家族性雙側大結節性腎上腺增生癥生物標志物的生信分析

湯 鑫,朱 焱*,沈 毅,司曉云,何萬婭,聶 穎

(1.貴州醫科大學 公共衛生與健康學院,貴陽550025;2.貴州醫科大學附屬醫院 心內科,貴陽 550004)

庫欣綜合征(Cushing’s syndrome, CS)是由于長期暴露于升高的內源性皮質醇所致的一種臨床綜合征[1],且長期的糖皮質激素過量會導致許多合并癥,損害生活質量并增加死亡率[2]。CS主要分為促腎上腺皮質激素(Adrenocorticotrophic hormone,ACTH)依賴性和非依賴性兩大類,前者發生的主要原因是由垂體腺瘤(庫欣病)或異位ACTH依賴性綜合征,如小細胞肺癌、胸腺類癌等分泌過量的ACTH,刺激雙側腎上腺增生并分泌過量的皮質醇所致;后者是由于腎上腺皮質腺瘤、腺癌或結節性增生自主性地分泌過量皮質醇所致[3]。雙側大結節性腎上腺皮質增生癥(Bilateral macronodular adrenal hyperplasia,BMAH)或ACTH 非依賴性大結節性腎上腺皮質增生癥(ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia,AIMAH)由Kirschner等于1964年首次描述[4],是一種罕見的臨床疾病,其特征是雙側腎上腺皮質中存在多個良性結節[5]。據報道,BMAH約占中國庫欣綜合征患者所有內源性病因的6.2%[6],其病因仍不明確, 既往認為其是由ACTH依賴性逐漸轉變為ACTH非依賴性,但近年的研究表明其可由ACTH以外因素, 如精氨酸加壓素(Arginine vasopressin,AVP)、抑胃肽(Gastric inhibitory peptide,GIP)、兒茶酚胺(Catecholamines,CA)等受體的異常表達引起,最終使得腎上腺細胞增生[7]。由于BMAH發展緩慢,皮質醇增多癥和臨床CS隱匿發展,導致亞臨床庫欣綜合征的比例很高[8],CS本身的隱匿發作也可能導致診斷延遲。此外,BMAH與遺傳有著密切的聯系[9],對家族性形式和疾病雙側特征的描述表明,這些疾病是遺傳決定的,這已在近70%的原發性色素微結節性腎上腺和25%的原發性雙側大結節性腎上腺皮質增生癥病例中得到證實[10],受影響患者的相關家庭成員有發生BMAH的風險。BMAH患者在診斷前有長期暴露于皮質醇過量的有害組織分解代謝作用的風險,臨床上迫切需要早期的診斷和治療,然而目前該疾病缺乏可靠的診斷和治療生物標志物。因此本研究結合生物信息學分析,探索家族性雙側大結節性腎上腺皮質增生癥的潛在生物標志物,為該疾病的臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據獲取與處理

從GEO數據庫 (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載了Gagliardi L等上傳的關于家族性的BMAH的微陣列表達譜數據集GSE171558和Almeida MQ等上傳的關于AIMAH的表達數據集GSE25031。GSE171558數據集基于GPL6244 Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array平臺進行分析,作為訓練數據集。它包含8個樣本,包括三個受家族影響的6個樣本和2個正常對照。GSE25031數據集基于GPL6255 Illumina humanRef-8 v2.0 expression beadchip平臺進行分析,作為驗證數據集。它包括7個樣本和3個正常組織。兩個數據集在上傳時已對數據進行歸一化處理。除此之外,本研究去除了不匹配基因符號和重復基因符號的探針。本研究的數據可從GEO數據庫免費下載,因此不需要患者的倫理批準和知情同意。

1.2 差異表達基因(DEGs)的鑒定

基于DEGs的納入標準P<0.05和log2|FC|>1,通過R軟件中的“limma”[11]包來識別數據集GSE171558的差異表達基因。本研究提供了DEGs的火山圖和熱圖?；鹕綀D和熱圖通過微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn)繪制,這是一個免費的在線數據分析和可視化平臺。

1.3 DEGs的功能富集分析

使用DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對DEGs進行富集分析。該分析包括基因本體論(Gene ontology,GO)術語,即生物過程(Biological process,BP)、細胞成分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF),主要用于預測蛋白質功能[12]和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)途徑,主要用于構建分子相互作用、反應和關系網絡[13]。選擇P<0.05 和富集基因計數 ≥ 5作為統計顯著性的標準,并進行可視化。如果詞條超過十個,則選擇前十個富集基因計數較多的詞條可視化。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡分析

