中草藥黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選與作用機制研究

鐘瑜萍，許鑫鑫，肖 迪，朱賢娜，林雪儀，劉志偉

（1.嘉應學院 生命科學學院，廣東 梅州 514015；2.嘉應學院 廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州 514015）

痛風作為單鈉尿酸鹽沉積所致的晶體相關性關節病，與嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）直接相關[1].它們為同一疾病的不同惡化時期，當HUA 患者的血尿酸濃度超過了其溶解度的最大值，尿酸將會結晶，沉積于關節滑膜、滑囊、軟骨等組織，導致急性痛風發作[2].黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是引起痛風的關鍵因素，它可以通過促進次黃嘌呤的合成進而促進尿酸的產生[3]，同時生成超氧自由基，產生過氧化氫分子，引起氧化應激損傷等反應[4-6].而XO 可被黃嘌呤氧化酶抑制劑（xanthine oxidase inhibitor，XODI）抑制，故XODI 在痛風治療中具有重大意義.XODI 如別嘌呤醇、非布索坦等使絕大多數患者的癥狀得到控制[7]，已作為臨床治療痛風的一線藥物.但在治療的同時，也會帶來一些副作用，如別嘌呤醇帶來的胃腸道癥狀、非布索坦帶來的心血管疾病[8-10].因此迫切需要尋找具有低不良反應、更經濟的XODI 藥物來治療痛風.

傳統中草藥在痛風治療方面具有臨床療效確切且副作用相對較小的優勢[11-12]，從中草藥中發現天然的XODI 是目前研發的重要領域.梅州客家中草藥的種類豐富，民間常用品種近200 種，常用于藥用、藥膳、涼茶等.本文根據各藥材功效應用，再結合梅州客家中草藥市場調查研究[13]中的用藥習慣選擇8 種梅州客家地區常用作藥膳的藥食同源的藥材（茵陳[14]、白茅根[15]、粉葛[16-17]、雞骨草[18-19]、五指毛桃[20]、石參[21]、地菍[22-24]和三月泡[25-26]）作為研究對象.一方面從抑制尿酸生成的角度出發初步評價上述8 種中草藥體外抑制XO 的作用，另一方面從中草藥中總黃酮的角度出發，評價其抗氧化活性，篩選活性優良的中草藥，再借助網絡藥理學對其治療HUA 潛在分子作用機制進行分析，為相關客家中草藥藥效物質基礎的進一步研究及其應用提供科學參考.

1 儀器與材料

1.1 儀器

BP211D 分析天平（賽多利斯貿易有限公司）；CP1100D Crest 超聲波清洗機（美國CREASTAUDIO公司）；FD-1A-50 真空冷凍干燥機（北京博醫實驗儀器有限公司）；RE-2000B 真空旋轉蒸發儀（上海亞榮儀器有限公司）；T6 新世紀紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；ULUO-Ⅰ-10T 超純水機（四川優普超純科技有限公司）.

1.2 藥材

所有藥材均購買于梅州市梅江區瓜園市場，經鑒定：茵陳為菊科植物茵陳蒿的干燥地上部分；白茅根為禾本科植物白茅的干燥根莖；粉葛為豆科植物甘葛藤的干燥根；雞骨草為豆科植物廣州相思子的干燥全株；五指毛桃為?？浦参锪颜崎诺母?；石參為豆科貍尾豆屬植物貓尾草的干燥根；地菍為野牡丹科植物地菍的干燥全草；三月泡為薔薇科懸鉤子屬植物山莓的干燥根.

1.3 試劑

別嘌呤醇（陽性對照，No：428A021，純度≥98%）、黃嘌呤（No：111E041，純度≥98%）、蘆?。∟o：1215I021，HPLC≥98%）和黃嘌呤氧化酶（No：427W011，純度≥99%）均購自北京索萊寶科技有限公司，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，No：C12169642，HPLC≥98.5%）購自上海麥克林生化科技有限公司，5%亞硝酸鈉（NaNO2）溶液、10%硝酸鋁（Al(NO3)3）溶液和4%氫氧化鈉（NaOH）溶液均為實驗室自制，水為超純水.

2 方法

2.1 提取物的制備

分別稱取茵陳250 g，石參330 g，粉葛280 g，五指毛桃290 g，雞骨草250 g，三月泡230 g，白茅根260 g，地菍250 g，加水煮沸1 h，料液比1∶3（g/mL），重復2 次，合并濾液，用真空旋轉蒸發儀在80 ℃下旋轉蒸發至粘稠狀后真空冷凍干燥為粉末，避光保存備用.

