生物信息學分析IFN-γ誘導銀屑病的關鍵基因及作用機制

楊 麗,李東海

(1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院,廣州 510405;2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院,廣州 510405)

銀屑病是一種慢性的炎癥反應性疾病,被認為具有強烈的遺傳易感性和自身免疫致病特性[1-2],但對于其發病機制尚不清楚?，F代研究認為[3]其與角質形成細胞增殖和免疫細胞浸潤以及真皮血管新生有關。有研究顯示[4]在病毒性肝炎患者皮內注射IFN-γ后,在注射部位出現點滴狀的銀屑病皮損,提示IFN-γ可能與誘導銀屑病皮損相關,但對IFN-γ如何導致銀屑病的相關研究非常少,目前也沒有對于IFN-γ導致銀屑病相關的靶點基因及作用機制的研究。本文基于生物信息學,篩選了IFN-γ導致銀屑病的10個關鍵基因,分別為：ISG15、IFIT1、RSAD2、MX1、IFIT3、IFIT2、IRF7、STAT2、MX2、OASL,根據相關文獻分析這10個基因導致銀屑病可能的作用機制。目前國內外雖已有通過生物信息學或其它的方法分析導致銀屑病的關鍵基因的報道,但對IFIT3、IFIT2、OASL這3個基因與銀屑病的聯系研究較少。由于本文只是通過生物信息學做了理論推導,IFIT3、IFIT2、OASL等3個差異基因是否在銀屑病致病機制中發揮重要作用和如何發揮作用尚需大量的實驗來證明和研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究對象是從GEO數據庫[5]的GPL571平臺下載的GSE32407 mRNA基因芯片數據集。GSE32407數據集的實驗者做這個實驗的目的是為了確定IFN-γ是否誘導了銀屑病皮損。方法：將IFN-γ或安慰劑單次皮內注射于10例健康人的皮膚和10例銀屑病病人的非皮損的皮膚區域內,并在24 h后收集皮膚標本活檢。結果：10例健康人的皮膚和10例銀屑病病人無皮損的皮膚區域內均出現了銀屑病皮損關鍵的病理和組織學特征,而安慰劑注射后均無任何改變。根據本文研究的目的及下載的GSE32407 mRNA基因芯片數據集,對樣本進行基因轉錄譜分析,并對樣本進行分組研究[6],需要特別說明的是,GSE32407數據集的實驗者是在銀屑病病人身上選取的無皮損的皮膚區域,后在注射IFN-γ后出現銀屑病皮損,而注射安慰劑未出現銀屑病皮損,所以在本文中“銀屑病病人”和“銀屑病皮損”是兩個不同的概念,分組情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 篩選DEGS

應用R語言的 “limma”包下載基因矩形文件,將健康人組的10例注射IFN-γ后出現銀屑病皮損的皮膚和10例注射安慰劑后未出現皮損的皮膚進行分析,設定閾值為|Log2(FC)|≥1且P<0.05[7],篩選出差異基因。同理,篩選出銀屑病病人組的差異基因。然后分別將健康人組的差異基因和銀屑病病人組的差異基因的數據分別導入GraphPrism8.0.2,并用X,Y軸數據列表繪制火山圖。同時,利用R語言函數中的“VennDiagram”包繪制韋恩圖。

1.2.2 DEGs的GO分析及KEGG分析

在做前面部分的火山圖和韋恩圖時,是用健康人組和銀屑病病人組(分組情況見表1)分別做的差異基因的研究,是為了證明不管是健康人組還是銀屑病病人組由IFN-γ引起的有皮損的皮膚和由安慰劑引起的無皮損的皮膚相比基因表達都是有差異的。因為本文是為了研究IFN-γ對銀屑病基因表達的影響,所以應該是有銀屑病皮損和無銀屑病皮損的皮膚做對比,但由于健康人和銀屑病病人是兩個群體,所以采用分別分析出兩組有皮損和無皮損皮膚的差異基因,再進行差異基因的匯總和去重?？偟牟町惢蚣词?健康人組的10例注射IFN-γ后出現銀屑病皮損的皮膚和10例注射安慰劑后未出現皮損的皮膚進行分析得來的差異基因)+(銀屑病病人組10例注射IFN-γ后出現銀屑病皮損的皮膚和10例注射安慰劑后未出現皮損的皮膚進行分析得來的差異基因)-(健康人組和銀屑病病人組共同的差異基因)。在做后面的分析研究時(包括GO分析及KEGG分析,PPI網絡構建,熱點基因的篩選),用的差異基因都是總的差異基因。

