IL-35 和IL-37 在幽門螺桿菌相關性胃炎和胃潰瘍患者中的表達及臨床意義

王 瓊 呂 穎

幽門螺桿菌（Hp）是生長于人類胃部的一種特殊致病菌，Hp感染者常伴隨急性或慢性炎癥反應[1]。據統計，全球約50%的人群已感染Hp，其中2%～5%會發生胃癌，因此Hp感染被認為是導致胃部疾病發生的重要因素[2]。胃炎是Hp感染者常見的并發疾病，根據癥狀持續時間可分為急性胃炎和慢性胃炎，其中慢性胃炎通常是胃潰瘍和胃癌等較嚴重胃部疾病的前驅疾病。研究表明，70%～85%的胃潰瘍和90%～95%的十二指腸潰瘍是由Hp感染誘發的[3]。IL-35 是IL-12 家族成員，被認為是一種抗炎細胞因子，可以在多種病原體感染過程中調節免疫反應和炎癥反應[4-5]。IL-37 是IL-1 家族成員，廣泛存在于骨髓、睪丸、淋巴結、胸腺和皮膚等組織器官中，其被認為具有一定的抗炎作用[6-7]。IL-35 和IL-37 在多種病原體感染者中表達水平的變化已有不少報道，但關于兩者在Hp感染導致的胃炎和胃潰瘍患者中表達水平變化的報道較少。本研究探討了IL-35 和IL-37 在Hp相關性胃炎和胃潰瘍患者中表達水平的差異及臨床意義。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年6月至2021年6月中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四一醫院收治的胃炎和胃潰瘍患者作為研究對象。納入標準：（1）行胃鏡檢查，且結果顯示有胃黏膜改變；（2）符合《慢性胃炎基層診療指南（2019年）》[8]中胃炎的診斷標準；（3）符合《消化性潰瘍基層診療指南（2023年）》[9]中消化性潰瘍的診斷標準，且經胃鏡確診；（4）符合《第六次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告（非根除治療部分）》[10]中Hp感染的診斷標準。排除標準：（1）近2 個月內服用過阿司匹林或非甾體抗炎藥；（2）合并惡性腫瘤；（3）合并嚴重代謝性疾病或自身免疫??；（4）服用免疫抑制劑；（5）感染HBV、丙型肝炎病毒（HCV）或人類免疫缺陷病毒（HIV）等。最終納入124 例患者，其中Hp相關性胃炎和胃潰瘍患者共80 例，非Hp相關性胃炎和胃潰瘍患者共44 例。所有入組患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 分組和資料收集

在入組的124 例患者中，Hp相關性胃炎患者42 例（設為HAG 組），非Hp相關性胃炎患者24例（設為nHAG 組），Hp相關性胃潰瘍患者38 例（設為HGU 組），非Hp相關性胃潰瘍患者20 例（設為nHGU 組）。收集所有入組患者的性別、年齡、BMI，以及血清總膽固醇（TC）、尿酸（UA）、ALT、AST 和C 反應蛋白（CRP）水平等臨床資料。

1.3 樣本采集

采集入組患者的空腹外周血10 mL，500×g 離心10 min，分離血漿，所得血漿凍存于-80 ℃冰箱，待后續實驗檢測其中IL-35 和IL-37 的表達水平。所有入組患者在行胃鏡檢查時采集胃黏膜活體組織，碾碎后加入裂解液在冰上充分裂解，使用總RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑盒[均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司]獲取cDNA，凍存于-80 ℃冰箱，待測。

1.4 血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達水平檢測

采用ELISA 法檢測血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達水平。取1.3 中的血漿在室溫下融化，500×g 離心5 min，使用ELISA 檢測試劑盒（購自美國R＆D 公司）并嚴格按照說明書進行操作。使用HM-96A 型多功能酶標儀（購自山東恒美電子科技有限公司）進行比色分析，測定樣本在450 nm波長處的光密度（OD）值，繪制標準曲線，根據OD 值計算樣本含量。

1.5 胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR 法檢測胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的表達水平。單個樣本的PCR反應體系包括Master mix、IL-35 或IL-37 的正向引物和反向引物各1 μL、樣本cDNA 和ddH2O。PCR反應條件：95 ℃預處理5 min；95 ℃ 40 s，60 ℃40 s，72 ℃ 15 s，共計35 個循環；最后4 ℃ 2 h。以GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCt法計算IL-35 和IL-37 mRNA 的相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統計學方法

應用SPSS 23.0 和GraphPad 8.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。計數資料以例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。采用Spearman 相關系數法分析Hp相關性胃炎和胃潰瘍患者中IL-35 和IL-37 的表達水平與胃潰瘍發生的相關性。采用logistic 回歸模型分析影響Hp相關性胃潰瘍發生的危險因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組的臨床資料比較

結果表明，4 組的年齡、性別構成，以及BMI、TC、UA、ALT、AST 和CRP 水平的差異均無統計學意義（P均＞0.05），提示具有可比性。見表2。

表2 各組的臨床資料比較

2.2 HAG 組和nHAG 組中IL-35 和IL-37 的表達水平比較

由表3 可知，與nHAG 組相比，HAG 組患者血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對表達量均顯著降低，組間的差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

表3 HAG 組和nHAG 組中IL-35 和IL-37 的表達水平比較

2.3 HGU 組和nHGU 組中IL-35 和IL-37 的表達水平比較

由表4 可知，與nHGU 組相比，HGU 組血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對表達量均顯著降低，組間的差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

