兩種不同海洋生物材料對大鼠急性創面修復效果的研究

王 蕾，呂康寧，李文軍，王 凱，姜曉銳，秦 松

兩種不同海洋生物材料對大鼠急性創面修復效果的研究

王 蕾1, 2，呂康寧1，李文軍1，王 凱3，姜曉銳3，秦 松1

(1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 煙臺毓璜頂醫院, 山東 煙臺 264001)

為研究來源于海洋的魚類膠原蛋白和海藻酸鹽對創面的修復效果, 建立大鼠皮膚急性創面模型, 對兩種材料的功效進行探索。研究采用臨床常用創面敷料使用方法, 將兩種材料植入創面處, 采用細胞生物學、病理學等方法進行觀察評價。結果顯示, 魚膠原蛋白和海藻酸鹽均具有良好的生物相容性和誘導創面修復能力, 但在誘導血管長入、材料降解融合以及整體創面修復狀態等方面, 魚類膠原蛋白要優于海藻酸鹽。結果證明, 兩種不同的海洋生物材料均可以創造良好的傷口愈合環境, 有效促進創面的修復。

創面修復; 海藻酸鹽; 膠原蛋白; 誘導

皮膚作為人體抵御外界侵襲的第一道屏障, 具有重要的機體保護作用, 由創傷、燒傷、割傷等各種物理或化學因素造成的皮膚組織缺損在臨床上也頗為常見[1]。皮膚創面修復過程分為凝血期、炎癥期、肉芽組織形成期及組織重構期四個時期, 是一個多種因子參與、多種機制調控的復雜過程, 任何環節出現問題, 都會導致創面不愈合、創面感染、血管神經受損以及自身免疫功能受損等[2]。因此, 對于大面積皮膚缺損, 尤其是人體難以自愈的缺損, 一般需要借助自體皮膚、皮膚修復材料等進行輔助修復。

在創面修復過程中, 作為細胞外基質最基本、最主要結構性大分子-膠原蛋白的合成、代謝、分解等起到重要的作用, 尤其是作為皮膚結構中的重要類型、與皮膚張力密切相關的Ⅰ型膠原在此當中的作用尤為重要[3]。前期研究發現, 使用從鮭魚中提取的Ⅰ型膠原蛋白制成的敷料, 在燒燙傷造成的大鼠皮膚損傷治療過程中, 表現出良好的促進修復效果; 有研究表明魚皮脫細胞基質具有優異的急性創面修復效果, 具有良好的臨床應用前景[4]。已在臨床應用的海藻酸鹽是一種聚陰離子的天然親水性多糖, 主要由D-甘露糖醛酸(M)和 L-古洛糖醛酸(G)聚合而成, 含有游離羧基, 性質活潑, 與一價以上金屬離子結合后轉化為海藻酸鹽, 高M-嵌段量的海藻酸鹽可以誘導更高水平的細胞因子產生, 促進傷口愈合[5]。雖然兩種來源的海洋生物材料在創面濕潤環境創造、促進創面修復等方面均表現出優異的性能, 但由于原材料來源、生產檢驗標準、功效驗證標準等因素的缺乏, 使得原材料生產環境可控、生產工藝可控、質量和功效可控的海藻酸鹽已在臨床廣泛使用, 而尚不具備上述條件的魚類膠原蛋白尚未獲得醫療器械上市許可。本研究構建了大鼠背部皮膚急性創傷模型, 對使用鮭魚魚皮提取的Ⅰ型膠原蛋白海綿和海藻酸鹽敷料修復效果進行了對比性評價, 參照對比海藻酸鹽敷料的功效和性能, 為魚類Ⅰ型膠原蛋白海綿作為生物醫用材料修復創面提供理論依據, 為其功效評價標準提供一定的依據, 為后期臨床應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

鮭魚膠原蛋白海綿(由實驗室使用大西洋鮭魚魚皮, 經過除雜、脫色、脫脂、脫蛋白、酸溶、酶解、透析等步驟獲得濃縮液后, 放入模具, 低溫冷凍干燥制備而成)。海藻酸鈉敷料購自正規醫療器械生產廠家(由褐藻中提取的海藻酸鹽經過濕法紡絲、無紡布加工、切割包裝、滅菌等工藝加工后制成的無菌醫用敷料)。SD大鼠(Sprague Dawley, 遠交群大鼠, 購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料與細胞共培養

使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基(dulbecco’s modified eagle medium, Dulbecco的改良eagle培養基)將L929細胞在37 ℃含5%CO2的培養箱中, 培養至對數生長期。