使用在線數據庫STRING(https：//string-db.org/)進行了蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網絡分析,以評估 DEGs 的蛋白質-蛋白質相互作用。將 DEGs映射到 PPI 網絡上,并設置交互得分>0.9作為閾值。此外,使用Cytoscape v3.9.1軟件中的插件cytoHubba分別通過三種算法(MCC、MNC和Degree)篩選出高度值最高的前10個基因,并通過維恩圖可視化三種算法共同的關鍵基因。維恩圖是使用Venny 2.1 ( Venny (csic.es)) 繪制的。

1.5 數據集驗證hub基因

數據集 GSE25031包含7個樣本和3個健康樣本,作為驗證集以驗證hub基因的表達。P<0.05被認為具有統計學意義,具有統計學意義的基因作為關鍵的生物標志物,對BMAH的診斷和治療具有重要價值。

1.6 基因集富集分析(GSEA)

根據hub基因表達的中位數,將BMAH樣本分為高表達組和低表達組,將處理后的差異倍數值進行從大到小排序, 用來表示基因在兩組間的表達量變化趨勢,以更準確地確定每個關鍵生物標志物的功能。

1.7 TF-miRNA共調控網絡和蛋白質-化合物相互作用

NetworkAnalyst[14](https：//www.networkanalyst.ca/)用于構建關鍵生物標志物的 TF-miRNA共調控網絡,調控相互作用信息是從RegNetwork存儲庫中收集的,并識別與關鍵生物標志物相互作用的化合物。

2 結 果

2.1 DEGs的識別

基于DEGs∣log2FC|>1,P<0.05的納入標準,數據集GSE171558共鑒定出336個DEGs,其中上調基因147個,下調基因189個?；鹕綀D和熱圖展示了DEGs的結果(見圖1)。

圖1 差異表達基因結果Fig.1 Results of differentially expressed genes

2.2 DEGs的功能和通路富集

使用在線工具 DAVID 6.8對選取的336個基因基于P< 0.05和富集基因計數≥5的納入標準進行GO和KEGG富集分析,研究與BMAH相關的生物學功能。富集分析結果如圖2所示。GO富集分析(見圖2a)結果中,生物過程(BP)分析表明,這些基因與細胞粘附過程、細胞增殖的正調節過程、RNA加工過程、多細胞生物發育過程、細胞遷移的正向調節過程、軸突引導等過程有關。細胞成分(CC)與質膜、膜的組成部分、細胞外區、細胞外外泌體、細胞表面、神經元細胞體、軸突等密切相關,而分子功能(MF)分析則展示了與鈣離子結合、肌動蛋白絲結合、鈣調素結合、ATP結合、碳水化合物結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性的相關性。KEGG富集分析(見圖2b)顯示鈣信號通路、PI3K-Akt 信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、擴張型心肌病、cAMP信號通路、肥厚型心肌病、醛固酮合成和分泌、cGMP-PKG信號通路、ECM-受體相互作用、胰腺分泌物等富集明顯。

圖2 GO和KEGG富集分析結果(p<0.05)Fig.2 Results of GO and KEGG enrichment analysis (p<0.05)

2.3 DEGs的PPI網絡分析

根據STRING在線數據庫,基于網絡的交互得分> 0.9,得到一個有297個節點和73條邊的PPI網絡(見圖3)。通過Cytoscape中的Cytohubba插件,采用MCC(見圖4a)、MNC(見圖4b)和Degree(見圖4c)三種算法分別篩選出前10個基因,并取交集(見圖4d),得到五個共同的關鍵基因,即三個上調基因多功能蛋白聚糖(Versican,VCAN)、小核糖核蛋白多肽E(Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide E,SNRPE)、LSM3(LSM3同源物,U6小核RNA和mRNA降解相關)和兩個下調基因雙糖鏈蛋白聚糖(Biglycan,BGN)、蛋白磷酸酶2支架亞基Aalpha(Protein phosphatase 2 scaffold subunit Aalpha,PPP2R1A),視為BMAH的關鍵基因。

圖4 cytoHubba插件中三種拓撲分析方法篩選出的關鍵基因Fig.4 Key genes screened by three topological analysis methods in the cytoHubba plugin