2.2 總黃酮含量測定

精確稱取0.017 0 g 蘆丁，無水乙醇溶解定容至50 mL，依次等比稀釋得到濃度為340、170、85、42.5、21.25 和10.63μg/mL 的蘆丁標準品溶液，以質量濃度為橫坐標（X），吸光度值為縱坐標（Y）繪制標準曲線和回歸方程.分別吸取100 μL 8 種樣品溶液（無水乙醇溶解藥材提取物，濃度為2 mg/mL）于試管中，并向試管中分別加入900 μL 的無水乙醇，向試管內分別加入0.5 mL 5%NaNO2溶液，震蕩混勻放置6 min 后，加入0.5 mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻后繼續放置6 min，再加入4 mL 4%NaOH 溶液搖勻靜置20 min.以無水乙醇代替樣品作為空白對照.510 nm 波長處測定吸光度.通過標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量.

2.3 黃嘌呤氧化酶抑制活性篩選體系優化

將100 μL 75 mM 磷酸鹽緩沖液加入96 孔板，待加入50 μL 0.1 U/mL XOD，37 ℃孵育3 min 后分別加入50 μL 濃度為500、400、300、200、100、50、25 和12.5 μM/mL 的黃嘌呤溶液，啟動反應，在295 nm 的波長處每間隔20 s 記錄1 次吸光度的數值，直至各濃度平臺期.每組設置三個平行.

2.4 8 種藥材提取物黃嘌呤氧化酶抑制活性

具體方法參考文獻[11]，簡述如下：檢測8 種藥材對XOD 的抑制活性，以黃嘌呤為底物，XOD 抑制劑別嘌呤醇作為陽性對照，使用酶標儀進行測定，重復2 次.實驗分為空白組、酶反應組、抑制劑組和對照組.分組及劑量見表1.將100 μL 樣品溶液（無水乙醇溶解藥材提取物）和50 μL 酶溶液混合均勻，37 ℃預孵15 min，加入50 μL 最適濃度的黃嘌呤底物溶液來啟動反應，于37 ℃孵育15 min，再用酶標儀檢測其在波長為295 nm 下的OD 值.每樣品需做3 個復孔，重復操作3 次.抑制率（%）=[1-（抑制組OD 值-對照組OD 值）/（酶反應組OD 值-空白組OD 值）]×100%.

表1 分組與劑量

2.5 IC50的計算

通過Graphpad prism 7.0 軟件對這8 種藥材提取物進行數據分析.橫坐標選取提取物濃度（C）的對數、縱坐標為其相應的吸光值，進行線性擬合，計算XOD 的抑制活性到達一半時的藥物濃度，即IC50.

2.6 抗氧化活性測定

分別以0.05 g/mL 的8 種藥材溶液作為樣品溶液（無水乙醇溶解藥材提取物）.實驗分為3 組：2 mL樣品溶液+2 mL DPPH 溶液（抗氧化組，B2）；2 mL 無水乙醇+2 mL DPPH 溶液（空白組，B1）；2 mL樣品溶液+2 mL 無水乙醇（對照組，B3）.避光反應25 min 后于517 nm 處測量OD 值.

2.7 網絡藥理學分析

2.7.1 雞骨草靶點的收集

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）及BATMAN-TCM 數據庫獲取雞骨草的活性成分及靶點，將兩個數據庫收集的藥物靶點取并集后，導入UniProt 數據庫進行標準化處理.TCMSP 數據庫檢索篩選標準設置為口服利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18；BATMAN-TCM 數據庫篩選標準設置分數截止（Score cutoff）≥20，P值＜0.05.數據庫網址見表2.

表2 數據庫及軟件平臺網址

2.7.2 藥物-成分-靶點網絡構建

將篩選后的中藥成分名稱進行重新編號，導入Cytoscape 3.6.0 軟件繪制雞骨草藥物-成分-靶點網絡.利用軟件內置的network analyzer 插件進行網絡特征分析.根據自由度值（degree）的大小，篩選確定雞骨草中最重要的化學成分.

2.7.3 疾病相關靶點的收集及交集靶點的篩選

在DisGeNET，GeneCards 數據庫中分別以“hyperuricaemia”和“HUA”為檢索詞獲取疾病相關靶點，合并兩數據庫結果，得到疾病靶標數據集.將雞骨草藥物靶點與HUA 疾病靶點導入在線韋恩圖繪制平臺Venny 2.1 獲取交集靶點，并繪制韋恩圖.

2.7.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

將交集靶點錄入STRING 數據庫構建PPI 網絡，選擇分類人類Homo sapiens，置信度＞0.4.導出為.tsv文件后，使用Cytoscape3.6.0 軟件對其進行可視化處理.

2.7.5 藥物-靶點-疾病網絡構建與分析

使用Cytoscape 3.6.0 軟件中內置的merge 功能對復方藥物成分，藥物靶點，疾病靶點，取交集構建藥物成分-靶點-疾病網絡，使用network analyzer 功能進行網絡特征分析.