活/死染色: 將兩種材料分別放入48孔板, 在相應孔中植入L929細胞, 細胞植入密度5×104個細胞/cm2。培養至第3 d, 將正常細胞培養基換成含1.5 μL碘化丙啶和1 μL鈣黃綠素-AM(Calcein-AM / PI Double Staining Kit, 日本)的PBS溶液, 孵育30 min。將樣品用PBS輕輕洗滌后, 在熒光顯微鏡下觀察。

細胞黏附: 將膠原蛋白海綿、海藻酸鹽敷料分別放入48孔板中, 以5×104個細胞/cm2的密度植入對數生長期的L929細胞, 培養至第3 d, 取出海綿和敷料樣品, 用PBS溶液輕輕洗滌3次后, 用2.5%的戊二醛溶液固定3 h, 低溫冷凍干燥后, 噴金, 掃描電鏡觀察細胞黏附、爬行生長情況。

1.2.2 大鼠皮膚缺損模型制備及處理

將SD大鼠隨機分為A、B、C、D四組, 每組9只, 背部脫毛處理后, 使用直徑1.5 cm的環鉆在裸露位置取全層皮膚, 制作大鼠皮膚缺損模型。A組在缺損處填充魚膠原蛋白海綿; B組填充海藻酸鈉傷口敷料, C組每兩天使用消毒液消毒一次, 常規醫用紗布覆蓋傷口。D組作為正常組對照, 不做任何處理。所有大鼠術后在正常條件下飼喂, 正常飲水。

1.2.3 表征觀察

術后, 觀察記錄大鼠創面位置炎性反應、創面生長、創面周圍紅腫等情況; 同時, 觀察各組植入材料的狀態。記錄每組大鼠創面完全愈合個體出現時間、所有個體完全痊愈時間等, 各組之間進行比較分析。

1.2.4 組織學觀察

建模后, 第3、7、14 d每組大鼠處死3只大鼠, 測量創面區大小后, 沿創面缺損區邊緣外0.5 cm, 內部至肌肉層剪取整個創面缺損區組織。常規石蠟固定、切片后, 進行HE染色、Masson染色, HE染色觀察創面愈合過程中, 缺損部位細胞種類、細胞形態以及組織結構、血管、神經等變化情況; Masson染色觀察大鼠皮膚缺損區膠原蛋白、新生膠原蛋白、植入材料變化情況等。

2 結果和討論

2.1 細胞生長、黏附狀態

通過材料與細胞的共培養, 觀察細胞在材料表面和內部的狀態, 可以判斷材料是否有細胞毒性, 是否有誘導細胞進入、爬行的能力?；?死細胞染色結果顯示(圖1), 膠原蛋白海綿憑借其優異的生物相容性、高孔隙率、高比表面積, 提供了豐富的細胞結合位點, 促使細胞沿孔隙和支架結構生長到材料內部, 并在內部增殖; 海藻酸鹽纖維也可以起到細胞爬行支架功能, 同樣有大量的細胞進入材料內部生長、增殖。掃描電鏡結果進一步確認了細胞在膠原蛋白海綿內部的爬行、生長情況, 在支架內部可見大量的細胞黏附在材料表面(圖1), 部分細胞伸出偽足進行爬行, 部分細胞在材料表面進行分裂; 海藻酸鹽敷料內部同樣有細胞在爬行、增殖, 但數量略少于魚膠原蛋白海綿。由此說明, 細胞可沿膠原蛋白海綿孔隙爬行、分裂, 生長繁殖, 證實材料具有良好的生物相容性、空間結構和細胞結合位點, 無細胞毒性, 適合細胞在其表面和內部黏附、爬行、生長。同樣, 海藻酸鹽也具有良好的誘導細胞黏附、爬行能力。

注: Ⅰ: 魚膠原蛋白海綿; Ⅱ: 海藻酸鹽敷料

2.2 模型制備及傷口愈合情況

由環鉆處理后, 皮膚缺損區直徑達1.5 cm, 未傷及肌肉。魚膠原蛋白海綿與海藻酸鹽敷料均可在短時間內吸收創面處的組織液和血液, 形成類似血痂的結構, 有效保護創面。第3 d, 魚膠原蛋白組個體缺損處的材料與血痂結構融合在一起, 發生不同程度的吸收, 創面明顯縮小; 海藻酸鹽敷料也與血痂融為一體, 創面也明顯縮小; 兩種材料組大鼠個體創面縮小程度差異不大, 但剩余面積明顯小于自愈組個體。第7 d, 兩組皮膚創面面積進一步縮小, 材料覆蓋位置均高于周圍皮膚組織, 可判斷有大量肉芽組織生長, 但魚膠原蛋白組剩余缺損區面積明顯小于海藻酸鹽組。第10 d, 魚膠原蛋白組有部分個體的痂脫落, 傷口完全愈合; 第12 d, 海藻酸鹽組有部分個體傷口完全痊愈; 第14 d, 兩種材料組的所有個體的傷口全部愈合, 對照組尚未出現痊愈的個體(圖2)?？梢猿醪脚袛? 魚膠原蛋白海綿與海藻酸鹽均具有優異的創面修復能力, 具有良好的促進皮膚愈合能力。