表4 HGU 組和nHGU 組中IL-35 和IL-37 的表達水平比較

2.4 Hp 相關性胃炎和胃潰瘍患者的各項指標與胃潰瘍發生的相關性

結果顯示，Hp相關性胃潰瘍患者血漿中IL-37蛋白的表達水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對表達量均與胃潰瘍的發生呈負相關（P均＜0.05），其余指標與胃潰瘍的發生均無顯著相關性（P均＞0.05）。見表5。

表5 Hp 相關性胃潰瘍患者的各項指標與胃潰瘍發生的相關性

2.5 胃潰瘍發生的影響因素分析

以Hp相關性胃炎和胃潰瘍患者是否發生胃潰瘍作為因變量（發生胃潰瘍=1，未發生胃潰瘍=0），以2.4 中具有統計學意義（P＜0.05）的項目（包括IL-35 mRNA、IL-37 和IL-37 mRNA）作為自變量，納入logistic 回歸模型分析，結果顯示IL-35 mRNA、IL-37 和IL-37 mRNA 均為胃潰瘍發生的保護因素（P均＜0.05）。見表6。

表6 影響胃潰瘍發生的logistic 回歸模型分析

3 討論

Hp感染是胃炎、胃潰瘍等消化系統疾病的重要致病因素，也是導致消化道腫瘤發生及進展的重要因素[11]?；颊吒腥綡p后，致病菌會穿透胃壁黏液層，定植于胃上皮細胞表面并大量增殖，同時伴隨毒素因子及多種炎癥細胞因子在細菌定植處大量累積，引發局部及全身性免疫反應和炎癥反應，加重胃黏膜損傷程度，最終導致不同程度的消化系統疾病[12-13]。研究表明，多種炎癥細胞因子參與了Hp感染引起的胃黏膜損傷過程，其中IL 家族扮演了重要角色[14]。IL-1、IL-6 和IL-27 等促炎細胞因子在Hp相關性消化道疾病患者中表達水平的變化已有不少報道[15-16]，但關于抗炎細胞因子（如IL-35、IL-37）的表達水平變化尚未明確，本研究對此進行了探討。

研究表明，在多種急慢性感染性疾病、免疫相關疾病患者中，IL-35 具有抑制炎癥細胞增殖的作用[17]。在自身免疫性結腸炎患者中，IL-35 抑制Th1 和Th17 細胞增殖的作用較IL-27 更強，其可以在一定程度上避免因過度自身免疫反應導致的腸道損傷[18]。p35 和EBI3 是IL-35 的2 個亞基，均參與了免疫反應和炎癥反應過程。研究表明，p35可減輕單純皰疹病毒性角膜炎（HSK）合并慢性HBV 感染大鼠的炎癥反應，而EBI3 能夠通過下調IL-17 和IL-22 的表達及抑制Th17 細胞的活性，從而減弱大鼠的免疫防御功能[19]。IL-37 在多種病理、生理過程中發揮著抗炎作用。巨噬細胞和上皮細胞可以通過分泌IL-37 抑制其他炎性細胞因子（如IL-1α、IL-1β、IL-6 和TNF-α 等）的表達[20]。研究表明，IL-37 通過附著在IL-18Rα、IL-18BP 和IL-37/IL-18Rα 復合體上而激活抗炎反應[21]；另有研究表明，IL-37 在受到機體內外源性因素的刺激后會被半胱氨酸特異性天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）激活，通過改變細胞膜通透性而發揮抗菌、抗病毒、中和內毒素及抑癌等多種免疫防御作用[22]。

本研究結果顯示，Hp相關性胃炎和胃潰瘍患者血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對表達量均較未感染者顯著降低；此外，通過相關性分析發現血漿中IL-37 蛋白的表達水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對表達量均與Hp相關性胃潰瘍的發生呈負相關，而血漿中IL-35 蛋白的表達水平與Hp相關性胃潰瘍的發生無顯著相關性，這可能與納入研究的樣本量較少，或ELISA 檢測結果的偏倚有關。本研究中logistic 回歸模型分析結果顯示，IL-35 mRNA、IL-37 和IL-37 mRNA 均為胃潰瘍發生的保護因素。以上結果提示，Hp感染會降低抗炎細胞因子IL-35 和IL-37 的蛋白表達水平和轉錄水平。由此推測，Hp可能通過上述途徑抑制機體固有免疫防御和特異性免疫防御功能，導致Hp定植處的胃黏膜屏障受損，進而誘導Hp相關性胃炎患者的病情加重，但Hp相關性胃炎是否更容易進展為胃潰瘍或胃癌，仍有待進一步驗證。

綜上所述，Hp相關性胃炎和胃潰瘍患者中IL-35 和IL-37 均呈低表達，兩者對于診斷胃炎和胃潰瘍患者是否感染Hp具有一定應用價值。本研究存在一定的局限性：首先，本研究為單中心研究，且所有入組患者均需行胃鏡檢查及活體組織檢查，導致最終納入的病例數較少，今后的研究需擴大樣本量；其次，本研究僅選擇了IL-35 和IL-37 作為觀察指標，未對其他炎癥細胞因子進行檢測；最后，本研究探討了IL-35 和IL-37 在Hp相關性與非Hp相關性胃炎和胃潰瘍患者中表達水平的差異，今后需進一步分析兩者發揮抗炎效應的具體作用機制。