高產蛋白酶菌的分離、誘變及其對羽毛的降解效果

廖靜如，梁琦欣，成潔如，彭芯怡，溫倩怡，李威娜，李姣清

（嘉應學院 生命科學學院，廣東 梅州 514015）

隨著現代人們對家禽消費需求量的持續增加，家禽加工后的副產品羽毛也在大量被積累，目前僅有少量優質的羽毛被用來制造服裝、工藝品等，大多數羽毛都被廢棄，而羽毛成分中主要成分角蛋白在自然環境條件下難降解，易造成環境污染[1].目前角蛋白降解主要途徑包括高溫、高壓和酸堿水解等，這些途徑能耗大，成本高，易對環境造成二次污染，而利用產蛋白酶的微生物對富含角蛋白的羽毛廢棄物進行降解則是一種效率高、成本低和環境友好型的方式[2-3].目前已有報道分離出多種能分泌角蛋白酶或是能降解雞羽毛的菌株，包括真菌、細菌和放線菌[4-6]，然而自然存在的微生物蛋白酶產率往往較低，為解決這一問題，一般要設法獲得高產蛋白酶的菌株.紫外誘變是通過紫外線引起菌株基團堿基發生顛換、轉換、缺失以及移碼突變等達到改變菌株遺傳信息的目的[7],經紫外線誘變后通過一定的方法可以篩選出有利或者人們想要的有意義突變，從而獲得具有應用價值的菌株.紫外誘變可以提高細菌菌種的產酶能力，如謝鳳行等人報道淀粉芽孢桿菌進行紫外誘變后，菌株的產淀粉酶活性由37.10 U/mL 提高到56.95 U/mL，提高了53.5%[8];牛春華等利用紫外誘變的方法成功將枯草芽孢桿菌正變菌株透明圈直徑與菌落直徑的比值由原來的3.01 提高到5.52[9].因此本試驗選擇了從雞羽毛長期堆放的土壤中分離具有降解羽毛能力的菌株為起始菌株，通過紫外誘變，以期提高菌株的蛋白酶活性，篩選出降解羽毛效率更高的突變菌株，為實現羽毛廢棄物的資源再利用提供參考途徑.

1 實驗材料

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集

采自梅州市丙村鎮雞養殖場長期存放廢棄羽毛處的土壤，取羽毛堆積處5 cm 的土壤，室內風干后4 ℃儲存，備用.

雞羽毛：收集于梅州市東廂市場雞屠宰店.將收集的雞羽毛用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水漂洗，清洗干凈后，剪去羽毛梗頭部，于烘箱中60 ℃烘干至恒重，保存備用.

1.1.2 培養基

篩選培養基：脫脂奶粉10 g，瓊脂15g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O(100 g/L)0.1 mL，NaCl 0.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4，分別經脫脂奶粉與除脂溶解滅菌備用.

復選培養基：完整的整片羽毛2 g，K2HPO41 g,KH2PO40.4 g,NaCl 1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L,pH 7.2～7.4，滅菌備用.

LB 液體培養基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 1 g,蒸餾水1 L,pH 7.2～7.4.

LB 固體培養基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 1 g,瓊脂15g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4.

羽毛發酵培養基：稱取烘干后完整的雞羽毛10 g，K2HPO41 g，KH2PO40.4 g，NaCl 1 g，pH 7.2～7.4.

2 實驗方法

2.1 菌株分離、篩選及觀察

稱取5 g 從丙村雞養殖廠采集的土壤樣本，加入錐形瓶內（瓶內含45 mL 無菌水），置于30 ℃、180 r/min 培養搖床30 min，制成懸浮液.取0.1 mL 置于篩選培養基中，于30 ℃、180 r/min 的搖床中培養24 h.取懸浮液按10-4～10-8梯度進行稀釋.取各梯度懸浮液0.1 mL 于篩選培養基上涂布，將平板放入37 ℃恒溫中培養箱培養48 h，觀察其是否長出透明圈并測定透明圈大小，初步篩選蛋白酶活性相對較高的菌株并在復篩培養基上進一步純化培養后取單菌落進行革蘭氏染色，觀察菌體形狀及大小.