注: Ⅰ: 魚膠原蛋白海綿; Ⅱ: 海藻酸鹽敷料; Ⅲ: 自愈組

2.3 組織病理學檢查

HE(圖3)和Masson(圖4)染色結果顯示, 第3 d,兩個材料組個體創面位置均可見少量炎癥細胞, 部分區域出現血管、膠原纖維、成纖維細胞等, 肉芽組織和成纖維細胞數量明顯多于對照組, 但兩組之間差異不明顯, 魚膠原蛋白組新生膠原排列規則有序, 在連續性和數量方面明顯優于海藻酸鹽組; 對照組創面內部有大量的炎癥細胞, 也可見少量血管組織出現, 膠原纖維和成纖維細胞數量明顯低于兩組材料組。第7 d, 魚膠原蛋白組創面處出現大量的膠原纖維組成的肉芽組織, 纖維纖細致密, 排列有序, 內部有大量的血管, 成纖維細胞數量和密度明顯增加, 有大量的新生膠原沉積, 表面上皮組織已可以完全覆蓋創面。海藻酸鹽組大鼠創面處也形成大量的肉芽組織, 表面被上皮組織覆蓋, 內部可見大量血管和成纖維細胞, 但肉芽組織致密程度和新生膠原數量明顯低于魚膠原蛋白組。兩種材料組創面修復狀態明顯好于對照組。第14 d, 魚膠原蛋白組和海藻酸鹽組大鼠創面處均形成完整的上皮組織和輕度的疤痕組織, 魚膠原蛋白組的疤痕組織膠原纖維密度和直徑略小于海藻酸鹽組, 上皮組織與疤痕組織的貼合緊密度要強于海藻酸鹽組。對照組大部分個體尚未完全愈合。

圖3 Hematoxylin-Eosin染色結果

注: Ⅰ: 魚膠原蛋白海綿; Ⅱ: 海藻酸鹽敷料; Ⅲ: 自愈組

圖4 Masson’s trichrome染色結果

注: Ⅰ: 魚膠原蛋白海綿; Ⅱ: 海藻酸鹽敷料; Ⅲ: 自愈組

上述實驗結果表明, 兩種海洋來源的生物醫用材料-魚膠原蛋白海綿和海藻酸鹽均適合作為細胞支架, 具有良好的誘導細胞黏附和爬行能力。魚膠原蛋白在誘導肉芽組織生長、膠原再生等方面, 優于海藻酸鹽。在創面修復效果方面, 兩者差異不明顯, 都具有良好的創面修復能力, 都可以作為有效促進創面的愈合。

參照HE染色量化指標(表1, 分數越高, 傷口愈合越好), 對上述各組染色結果進行評分, 結果如表2所示, 魚膠原蛋白組3個時間點評分均高于海藻酸鹽敷料組, 說明魚膠原蛋白組傷口愈合效果優于海藻酸鹽組, 兩組均明顯優于對照組。

表1 Hematoxylin–eosin染色評分標準表

表2 三組Hematoxylin–eosin染色評分結果統計表(± standard deviation)

*: 與對照組相比, 有顯著性差異(<0.05)

3 討論

皮膚創面修復是一個涉及多種細胞、多種因子、多種路徑的復雜調控過程, 涉及凝血、炎性反應、細胞遷徙、分化、增殖、瘢痕組織增生、血管長入、表皮生長、神經長入等過程[6]。1962年, Winter在研究中首次證實濕潤、具有通透性的敷料所形成的濕潤環境, 有助于表皮細胞的生長、遷徙和爬行, 有效促進傷口的愈合, 并提出了“濕潤傷口愈合理論”, 隨之, 多項研究證明了該理論的正確性, 為促進創面愈合敷料的研究指明了方向[7-9]。海藻酸鹽纖維具有良好的吸濕性能和成凝膠性能[10], 植入傷口位置后, 可快速有效吸收可迅速滲出液和血液, 形成低黏度凝膠, 覆蓋在傷口上, 保持傷口濕潤, 為細胞遷移、爬行和血管再生, 提供一個合適的環境, 加快傷口愈合[11-12]。來源于魚類的膠原蛋白與陸地哺乳動物膠原蛋白氨基酸結構類似, 具有細胞黏附的代表序列, 便于細胞在其空間結構上黏附, 有利于引導組織再生[13-14]; 同時, 肽鏈上有大量的二氨基二羧基的存在, 使得魚類膠原蛋白具有極強的親水性和止血性能, 是理想的創面修復敷料原料[15-16]。