用EXCEL將健康人組和銀屑病病人組所有篩選出來的DEGs匯總,并將兩組的重復值去掉[8]。再將整理好的Excel表格里的數據導入DAVID在線數據庫[9]( https：//david.ncifcrf.gov/)進行數據富集分析,用R語言函數包"ggplot2"進行KEGG通路分析和GO分析的可視化。P<0.05作為富集分析的篩選條件[10]。其中GO分析分為三類,分別為細胞定位分析(CC,Cellular components)、分子功能分析(MF,Molecular function)、生物學途徑分析(BP,Biological process)[11]。為了展示比較重要的結果,篩選GO分析和KEGG分析的排名前20做可視化分析。

1.2.3 差異基因的 PPI網絡構建

由于差異基因有1 321個,數量過多,根據本研究在匯總的差異基因里再次選取|Log2FC|≥2,P<0.05的差異基因[12]。在String公用數據庫[13]( https：//string-db.org)中,將新得到的397個DEGs置入。在String公用數據庫中下載得到目標基因和靶基因相互作用的數據,進一步探尋這些DEGs之間的相互聯系,置信度設置為超高置信度(置信度>0.9)。利用STRING數據庫得到的數據作為數據集導入Cytoscape[14]3.7.0,得到初步的蛋白質互作網絡。再將DEGs和對應的Log2FC值用Excel表整理后作為屬性表1導入Cytoscape3.7.0,將DEGs和對應的Degree值作為屬性表2導入Cytoscape3.7.0。利用Log2FC的值設置顏色,利用Degree值設置填充圖形大小,映射方式均選擇Continuous Mapping。同時用Mcode[15]插件篩選PPI網絡中選擇最為緊密的集簇,用Cytohubba[16]插件利用Degree值篩選排名前十的熱點基因,并將排名前十的關鍵基因的名字和主要功能以表格的形式列出。

2 結 果

2.1 差異基因的篩選結果

用R語言對GSE32407基因芯片進行分析后,健康人組有皮損和無皮損皮膚的差異基因有323個,上調基因用紅色表示(Log2( FC) ≥1,P<0.05),下調基因用綠色表示(Log2( FC)≤1,P<0.05),上調基因共208個,下調基因共115個,健康人組的差異基因的火山圖見圖1a。銀屑病病人組有皮損和無皮損皮膚的差異基因共有1 307個,其中674個基因表達上調,633個基因表達下調。銀屑病病人組的差異基因的火山圖見圖1b,顏色標注和篩選方法和圖1a相同。韋恩圖紅色代表健康人組有皮損和無皮損皮膚的差異基因個數,藍色代表銀屑病病人組有皮損和無皮損皮膚的差異基因個數,交集代表健康人組和銀屑病病人組共有的差異基因個數。韋恩圖結果顯示健康人組和銀屑病病人組共有的差異基因有309個,總的差異基因為1 321個(總的差異基因的算法見本文1.2.2小節的分析),韋恩圖見圖2。

圖1 有皮損組和無皮損組的DEGs火山圖Fig.1 Volcano map of DEGs between skin lesion group and normal group

圖2 健康人組和銀屑病病人組的DEGs韋恩圖Fig.2 The venn graph of DEGs in Healthy people and patients with psoriasis

2.2 DEGs的GO和KEGG分析結果

做GO分析及KEGG分析、PPI網絡構建、熱點基因的篩選時用的差異基因都是總的差異基因,共1 321個。GO分析和KEGG富集分析圖中X軸代表以10為底矯正后的P值(通過Benjamini-Hochberg 方法糾正錯誤發現率,即FDR值)倒數的對數,X軸數值越大,代表越富集,Y軸顯示具體的富集結果。GO分析得出差異基因主要在含膠原的細胞外基質、質膜外側面、膜微區、細胞膜區、吞噬泡內。差異基因的主要功能是細胞因子及受體結合,Toll樣受體結合,糖胺聚糖結合。主要生物學過程是：病毒防御反應,白細胞遷移,細胞因子產生的正調控,細胞趨化性。KEGG富集分析發現,差異基因主要可能與破骨細胞分化,病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用, NF-kappa B信號通路, TNF信號通路等有關。KEGG/GO分析結果見圖3。

圖3 GO富集分析和KEGG通路富集分析柱狀圖Fig.3 Bar charts of KEGG pathway enrichment analysis ang GO enrichment analysis

2.3 PPI網絡分析結果

PPI網絡共有187個節點、702條邊,為了方便研究,將Degree值小于或等于3的節點和連線去掉,得到94個節點,572條邊,見圖4(顏色表示Log2FC值的排名,顏色越深,表示差異越大,填充大小表示Degree值的排名,尺寸越大,表示基因蛋白連接度越高)。通過Mcode插件尋找出了連接最為緊密的6個關鍵子網,每個子網表示子網內的基因相關程度高,見圖5。通過CytoHubba插件按照Degree為標準,最終篩選10個熱點基因,分別為：ISG15、IFIT1、RSAD2、MX1、IFIT3、IFIT2、IRF7、STAT2、MX2、OASL。它們的功能見表2。