2.7.6 基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

將交集靶點按“degree≥2 倍度值中位數”篩選出14 個核心靶點，應用MetaScape 數據平臺對篩選出的核心靶點進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析，包括生物過程和信號通路分析.選擇種族人類homo sapiens，設定P＜0.05，其余選項保持默認值，分析雞骨草治療HUA 潛在的生物過程和信號通路.利用微生信在線平臺繪制GO 分析條狀圖和KEGG 富集氣泡圖.

2.7.7 藥物成分-靶點-通路網絡構建與分析

藥物成分-靶點-通路網絡構建與分析使用Cytoscape 3.6.0 軟件中內置的merge 功能對藥物成分，藥物靶點，疾病靶點及GO 富集中的BP 通路，取交集構建藥物-成分-靶點-通路網絡，使用network analyzer功能進行網絡特征分析.

3 結果

3.1 蘆丁標準曲線

以蘆丁質量濃度340、170、85、42.5、21.25 和10.63μg/mL 為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=0.002 059X+0.008 036，相關系數為R2=0.999 3.表明蘆丁濃度在5.31～340 μg/mL 和吸光度呈良好的線性關系見圖1.

圖1 蘆丁標準曲線

3.2 總黃酮含量和抗氧化活性

藥材總黃酮含量如表3 所示：地菍、茵陳、石參、粉葛、五指毛桃、雞骨草、三月泡和白茅根的總黃酮含量分別為4.33、0.19、0.18、0.42、0.17、0.18、4.58 和0.17 mg/g.

表3 總黃酮含量和抗氧化活性

藥材（無水乙醇溶解藥材提取物，濃度為0.05 g/mL）的抗氧化作用如表3 所示，地菍、茵陳、石參、粉葛、五指毛桃、雞骨草、三月泡和白茅根的抗氧化活性分別為94%、55%、87%、76%、93%、85%、51%和86%.這8 種藥材對自由基的清除效果良好，都大于50%，其中五指毛桃和地菍的抗氧化活性均大于90%.

3.3 黃嘌呤氧化酶抑制活性篩選體系優化

在酶濃度一定的條件下加入不同濃度的黃嘌呤，可以直接觀察反應達到平臺期的時間會隨底物濃度的增加而增加，而其反應速率基本沒變化.由圖2 可知，當底物終濃度為500 μmoL 時，其OD 值信號的檢測窗口為0.8～1.4，3 min 內達到平臺期，這種情況下的系統誤差小，又能保證足夠的運算時間，故選擇這個條件進行以下研究.

圖2 不同濃度底物下黃嘌呤氧化酶動力學

3.4 8 種藥材提取物黃嘌呤氧化酶抑制活性

8 種藥材提取物在不同濃度時對黃嘌呤氧化酶的抑制作用如表4.結果表明，在0.1～0.4 mg/mL 濃度時，8 種藥材提取物均對黃嘌呤氧化酶具有不同程度的抑制作用，且隨著濃度的增加，黃嘌呤氧化酶抑制活性增加.茵陳、石參、三月泡、五指毛桃、粉葛、地菍、雞骨草和白茅根的IC50分別為255.9、287.6、160.1、249.6、296.6、139.2、201.2 和288.9 μg/mL.

表4 8 種不同濃度的藥材提取物對黃嘌呤氧化酶抑制活性

3.5 雞骨草成分及藥物靶點的篩選

篩選得雞骨草中的化學成分有10 個.利用獲得的10 個成分去篩選靶點，去重后共得142 個.將上述所得的成分和靶點數據導入到Cytoscape 3.6.0 進行網絡構建，獲得雞骨草藥物成分-靶點網絡，該網絡包含153 個節點，310 條邊.綠色箭頭代表雞骨草化學成分，橙色圓形代表化學成分相應靶點，如圖3.藥物-成分-靶點網絡分析結果顯示，自由度排名前5 的化學成分如表5.

圖3 藥物-成分-靶點網絡

表5 藥物自由度（Degree）前五活性成分

3.6 藥物與疾病交集靶點的收集

以“hyperuricaemia”和“HUA”為關鍵詞，分別在DisGeNET 數據庫檢索到205 個靶點，在GeneCards數據庫獲取751 個，經合并去重后，得疾病靶點824 個.將藥物靶點與疾病靶點取交集，得28 個共有靶點，該交集靶點即為雞骨草治療HUA 的靶點.韋恩圖如圖4 所示.

圖4 雞骨草與HUA 的靶點交集

3.7 交集靶點PPI 網絡構建

將28 個交集靶點導入STRING 平臺構建PPI 網絡圖，如圖5.根據靶點的相關屬性信息，并以“degree”大于或等于中位數為篩選條件，最終獲得雞骨草治療HUA 的核心靶點14 個.Degree 前五名為雌激素受體1（ESR1）、雄激素受體（AR）、Jun 原癌基因（JUN）、胱天蛋白酶3（CASP3）、胱天蛋白酶8（CASP8）.