研究中使用的海藻酸鹽敷料為已獲批在臨床應用的醫療器械產品, 被廣泛用于急性創面、潰瘍面、慢性創面等方面[17-19], 實際應用效果顯著; 但目前尚無魚類膠原蛋白制成的醫療器械在國內使用, 為此, 選用同樣來源于海洋的海藻酸鹽進行對比, 觀察來源于海洋的不同生物醫用材料的具體功效。結果顯示, 魚類膠原蛋白與海藻酸鹽敷料都具有良好的生物相容性, 無任何細胞毒性, 可誘導細胞黏附、爬行和生長, 充分證實其植入創面之后, 可有效誘導成纖維細胞、表皮細胞等創面修復細胞的長入和發揮作用。但兩者在修復過程中, 又有所差異, 魚膠原蛋白因為本身屬于細胞外基質, 有大量與人體相同的成分, 如氨基酸等, 在創面愈合過程中, 魚膠原蛋白可以有效的與新生組織融合在一起, 而海藻酸鹽則無此功效; 另外, 魚膠原蛋白在誘導血管長入、相關細胞長入方面以及膠原蛋白沉積量, 膠原纖維再生、致密性和粗細度等方面與海藻酸鹽具有一定的差異, 魚膠原蛋白表現相對優異; 同時, 從愈合后傷口處表征和組織切片觀察可以發現, 魚膠原蛋白組的疤痕組織要小于海藻酸鹽組, 疤痕組織膠原纖維直徑、致密性等方面也要高于海藻酸鹽組。由此, 可以確認, 來源于魚類的膠原蛋白具有相同甚至優于海藻酸鹽敷料的創面修復能力, 具有作為創面修復敷料的潛力。

研究初步針對魚類膠原蛋白與海藻酸鹽的生物安全性、細胞誘導爬行生長能力、創面修復效果等方面進行了探索, 后期將會進一步探索兩種材料在創面修復過程中的具體機理差異。

4 結論

經過上述研究表明, 魚膠原蛋白和海藻酸鹽都具有良好的生物相容性, 均可以在創面位置塑造良好的傷口愈合環境, 在誘導創面修復方面均表現優異; 但魚膠原蛋白在誘導血管長入、材料在體內與自體組織融合、體內降解、整體修復狀態等方面, 略優于海藻酸鹽。

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Effect of two different marine biomaterials on acute wound repair in rats

WANG Lei1, 2, LV Kang-ning1, LI Wen-jun1, WANG Kai3, JIANG Xiao-rui3, QIN Song1

(1. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Yantai 264003, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Yantai Yuhuangding Hospital, Yantai 264001, China)

To investigate the wound healing effects of marine fish collagen and alginate, we established rat skin acute wound models and evaluated the efficacy of these two materials. We employed commonly used clinical wound dressing methods by implanting both materials into the wounds and observed and evaluated the outcomes using cell biology and pathology techniques. The results indicated that both fish collagen and alginate exhibited excellent biocompatibility and the ability to stimulate wound repair. However, fish collagen outperformed alginate in terms of promoting blood vessel ingrowth, material degradation and fusion, and overall wound healing. These findings demonstrate that both marine biomaterials create a conducive environment for wound healing and effectively facilitate the wound repair process.

wound repair; alginate; collagen; induction

Jan. 22, 2022

[Shandong Province Key Research and Development Plan (Major Scientific and Technological Innovation Project), No. Project 2019JZZY011103]

Q819

A

1000-3096(2023)10-0087-07

10.11759/hykx20220120004

2022-01-22;

2023-09-26

山東省重點研發計劃(重大科技創新工程)(2019JZZY011103)

王蕾(1985—), 男, 山東濰坊人, 博士, 主要從事海洋生物材料研究, E-mail: leiwang@yic.ac.cn; 秦松(1968—),通信作者, 男, 山東曲阜人, 研究員, 主要從事海洋生物高值化利用研究, E-mail: sqin@yic.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)