2.2 菌株蛋白酶活性的測定

將篩選TR5 菌株分別接入裝液量為50 mL 的發酵培養基，在37 ℃，180 r/min 搖床培養24 h.本試驗使用酪蛋白作為底物參照文獻來測定菌株的蛋白酶活力[10].蛋白酶酶活力定義：1 mL 液體酶在40 ℃、pH=7.5 條件下每min 水解底物產生1 μg 酪氨酸為一個酶活力單位,以U/mL 表示.蛋白酶活性計算公式如下：

X：樣品的酶活力，U/mL；C：樣品管的酪氨酸濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；C0：樣品空白管的酪氨酸濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V：試樣第一次稀釋的總體積，單位為毫升（mL）；4：酶反應體系總體積，單位為毫升（mL）；N：樣品提取液第二次稀釋的倍數；1.0：參與反應的酶量，單位為毫升（mL）；m：試樣體積，單位為毫升（mL）；10：反應時間，單位為分鐘（min）.

2.3 菌株羽毛降解率的測定

將菌株接種到羽毛發酵培養基中，在37 ℃，180 r/min 搖床培養24 h.將發酵菌液在8 000 r/min 條件下離心10 min，去上清液，吸取少量羽毛發酵培養基吹打離心管中的沉淀物，使其分散，然后轉接到50 mL羽毛發酵培養基中，在37 ℃，180 r/min 條件下，連續搖床培養7 d，進行羽毛降解率的測定，分別記錄初始羽毛的質量，培養后通過離心取殘渣，用烘箱烘至恒重，記錄降解后殘留羽毛的質量，兩者的質量之差就是降解部分的質量：

2.4 菌株DNA 的提取及鑒定

將TR5 菌株接種于50 mL 的LB 液體培養基中，37 ℃培養24 h，按照Omega Bio-Tek 公司生產的試劑盒Bacterial DNA Kit 提取DNA.將樣本送至廣州艾基生物科技有限公司進行16S rDNA 測序，測序完畢后，將該DNA 序列在NCBI 網站中進行Blast 序列比對，以確定TR5 菌株的類別.

2.5 菌株的誘變

誘變條件：紫外線波長為254 nm，紫外燈功率15 W，照射距離為30 cm，照射時間分別為0 s、60 s、120 s、180 s 和240 s，照射時打開磁力攪拌器，使菌液均勻旋轉.然后將誘變菌液進行10 倍稀釋，取稀釋液0.2 mL 涂布于篩選平板，并用黑色袋子包裹后置于37 ℃恒溫培養24 h.挑選菌落周圍酶解圈較大的菌株，于發酵培養基中37 ℃恒溫培養48 h，檢測蛋白酶活性.

3 實驗結果

3.1 土壤中產蛋白酶菌株初篩和復篩

從不同土壤中，利用牛奶培養基篩選得到TR1、TR2、TR3、TR4、TR5，5 株能夠產蛋白酶的菌株，它們均能有效的分解牛奶培養基中的蛋白成分形成水解圈.通過計算水解圈直徑與菌株直徑的比值（HC）如表1 所示，TR5 菌株的HC 值最大，初步判斷其水解蛋白能力最強.利用羽毛液體發酵培養基，將初篩得到的5 株有較大水解圈的菌株于發酵培養基中進行搖瓶復篩，48 h 發酵后，觀察基羽毛降解情況，并以2.2 的方法測定其蛋白酶活力，結果見圖1.發現其中編號為TR5 的菌株降解羽毛的效果最好，其酶活力為31.33 U/mL，將菌株TR5 作為出發菌株.