3 討 論

由前面的GO分析和KEGG分析得知差異基因的主要功能是細胞因子及受體結合,Toll樣受體結合,糖胺聚糖結合;主要生物學過程是：病毒防御反應,白細胞遷移,細胞因子產生的正調控,細胞趨化性;KEGG富集分析發現,差異基因主要可能與破骨細胞分化,病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用, NF-kappa B信號通路, TNF信號通路等有關。

圖4 PPI網絡Fig.4 Protein-protein interaction network

圖5 關鍵子網的PPI 網絡圖Fig.5 PPI network of key subnetworks

由PPI可得到10個關鍵基因：ISG15、IFIT1、RSAD2、MX1、IFIT3、IFIT2、IRF7、STAT2、MX2、OASL。這10個基因蛋白由表2可看出絕大部分是抗病毒蛋白。這些熱點基因導致銀屑病的發生可能主要通過四個途徑：①促進角質形成細胞增殖：MX2蛋白[17]參與調控細胞核質運輸及細胞分裂周期。而銀屑病的病理機制[18]與角質形成細胞的細胞周期有關,二者可能具有相關性。另外ISG15[19-21]可以通過被稱為“ISG修飾”的可逆過程與蛋白質底物結合,這些蛋白質結合底物包括MX1,IFIT1,STAT2,結合后會促進角質細胞增殖,形成銀屑病鱗屑;②促進中性粒細胞浸潤：未結合底物的ISG15蛋白[22]可誘導自然殺傷細胞增殖,并且作為嗜中性粒細胞的趨化因子,促進局部微膿腫的產生;③促進樹突細胞成熟：IFN-γ注入后,RSAD2[23]和IRF7高表達會促進樹突細胞成熟,RSAD2被認為是樹突細胞成熟的標志物。成熟的樹突細胞[24]能有效激活初始T細胞,增強分泌細胞因子和抗原提呈的作用。并且成熟的樹突細胞和激活的T細胞在IFN-γ的刺激下又能分泌IFN-γ,形成正反饋[25]。但成熟的樹突細胞在IFN-γ導致銀屑病中發揮的作用的更精確和更系統的機制尚不清楚; ④誘導炎癥反應： IFN-γ注入后,導致IRF7磷酸化,并移位到細胞核誘導IFN-α產生。IFN-α[26]激活髓樣樹突狀細胞,進而產生腫瘤壞死因子和IL-23 ,隨后IL-23 聯合其他炎性細胞因子促進自身免疫性T細胞的活化、增殖、遷移并大量的聚集于表皮,活化的T細胞產生大量的細胞因子,如IFN-γ、IL-17 和IL-22。其中IL-17[27]是中性粒細胞激活和募集導致炎癥的重要介質,可強烈誘導中性粒細胞趨化因子的表達,導致大量中性粒細胞聚集于表皮,從而促進炎癥反應。對于IFIT3、IFIT2、OASL這三個關鍵基因目前的研究較少,它們對于銀屑病皮損發生的相關機制尚不清楚。但IFIT3、IFIT2均是IFIT家族的成員,可能與IFIT1發揮相似的作用。有研究顯示OASL蛋白[28]的異位表達通過cGAS(環磷酸鳥苷-腺苷合成酶)-STING(干擾素刺激蛋白)感應途徑抑制IFN誘導。IFIT3、IFIT2、OASL這三個關鍵基因是否能作為銀屑病致病途徑中關鍵的靶點基因還需要實驗研究和驗證,本文通過生信推導的結果僅做理論參考。

表2 10個樞紐基因的名稱及其功能Table 2 Name and function of 10 pivotal genes

4 結 論

1)IFN-γ誘導銀屑病的10個關鍵差異基因是ISG15、IFIT1、RSAD2、MX1、IFIT3、IFIT2、IRF7、STAT2、MX2、OASL,國內外已有研究對IFIT3、IFIT2、OASL等3個基因與銀屑病的關系關注較少,這3個基因可能成為導致銀屑病的重要基因,但尚需實驗驗證;

2)IFN-γ誘導銀屑病的作用機制可能是通過關鍵差異基因的表達,促進角質形成細胞增殖、樹突狀細胞成熟和中性粒細胞浸潤,導致局部炎癥反應,從而導致銀屑病,但這個推論僅是通過生信分析推導的,因此還需要進一步的實驗驗證;

3)目前銀屑病靶向藥物研究[29]是熱點,本文可為治療銀屑病的靶向藥物研究提供一定的理論依據。另外,在國內外銀屑病動物模型[30]用咪喹莫特誘導的較多,但很少用IFN-γ誘導銀屑病制作動物模型,可能在將來通過更多的實驗研究驗證后可應用于誘導銀屑病動物模型。