條斑紫菜綠斑病優勢病原菌的鑒定及其生長特性與藥敏分析*

王 穎,趙龍成,王浩同,杜建周,王洪斌,趙曉恒,程漢良,許建和,陳香凝,丁祝進

(1.江蘇海洋大學 a.海洋科學與水產學院; b.江蘇省海洋生物技術重點實驗室; c.江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室; d.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心,江蘇 連云港 222005; 2.鹽城工學院 材料科學與工程學院,江蘇 鹽城 224051)

0 引言

條斑紫菜[1](Porphyrayezoensis),隸屬紅藻綱、紅毛菜科。藻體鮮紫紅色或略帶藍綠色,卵形或長卵形,一般高12～70 cm。作為我國重要的經濟海藻之一,年總產值超50億元,廣泛栽培于江蘇、山東沿海地區[2]。條斑紫菜是一種常見的海藻,也被稱為紫菜、海苔或海帶。它是一種富含營養的食物,特別是富含蛋白質、維生素和礦物質,被廣泛用于制作壽司、海苔包飯等傳統食品,也可作為調味料或零食食用。近年來,隨著對條斑紫菜的需求增加和認識的提高,其養殖規模也在不斷擴大,但也帶來一些問題,如過高密度的栽培和水質惡化等。這些問題會對養殖環境和紫菜的健康生長產生一定影響[3]。

條斑紫菜綠斑病是嚴重危害紫菜生長的病害,在整個紫菜栽培期間都有可能發生,尤以每年的11—12月份最為嚴重,特別是降雨或采收后極易發生[4]。綠斑病主要出現在幼葉或成葉階段,并且多數發生在營養豐富的海灣或有機物廢水較多的外海性海區[5]。綠斑病通過水體傳播,感染紫菜葉片,導致葉片出現綠色斑點或綠色條紋。嚴重的病情會導致葉片變形、腐爛甚至死亡。已有報道表明,上述病害在韓國和日本的暴發給條斑紫菜養殖業帶來了巨大的經濟損失[6-7]。本文實驗主要是對條斑紫菜綠斑病優勢致病菌進行研究。利用16S rRNA測序[8]鑒定條斑紫菜綠斑病致病菌,使用固體培養基分析該致病菌的生長曲線,并利用K-B紙片法進行藥敏試驗[9]。本實驗可為條斑紫菜綠斑病病原防治提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 紫菜綠斑病優勢致病菌的PCR擴增及測序鑒定

條斑紫菜綠斑病優勢致病菌由江蘇海洋大學海洋藻類生物學實驗室分離保存。首先,分別制備海水固體/液體培養基以及LB固體/液體培養基(見表1),然后對分離的條斑紫菜綠斑病優勢致病菌菌株進行劃線培養,培養24 h挑取單菌落進行培養。

表1 培養基配方Table 1 Medium formula

獲取16S rRNA基因序列進行鑒定[10]。一般來說,若所測菌株的16S rRNA基因序列與已知典型菌株基因序列的相似度小于97%,則認為該菌株可能是新種;若兩者相似度大于97%,則仍不能確定是這個已知種,只能認為最接近于該種。如果需要更準確的結果,還需要進行DNA-DNA雜交等。

采用TIANGEN公司細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取細菌總DNA,所有操作步驟按試劑盒說明書進行。提取的總DNA通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測濃度與純度。以提取的總DNA為模板,進行細菌16S rRNA基因(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)的PCR擴增,并利用質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳分析條帶大小,將PCR產物送上海邁浦生物科技有限公司進行測序分析。

1.2 深海微小桿菌生長曲線制作

1.2.1 制備深海微小桿菌菌種 先制作深海微小桿菌固體培養基,然后在培養基平板上面用接種環進行平板劃線。培養18 h后,在超凈工作臺里面挑取單菌落接入到海水液體培養基以及LB液體培養基中。每種液體培養基各5 mL,于37 ℃ 170 r/min培養15 h后測量其OD600,并用于下一步接種。

1.2.2 分組及標記編號 取滅完菌之后的2 mL離心管共108支,分為4組每組27支,每3 h為一個時間節點,共測9個時間節點(0,3,6,9,12,15,18,21,24 h),每個時間節點測3個重復的OD值,并計算平均值。海水培養基28 ℃組標記為dH,海水培養基37 ℃組標記為H;LB培養基28 ℃組標記為dL,LB培養基37 ℃組標記為L。

1.2.3 接種培養 根據分組,分別在每個2 mL離心管中加入1 mL海水液體培養基或LB液體培養基,隨后在每支離心管中分別加入10 μL深海微小桿菌菌種,按照分組分別在28 ℃或37 ℃條件下振蕩培養。然后,分別按對應時間節點將離心管取出,于4 ℃貯存備用。