2.4 驗證hub基因

在GSE25031數據集中獲得關鍵基因在腎上腺結節與正常腎上腺組織中的表達量,并進行統計分析,結果顯示SNRPE、PPP2R1A和LSM3在疾病與正常組中的表達量均無顯著差異(p>0.05)。而VCAN和BGN在BMAH和對照組中表達量的差異有統計學意義(p<0.05),可以認為與正常組相比,VCAN在BMAH中表達顯著升高,BGN在BMAH中表達顯著降低,故以VCAN和BGN作為BMAH的關鍵生物標志物(見圖5)。

圖5 關鍵基因的驗證Fig.5 Validation of key genes

2.5 基因集富集分析(GSEA)

對VCAN和BGN做進一步分析以更準確的了解其功能。GSEA結果顯示,VCAN主要參與丁酸代謝、ECM-受體相互作用、半乳糖代謝、蛋白質消化吸收、類固醇生物合成、異體移植排斥、哮喘、移植物抗宿主病、系統性紅斑狼瘡、I型糖尿病(見圖6a)。BGN與ABC轉運蛋白、蛋白質消化吸收、核糖體、剪接體、各種類型的N-聚糖生物合成、集合管酸分泌、皮質醇的合成和分泌、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導、類固醇生物合成、血管內皮生長因子信號通路密切相關(見圖6b)。

2.6 TF-miRNA共調控網絡和蛋白質-化合物相互作用

TF-miRNA共調控網絡顯示了VCAN和BGN與TF基因和miRNA的相互作用(見圖7)。VCAN有16個TF基因和26個miRNA調控,BGN受SMAD4 TF基因和 has-miR-647 miRNA的共同調控。 此外,我們發現有16個化合物是這兩個關鍵生物標志物相互作用的共同化合物(見圖 8,表1)。 由于這些化合物是針對這兩個關鍵生物標志物檢測到的,因此它們與BMAH的發生和發展有重要聯系。

3 討 論

本研究共鑒定了336個DEGs,并進行生物信息學分析,探索家族性BMAH的分子生物學功能和途徑,以找到影響BMAH發生發展的生物標志物。GO富集分析表明大部分DEGs主要與細胞粘附、細胞增殖、RNA加工過程、多細胞生物發育過程、細胞遷移過程、軸突引導等生物過程有關。因此做出推測,即這些基因可能通過這些過程在家族性BMAH中發揮關鍵作用。之前的研究表明,細胞增殖以及與細胞粘附相關的其他體細胞遺傳事件也發生在各種結節中[15-16]。另一方面,本研究發現這336個靶基因大部分富集在鈣信號通路、PI3K-Akt 信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、擴張型心肌病、肥厚型心肌病、cAMP信號通路、醛固酮合成和分泌、cGMP-PKG信號通路等相關信號通路中。最近有研究表明環磷酸腺苷單磷酸蛋白(cAMP)激酶A信號傳導,被發現在庫欣綜合征的良性腎上腺皮質腫瘤或增生的發展中起主要作用[17-18],而且改變細胞內鈣信號傳導與良性醛固酮產生腫瘤或增生的發展也有關[19]。然而,在雙側腎上腺皮質增生患者中,雙側腎上腺切除術可誘發明確的腎上腺皮質功能不全,有研究發現腎上腺功能不全也會使患者因心血管疾病和感染而增加發病率和死亡率[20-21]。也有研究表明接受腎上腺切除術的亞臨床 CS 患者改善了心血管危險因素,尤其是高血壓和糖尿病[22]。此外,特發性雙側腎上腺皮質增生是原發性醛固酮增多癥的最常見原因[23],可見醛固酮合成和分泌與家族性BMAH也存在密切聯系。另外,PI3K-Akt 信號通路和cGMP-PKG信號通路目前沒有相關研究表明其與BMAH的發生有關,因此需要做進一步研究,這可能是一種新的臨床機制。

圖7 TF-miRNA相互作用的網絡Fig.7 network of TF-miRNAs interactions

圖8 NetworkAnalyst的蛋白質-化學相互作用Fig.8 Protein-chemical Interactions by NetworkAnalyst

