。DIDO1 首次在WOL-1細胞中被發現，其氨基酸序列包含1 個富含谷氨酰胺的區域、2 個鋅指基序、1 個來自N 端核定位信號的酸性序列，以及1 個位于C 端的富含賴氨酸的序列[5-6]。在正常細胞質中，絲氨酸/蘇氨酸上的DIDO1 磷酸化水平較低[7]；若DIDO1 被磷酸化激活后，其會移位至細胞核以觸發WOL-1 細胞凋亡[8]。由此推測，miR-5188 可能通過下調DIDO1的表達及降低肝癌細胞的凋亡水平，從而促進肝癌細胞增殖。

本研究結果顯示，與LO2 細胞相比，HepG2細胞中miR-5188 和pre-miR-5188 的表達水平均顯著升高，而pri-miR-5188 的表達水平顯著降低。研究發現，小部分miRNA 是由自身基因編碼的，約80%的miRNA 來自各種大型編碼和非編碼轉錄物[9]。這些最初的轉錄本被稱為pri-miRNA，可被細胞核中由Drosha 和DGCR8 組成的微處理器復合物加工成pre-miRNA[10]。由Exportin 5 進行核輸出后，pre-miRNA 可被Dicer 酶進一步加工為成熟的miRNA，然后進入RNA 誘導的沉默復合物而發揮生物學功能[11-13]。由此推測，提高肝癌細胞中primiR-5188 的加工水平可升高成熟miR-5188 的表達水平。本研究結果顯示，敲除NEAT1 后，HepG2 細胞中pri-miR-5188 的表達水平升高，NONO 與PSF的相互作用減弱，并且NONO/PSF 復合體與primiR-5188 的結合減少。研究表明，在轉錄過程中和轉錄后，大量RNA 結合蛋白、RNA 解旋酶可在單個加工步驟中調節miRNA 的生物發生[14]。另有研究報道，NEAT1 可以促進NONO/PSF 復合體形成[15]，這與本研究的結論相符。NONO/PSF 復合體可以結合大量表達的pri-miRNA，并提高Drosha-DGCR8微處理器復合物對pri-miRNA 的處理能力[14]。因此，NEAT1 可以介導NONO/PSF 復合體形成并促進pri-miR-5188 的加工。

綜上所述，HepG2 細胞中NEAT1 的表達水平升高，提高了NONO/PSF 復合體對pri-miR-5188 的加工水平，增強了miR-5188/DIDO1 軸對HepG2 細胞增殖能力的正向作用。因此，miR-5188 可能可以作為HCC 的潛在治療靶點。本研究是一項基于體外細胞水平的實驗，未進行臨床試驗或活體動物實驗，下一步將構建敲除NEAT 的小鼠模型以驗證本研究結論。