圖1 菌株的蛋白酶活力

表1 牛奶培養基菌落的HC 值

3.2 形態學觀察及菌株的鑒定

通過篩選獲得的菌株TR5，其在初篩平板上菌落為乳白色、邊緣不規則、扁平、表面光滑，挑起時較粘稠，革蘭氏染色后鏡檢，發現菌株TR5 為革蘭氏陽性菌、短直桿狀、有芽孢，染色均勻（圖2），初步判斷其為芽孢桿菌（Bacillus sp.）.菌株TR5 經16 s rDNA 通用引物進行PCR 擴增，產物測序結果與GenBank 數據庫中的序列進行相似性比對發現（圖3），該菌株基因序列與芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA 同源性均達98%以上，基本可以確定該菌為解淀粉芽孢桿菌.

圖2 TR5 菌株的菌落形態和菌體形態特征

圖3 菌種基因結果比對圖

3.3 菌株的紫外誘變及突變菌株的篩選

通過紫外照射時間的優化，發現紫外照射120 s 時誘變效果最佳.由圖4 可知，誘變后突變株（TR5-1）的酶解圈直徑明顯比出發菌株(TR5) 大.誘變菌株酶解圈直徑與菌落直徑的比值也明顯大于出發菌株，經過菌株發酵液中蛋白酶酶活的測定，芽孢桿菌TR5 和誘變菌株TR5-1 的酶活力分別為31.33 U/mL，42.13 U/mL，酶活性顯著提高.

圖4 紫外誘變后不同時間段的水解透明圈

3.4 菌株對羽毛的降解效果

將TR5 和TR5-1 菌株分別接種到含雞羽毛的發酵培養基中連續培養7 d，試驗結果顯示誘變菌株TR5-1 在羽毛發酵培養基中對羽毛的降解效果更好，在培養7 d 降解率可高達80.6%，而出發菌株降解率為51.3%，菌株經紫外誘變處理后對羽毛的降解效率顯著提高（P＜0.005，見圖5）.

圖5 菌株對羽毛的降解

4 討論與結論

雞羽毛質量占到雞總質量的5%～7%，己成為家禽屠宰中的主要廢棄物，羽毛的不合理處理會造成嚴重的環境污染[11]，目前利用生物降解方法來降解羽毛是最環保的處理方式，羽毛中90%是角蛋白，故角蛋白酶是生物降解羽毛的關鍵酶，細菌是角蛋白酶的主要來源，以往人們在自然環境中發現的角蛋白降解細菌以芽孢桿菌為最多，常見的有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等，少見的還有專性嗜堿芽孢桿菌[12-13]，這些研究結果表明，自然環境中豐富的芽孢桿菌可能是降解環境中角蛋白廢棄物的主力軍.本研究通過從環境中分離和鑒定微生物菌株，從而獲得了一株能降解羽毛的解淀粉芽孢桿菌，菌能產生蛋白酶降解角蛋白的研究已有報道，王晶等人于2006 年首次從環境中篩選和鑒定一株降解角蛋白降解淀粉芽孢桿菌[14].本研究篩選的解淀粉芽孢桿菌在液體發酵培養時，蛋白酶活性為31.33 U/mL，菌株在羽毛發酵培養基中對羽毛降解率可達51.3 %.為了進一步提高細菌分泌酶的能力，本試驗中利用紫外誘變方法使該菌株DNA 中的嘧啶堿基形成二聚體，阻礙堿基的配對，從而影響菌株DNA 正常的復制和轉錄，引起細菌突變，選育出產酶活性高的突變菌株TR5—1，通過對該菌株羽毛降解能力的研究，發現本研究誘變選育的菌株羽毛降解能力有顯著提高，可將該菌株應用于堆肥、禽類羽毛等生物質資源開發利用的前處理階段；在改善生物廢棄物資源堆積、過剩問題，在提高資源轉化再利用方面具有廣闊的應用前景.