1.2.4 生長曲線制作 分別測定各組9個時間節點的深海微小桿菌OD600吸光值,并據此計算和制作生長曲線。

1.3 深海微小桿菌藥敏試驗方法

使用K-B紙片擴散法[11]進行藥敏試驗。先用平板畫線法對深海微小桿菌進行培養,之后挑取單菌落接種到LB液體培養基中,在37 ℃ 180 r/min振蕩培養12 h。隨后,將菌種稀釋40倍后在每個平板上均勻涂布200 μL,涂布完成后干燥3～5 min。然后,將20種抗生素(青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、新霉素、四環素、氯霉素、麥迪霉素、多粘菌素B、林可霉素、復方新諾明、呋喃唑酮、諾氟沙星、氧氟沙星、羅紅霉素紙片、恩諾沙星、磷霉素)藥敏紙片放到固體培養基中央,每個藥敏紙片做3個重復,標記并用封口膜封好后置于37 ℃恒溫培養箱中培養。分別在培養6,18,和24 h后使用游標卡尺[12]測量抑菌圈直徑并記錄數據。

1.4 數據分析

實驗結果以平均值±標準誤(Mean±SE)來表示,并用軟件SPSS 17.0的單因素方差分析(One-way ANOVA)進行顯著性分析。其中,統計學上的顯著性水平設置為P<0.05,極顯著水平設置為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 綠斑病優勢致病菌鑒定結果分析

圖1是綠斑病優勢致病菌16S rRNA基因序列擴增結果,PCR條帶單一,送上海邁浦生物科技有限公司進行測序。獲得序列通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)官網進行BLAST比對分析,結果表明該紫菜綠斑病優勢致病菌與深海微小桿菌同源性達97.94%。

注:1～8表示16S rRNA基因在退火溫度為50～64 ℃梯度下的擴增結果,M為DNA marker。圖1 紫菜綠斑病優勢致病菌16S rRNA擴增結果Fig.1 Results of 16S rRNA amplification of the dominant pathogen of Porphyra green spot disease

2.2 深海微小桿菌生長曲線分析

如圖2所示,深海微小桿菌在海水培養基中不同溫度下的生長曲線整體呈上升趨勢。在28 ℃條件下,深海微小桿菌在0～6 h內生長較為緩慢,OD600吸光值在9 h和15 h出現2次波動,在24 h達到峰值。與28 ℃相比,深海微小桿菌在37 ℃條件下生長曲線更加平緩,并在21 h達到峰值。

圖2 深海微小桿菌在海水培養基中不同溫度下的生長曲線Fig.2 Growth curve of Microbacter bathyae at different temperatures in seawater medium

如表2所示,在海水培養基中,條件為37 ℃時OD600吸光值明顯高于 28 ℃時的OD600吸光值。而在LB培養基中,在3,6,12 h時,37 ℃的OD600吸光值高于 28 ℃;在9,15,18,21,24 h時,28 ℃吸光值明顯高于37 ℃,并且在24 h時,條件為28 ℃的OD600吸光值達到最大。

表2 深海微小桿菌在不同培養基各時間節點OD600吸光值Table 2 OD600 value of Microbacter bathyae at different time points of various medium

如圖3所示,深海微小桿菌在LB培養基中28 ℃條件下生長曲線同樣出現波動。主要表現為6～9 h之間生長速度顯著加快,隨后持續生長,并在24 h達到峰值。在37 ℃條件下,深海微小桿菌在12 h的OD600吸光值最高,隨后下調?？傮w而言,深海微小桿菌在兩種培養基中37 ℃條件下生長情況均比在28 ℃條件下更加穩定,且在海水培養基中深海微小桿菌的菌種豐度普遍要高于LB培養基。

圖3 深海微小桿菌在LB培養基中不同溫度下的生長曲線Fig.3 Growth curve of Microbacter bathyae on LB medium at different temperatures

2.3 藥敏實驗結果分析

本實驗初步探索了深海微小桿菌對常見抗生素的敏感性。表3為各種抗生素紙片在6,18,24 h抑制深海微小桿菌生長所形成的抑菌圈直徑。結果表明,同一種抗生素在3個不同時間節點形成的抑菌圈大小無顯著差異,且深海微小桿菌對20種抗生素均表現出較高的敏感性,其中青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、麥迪霉素和四環素的抑菌效果更加顯著。

表3 各種抗生素不同時間節點抑菌圈直徑Table 3 Diameter of bacteriostatic zone at different time points of various antibiotics mm

根據藥敏性判定標準:抑菌圈直徑20 mm以上為極敏,15～20 mm為高敏,10～14 mm為中敏,10 mm以下為低敏,0 mm為不敏,所以可以判斷出各種抗生素的藥敏性。從表4可以看出,每種抗生素產生的抑菌圈的透光度也有區別。例如氯霉素(圖4a)產生的抑菌圈較小,并且圈內較為模糊。麥迪霉素(圖4b)比氯霉素(圖4a)圈內更為模糊,并且其邊界更加不清晰。四環素(圖4c)抑菌圈雖然小但是透亮。而青霉素(圖4d)抑菌圈大并且透亮。表4中有少許抗生素有圈內模糊的情況,模糊的原因可能是此種抗生素具有抑菌效果,卻無法做到完全殺滅這種細菌,因此在圈內依然有少許深海微小桿菌在生長。從表4中還能看出其他異常情況。如青霉素(圖4d),其抑菌圈內可較明顯地分為內圈和外圈,而且在圈內可以發現有些許菌落,此種屬于特殊情況。造成的原因可能是實驗誤差問題導致深海微小桿菌在其抑菌圈內生長,但并不能表明深海微小桿菌對青霉素會產生耐藥性。

b 麥迪霉素

c 四環素

d 青霉素圖4 深海微小桿菌藥敏試驗代表性圖例Fig.4 Representative examples of antibiotic susceptibility test of Microbacter bathyae