圖5 雞骨草治療HUA 的蛋白質相互作用網絡（PPI）

3.8 藥物-靶點-疾病網絡構建

“藥物-靶點-疾病”網絡如圖6 所示，該網絡包括38 個節點，61 條邊.綠色菱形代表藥物成分，橙色橢圓代表藥物與疾病的交集靶點.化學成分中degree 值排名前5 的依次為：β-sitosterol、Stigmasterol、Taraxasterol、Sophoradiol 和Abrisapogenol G、degree 值排名前5 的靶點分別為：維甲酸X 受體α（RXRA）、雌激素受體1（ESR1）、成纖維細胞生長因子23（FGF23）、轉錄因子3（TCF3）、β-1，4-半乳糖基轉移酶1（B4GALT1）.

圖6 藥物-靶點-疾病網絡

3.9 GO 富集分析和KEGG 通路分析

通過MetaScape 數據平臺對雞骨草治療HUA 的14 個核心靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路分析.GO功能富集分析共得到186 個GO 條目（P＜0.05），其中包含共獲149 條生物過程（BP）條目，27 個分子功能（MF）條目，10 個細胞組成（CC）條目.采用相似度度量對獲取的條目進行聚類分析時，采用相似度度量，相似度＞0.3 的子樹被認定為聚類.選擇集群中最具統計學意義的術語來表示集群并作圖，GO 分析結果見圖7.

圖7 雞骨草治療HUA 靶標的GO

KEGG 通路分析共獲57 條信號通路（P＜0.05），依據P值和Count 進行排序，選取可能性最高的聚落進行可視化分析，所得KEGG 氣泡富集圖共7 條通路，通路富集基因越多，氣泡越大，P值越小，顏色越紅，如圖8.

圖8 雞骨草治療HUA 靶標的KEGG

3.10 藥物成分-靶點-通路網絡的構建

將中藥成分，藥物靶點，疾病靶點，評分前14 的BP 通路導入Cytoscape 3.6.0 軟件中取交集，獲得“藥物成分-靶點-通路”網絡進行網絡分析，結果見圖9，包括37 個節點109 條邊.綠色箭型代表藥物成分，黃色橢圓型代表交集靶點，橙色方形代表BP 通路.有效成分degree 值最大5 個成分分別是β-谷甾醇（β-sitosterol）、槐二醇（Sophoradiol）、相思子酚G（Abrisapogenol G）、豆甾醇（Stigmasterol）、蒲公英甾醇（Taraxasterol）.degree 值最大的5 個靶點分別是雌激素受體1（ESR1）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、視網膜X 受體α（RXRA）、細胞色素P450 家族27 亞家族B 成員1（CYP27B1）、雄激素受體（AR）.

圖9 藥物成分-靶點-通路網絡

4 討論

脾腎虧虛；外感風、寒、濕、熱等邪氣和飲食不節、情志不暢等因素都可能誘發痛風.中藥的散風、逐塞、祛濕、清熱、通絡、活血、行氣、補虛這8 種方式對痛風的治療具有顯著效果[27].本研究依據梅州客家地區用藥習慣及藥材功效，選取8 種常用的分別具有清熱利濕、利尿、通經活絡、健脾化濕等功效的中草藥（茵陳、白茅根、粉葛、雞骨草、五指毛桃、石參、地菍和三月泡），通過XO 抑制活性評價其潛在痛風治療作用，發現這8 種中草藥水提物對XO 具有不同程度的抑制作用，其中雞骨草抑制效果最好.其中，葛根和石參的活性分別與林娜[28]、藍梓華[29]的報道相似，此前未見茵陳、白茅根、雞骨草、五指毛桃、地菍和三月泡的XO 抑制活性報道.郝悅[30]還證實許多黃酮類物質具有XO 抑制活性，從上述實驗結果來看，8 味中草藥都含有總黃酮，但能否作為降尿酸的物質基礎還需進一步研究.因此，本研究借助網絡藥理學對雞骨草對抗HUA 的潛在作用機制進行了分析，得出雞骨草通過多成分、多靶點、多通路抗HUA的結果.研究結果提示雞骨草有5 種重要有效成分，可能作用于ESR1、PTGS2、RXRA、CYP27B1 和AR等靶點，通過調控多種生物過程來實現抗HUA 的作用.這表明雞骨草可能通過β-sitosterol、Sophoradiol、Abrisapogenol G、Stigmasterol 和Taraxasterol 這些有效成分成為治療HUA 的潛在藥物.本文得到的實驗結果為揭示這些中草藥降尿酸功效提供了科學依據，同時需進一步用現代質譜技術對雞骨草提取物中主要成分進行分離和鑒定，分析其可能的物質基礎，以及相關靶點之間的相互作用還待進一步實驗驗證.