此外,對DEGs進行了PPI網絡分析,確定了5個hub基因(VCAN、SNRPE、BGN、PPP2R1A和LSM3),并經GSE25031數據集驗證,最終將基因表達差異具有統計學意義的VCAN和BGN視為家族性BMAH的潛在生物標志物,有研究也使用了與本文相同的數據集,因此本研究的結果具有一定的可靠性[24]。多功能蛋白聚糖(Versican,VCAN)是一種大型聚集的硫酸軟骨素蛋白多糖,屬于聚集蛋白聚糖/versican蛋白多糖家族,是細胞外基質的重要組成部分[25],參與細胞粘附、增殖、遷移、血管生成和組織形態發生和維持[26-28]。VCAN已被證明具有促進腫瘤發展的潛力[29-30],其能夠激活EGFR-PI3K-AKT途徑促進肝細胞癌的增殖和轉移[31],參與骨髓瘤發病機制[32],也能夠激活NF-kB信號通路促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲[33],與許多不同類型癌癥的不良結局密切相關[34]。這與我們研究所得結果類似,即VCAN的高表達與BMAH的發生呈正相關。進一步的GSEA結果分析顯示,VCAN主要與丁酸代謝、ECM-受體相互作用、半乳糖代謝、蛋白質消化吸收和類固醇生物合成等有關。然而目前沒有關于丁酸、半乳糖代謝和ECM-受體相互作用與BMAH的相關報道,這些途徑可能是治療BMAH新的潛在機制,可作進一步研究。但有研究指出調節類固醇的分泌與BMAH的發生發展密不可分,類固醇生物合成降低是原發性雙側大結節性腎上腺皮質增生癥的一大特征[35]。此外,在幾個AIMAH家族病例中,特定的異常激素受體在受影響成員的腎上腺中起作用,而一種或幾種G蛋白偶聯受體的異常腎上腺表達和功能可導致細胞增殖和類固醇生成的異常調節[15]。在本研究中VCAN的高表達會增加類固醇的分泌,由此可推測出抑制VCAN的表達能夠減少類固醇的分泌,從而參與疾病的治療?？傊?VCAN參與多種致癌作用機制,因此,可進一步研究其在家族性BMAH中的可能機制。

雙糖鏈蛋白聚糖(Biglycan,BGN)是一種I類分子的富含亮氨酸的小蛋白聚糖 (SLRP),在軟骨和骨骼中都存在,在維持結構和體內平衡方面發揮著重要作用[36]。BGN在腫瘤的生物發生和發展中也發揮重要作用,并且在各種癌癥中發現了BGN的異常表達[37]。之前的研究發現BGN在人平滑肌肉瘤細胞系SK-UT-1中的表達與cAMP依賴性及蛋白激酶A介導有關[38]。除此之外,也發現細胞內cAMP水平升高會增加骨細胞中BGN啟動子的轉錄,并首次暗示cAMP/蛋白激酶A信號轉導通路參與BGN基因表達的調節[39]。而異常的cAMP/蛋白激酶A信號傳導在腫瘤發生中起核心作用,其是腎上腺皮質皮質中皮質醇分泌的主要激活因子,與庫欣綜合征和腎上腺皮質腫瘤密切相關[40],可見,BGN在AIMAH的發病機制中發揮重要的作用。GSEA結果分析顯示,BGN還與ABC轉運蛋白、蛋白質消化吸收、核糖體、剪接體、各種類型的N-聚糖生物合成、皮質醇的合成和分泌、類固醇生物合成和血管內皮生長因子信號通路等密切相關。BMAH的發生與皮質醇的分泌有著更加密切的聯系,皮質醇合成抑制劑能夠參與該疾病的治療[41]。另外,剪接體能夠引導真核細胞中的前mRNA剪接,而之前有研究表明,剪接體可能構成了癌癥中有吸引力的治療靶點[42]?？傊?BGN在家族性BMAH的發病機制中發揮重要的作用。

4 結 論

綜上所述,本研究采用生物信息學方法對數據集進行分析,在家族性BMAH和正常組之間篩選出336個DEGs,進一步篩選出5個關鍵基因并進行驗證,最終確定了VCAN和BGN基因的表達水平在BMAH和正常組之間存在顯著差異,以此鑒定為家族性雙側大結節性腎上腺皮質增生癥的潛在生物標志物,為臨床診斷和治療提供參考。但本研究存在一定局限性,即目前尚無相關實驗研究這些基因在家族性BMAH中的具體作用機制。因此,需要通過實驗進一步闡明這些基因在家族性BMAH中的功能作用。