3 討論

綠斑病首次發現于日本,其病原較為廣泛,從患病紫菜中可以分離出微球菌[13]、假單胞菌[14]以及弧菌[15]。中國已報道檸檬假交替單胞菌(Pseudoalteromonascitrea)引起的條斑紫菜綠斑病[16]。目前報道的綠斑病病原菌大部分具有較強的胞外酶活性,這些胞外酶導致的宿主損傷可能是引起紫菜葉片綠斑的重要原因。近年來研究發現,葉綠體病毒也可以引起條斑紫菜綠斑病的發生[17]。而在本文實驗中經過若干次實驗與條件變換,發現綠斑病優勢致病菌經過16S rRNA基因序列擴增結果與深海微小桿菌同源性達97.94%。這說明綠斑病的優勢病原菌最接近深海微小桿菌,但是到目前為止對深海微小桿菌的研究報道較少。

本文研究采用了光密度(OD)測量[18]結果反應深海微小桿菌的生長情況。該方法通過檢測培養基濃度,以培養基濃度代表其中菌的數量。培養基的濃度與OD值成正比,OD 值越大表示菌數量越多。該方法的優點是能夠快速方便地了解菌的生長情況,但是由于測的是OD值,得到的是培養基里面的總菌數,活菌和死菌都包含在內,就導致了菌的生長曲線[19]衰亡期測量不準確,本研究繪制的生長曲線衰亡期表現就不太明顯。但是本研究繪制的延遲期、對數生長期與穩定期曲線都可以看出結果。

由于本種細菌為深海微小桿菌,其未在美國臨床實驗室標準委員會(clinical and laboratory standard institute,CLSI)里面建立參考數據,并且CLSI里面的標準以及討論多針對于臨床,更多的是給人用藥,所以CLSI里面的標準對于本種細菌藥敏實驗的結果參考性不大。但是數據結果仍以表4作為判斷標準,抑菌圈透明度數據僅為參考數據。李純等[20]與曾世祥[21]的研究表明,抑菌圈大小仍然是臨床上判斷細菌對藥物敏感性的主要依據。本藥敏實驗出現某些抗生素抑菌圈模糊的情況,根據重復組實驗結果判斷可以排除pH、鹽度等的影響,有可能是某些抗生素對深海微小桿菌有一定抑制作用,但是無法徹底殺滅該菌。

大量研究表明,紫菜葉狀體的病害[22]是由多方面因素引起的,致病原因十分復雜。除了本身的生理不適應、種質退化和環境條件不適宜等因素外,微生物也是不可忽視的一個重要因素[23]。綠斑病病癥只是一種表觀特征,多種因素造成的藻體破壞、藻紅素溶出,均可呈現綠斑病癥狀。海水溫度異常升高、降雨或有機質污染引起藻體代謝失常都可能引起紫菜綠斑病[24],但環境脅迫條件下導致的附生微生物菌群失控是引起紫菜發生病害的主要原因[25]。通過環境因子實驗,發現高溫、高密度養殖是引起紫菜綠斑病發生的主要因子,而海水密度的變化在一定程度上可以減緩病爛速度,這也與海區栽培情況相印證[26]。每年11、12月份,海區紫菜進入快速生長期,此時網簾上紫菜密度較大,為致病菌提供了豐富的營養和良好的環境。在正常養殖條件下,條件致病菌數量一般維持在一定范圍內,不具備致病力。當出現升溫或降雨等環境變化,條件致病菌的致病性可能增強[27],造成紫菜綠斑病的發生。合理控制養殖密度,及時疏苗,密切注意水溫等氣象環境的變化,充足的干出以改變紫菜表面海水密度等,可以有效抑制綠斑病的發生。

本文研究通過16S rRNA測序進行菌種鑒定,建立快速檢測的LAMP技術[28],并進行生長特性及藥敏實驗分析,得到深海微小桿菌為綠斑病的優勢病原菌,但其具體感染和致病機制有待進一步深入研究。

4 結論

本文以綠斑病優勢致病菌為研究對象,對其進行了16S rRNA鑒定,并且繪制了該菌的生長曲線,研究了其對藥物的一般敏感性,最終對該菌的LAMP方法進行了探索。實驗主要結論如下:

(1) 該菌株為深海微小桿菌(E.profundum),革蘭氏陽性菌。

(2) 該菌株在海水培養基(鹽度為30)中生長情況比在LB培養基(鹽度為10)中好。

(3) 該菌株在37 ℃時對環境適應速度比在28 ℃時快。

(4) 該菌株對青霉素、氨芐西林等20種抗生素均有敏感性,即該菌株對常見的抗生素均無抗藥性。