DICER1 rs13078和RAN rs3803012基因多態性與妊娠期高血壓疾病發病風險的病例對照研究

祝迪 張麗巖 岑立微

妊娠期高血壓疾病是妊娠期間出現血壓升高的一組疾病,可引起彌散性血管內凝血、胎盤早剝、胎兒宮內生長受限等不良妊娠結局[1]。該病發生于婦女妊娠 20 周以后,一般在產后 12 周恢復,是妊娠期女性特有的疾病。國外的發病率在7%以上,而中國的發病率高達9%以上,是嚴重威脅孕婦和圍生兒發病及死亡的主要因素之一[2]。該病是由于多種因素引起的復雜疾病,發病與遺傳易感性、免疫調節、氧化應激和胎盤的淺表植入等有關,除此也與年齡、家族妊娠期高血壓疾病史等密切相關[3]。盡管對該病進行了大量的研究,但潛在的機制尚不明確,目前結果只傾向自身遺傳和外界環境互相作用導致了妊娠期高血壓疾病的發生[4]。DICER基因的多態性可能改變機體器官生物學功能,并在各種疾病的發展中起著至關重要的作用,包括自發性流產和中風等[5]。RAN 蛋白調節多種細胞過程,在妊娠婦女血漿中RAN蛋白表達量升高,RAN 蛋白可能在妊娠期高血壓疾病的發展中起著一定的作用[6]?；谏鲜?本研究選取DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點,通過檢測妊娠期高血壓疾病患者和分娩正常的孕婦外周血中DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點的基因分型,探討其與妊娠期高血壓疾病的相關性。

對象與方法

1. 研究對象:選取2021年6月至2022年3月在本院住院單胎妊娠且診斷為妊娠期高血壓疾病的患者321例作為研究對象,其中妊娠期高血壓患者147例(妊娠期高血壓組),子癇前期患者174例(子癇前期組)。同時選取同期在本院分娩正常的孕婦180例作為對照組。納入標準:(1)年齡≥18 歲;(2)自然受孕;(3)單胎妊娠;(4)新生兒存活,無畸形。(5)病例組依據《婦產科學》第九版妊娠期高血壓診斷標準納入,妊娠期高血壓患者定義為收縮壓≥140 mmHg,舒張壓≥90 mmHg,妊娠 20 周后,尿蛋白檢測為陰性。子癇前期患者定義為收縮壓≥140 mmHg,舒張壓≥90 mmHg,24 h尿蛋白≥0.3 g,血小板減少或者肝腎功能受損等,但不包括合并慢性高血壓的患者。排除標準:(1)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病的患者;(2)應用抗血小板藥物干擾的患者;(3)合并急慢性肝腎功能疾病的患者;(4)近期發生急性、慢性感染者;(5)妊娠不足28周分娩的患者。本研究通過本醫院倫理委員會審批,編號:倫審(2021)-19號。

2.研究方法:

(1)臨床資料收集。收集研究對象的相關臨床資料,包括年齡、孕周、收縮壓、舒張壓、胎兒性別、糖尿病史、妊娠高血壓病史等。

(2)樣本采集。妊娠20周后,無菌條件下采集研究對象的外周血樣本5 mL,置于EDTA抗凝管中,4 ℃冰箱保存,24 h后進行DNA提取。

(3)聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)基因測定。使用小量全血基因組DNA提取試劑盒(瑞士Roche公司)提取外周血的DNA,采用UV-260分光光度計(日本SHIMADZU公司)檢測DNA 純度和濃度,采用PCR-RFLP技術對基因進行分型檢測。DICER1基因 rs13078位點的正向引物:5′-GTGCTCTGAATCACTAATGGT-3′,反向引物:5′-TGTGACCGTAGTAGCATGGAATTC-3′,RAN基因rs3803012位點的正向引物:5′-GTATCGCTAATCG TCTACGGGT-3′,反向引物:5′-TATGGTCATCGTC AGCATCGTGTC-3′。PCR反應體系為:2 μL的 dNTP混合物,正向引物和反向引物各1 μL,2 μL 10xBuffer,1.0 μL DNA,0.3 μL的TaqDNA聚合,12.7μL的三蒸水。PCR反應條件為95 ℃ 15 min,95 ℃ 15 min,72 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,終止反應,循環35次。使用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒切膠純化對PCR產物。最后采用測序儀對基因進行測序分型。

結果

1.三組患者的臨床資料對比:三組孕婦分娩的胎兒性別比較,差異無統計學意義(P>0.05);妊娠期高血壓組和子癇前期組的年齡顯著高于對照組(P<0.05),妊娠期高血壓組和子癇前期組的分娩孕周低于對照組(P<0.05),收縮壓和舒張壓高于對照組,糖尿病史和家族妊娠期高血壓疾病史占比明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 三組患者的臨床資料對比分析

2. DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點多態性分析:對照組、妊娠期高血壓組和子癇前期組DICER1 rs13078位點有T和A兩種基因,TT、TA、AA三種基因型,見圖1A;對照組、妊娠期高血壓組和子癇前期組RAN rs3803012位點有A和G兩種基因,AA、AG、GG三種基因型,見圖1B。

注:圖1A:1、3、4為rs13078位點TT;2為rs13078位點AA;5為TA;圖1B:1、4、5為rs3803012位點AA;2為rs3803012位點GG;3為rs3803012位點AG

3. Hardy-Weinberg平衡檢驗:對照組、妊娠期高血壓組和子癇前期組DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點基因型的實際值和預測值均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P>0.05),說明三組樣本均具有較好的代表性,見表2和表3。

表2 DICER1 rs13078位點基因型 Hardy-weinberg平衡檢驗

表3 RAN rs3803012基因型 Hardy-weinberg平衡檢驗

4. DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點的基因分布情況:對照組、妊娠期高血壓組和子癇前期組DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點基因型基因分布情況比較,差異具有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點的基因分布頻率

5. DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點與妊娠期高血壓疾病發病的相關性:以是否發生妊娠期高血壓和子癇前期為因變量,以DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點不同基因型為自變量,校正其他混雜因素,包括年齡、孕周、收縮壓、舒張壓和糖尿病史和家族妊娠期高血壓疾病史,DICER1 rs13078 T

表5 DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點與子癇前期發生風險的Logistic 回歸分析

表6 DICER1 rs13078和RAN rs3803012位點與妊娠期高血壓發生風險的Logistic 回歸分析

討論

妊娠期高血壓疾病是一種妊娠期疾病,會導致孕產婦胎盤早剝、產后出血、心腦血管疾病發生以及多種臟器損傷,而且也容易對胎兒和新生兒的生長發育產生一定的影響[7]。妊娠期高血壓疾病主要表現為高血壓、尿蛋白和水腫,嚴重的患者會出現昏迷、抽搐或者是死亡,對分娩時機、分娩方式、孕產婦和胎兒產生巨大的影響[8]。隨著人類基因組計劃的發展,妊娠期高血壓疾病相關基因的定位和識別已成為研究熱點。許多研究表明,妊娠期高血壓疾病病因復雜,是多因素共同作用的結果,有較強的遺傳傾向,基因變異可能是其發病的重要因素之一[9]。

近年大量研究發現 miRNAs 的異常表達與妊娠期高血壓疾病相關,異常表達的 miRNA作用于靶基因,抑制或促進靶基因的正常功能,參與滋養細胞行為的調節。DICER和RAN 為miRNA生成的主要關鍵酶,參與miRNA 轉錄、剪切、加工、轉運等過程,DICER和RAN質和量發生改變直接影響成熟 miRNA 水平、結構及功能變化[10]。而且DICER和RAN 基因多態性可能通過影響 miRNA 的生成及成熟。DICER酶屬于核糖核酸內切酶-III家族成員,包括DICER 1 和DICER 2 兩種基因,進而影響下游很多靶基因的表達[11]。相關研究表明,DICER 1基因在不同種類的惡性腫瘤中均出現異常表達,并且還與卵巢癌的預后相關[12]。DICER的多態性可能改變其生物學功能,并在各種疾病的發展中發揮重要作用。新的研究表明,在人胎盤中敲除DICER1可顯著增強細胞滋養層增殖,這是導致子癇前期發生的主要因素[13]。本研究結果發現,DICER1 rs13078位點基因型基因分布在對照組、妊娠期高血壓組和子癇前期組中具有明顯差異,而且DICER1 rs13078 T

RAN也是 miRNA 生成的主要關鍵酶[16]。RAN參與脊椎動物卵母細胞的成熟,減少卵細胞染色體異常的概率。RAN 為合成小分子G蛋白,已被證實參與胎盤的功能調節[17]。在妊娠 8～28 周的孕婦血漿中發現了大量的 RAN 蛋白,這支持了RAN 蛋白在妊娠期高血壓疾病發展中的作用。相關研究報道,RAN rs14035 T 等位基因和 CT+TT 基因型在結直腸癌和胃癌中均為保護因素,在復發流產患者中得到類似的結論[18]。本研究得到的結果與上述的結論相反,RAN rs3803012位點基因型基因分布在對照組、妊娠期高血壓組和子癇前期組中具有顯著差異,且RAN rs3803012 A

綜上所述,DICER1 rs13078 T