新生兒缺氧缺血性腦病治療研究進展

肖湘 陳欣萌 曾琳 韓彤妍

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是全球范圍內新生兒腦病的最常見類型,也是新生兒致殘、致死的重要原因。2021年,英國報道HIE發病率2.96‰[1],而發展中國家發病率為26‰[2]。幸存新生兒不良結局風險可高達 50%[3],最常見的是腦癱、癲癇、感覺障礙、運動障礙等。HIE的高發病率、高死亡率和高致殘率給家庭帶來了巨大的經濟和精神負擔,也為全球公共衛生事業帶來了挑戰,因此,探索新的治療策略,減少死亡率,改善不良預后成為迫切的臨床需求。本文對亞低溫治療、促紅細胞生成素、褪黑素及其他處于探索階段的治療方案進行綜述。

一、亞低溫治療

亞低溫治療(hypothermia treatment,HT)的神經保護作用涉及HIE腦損傷的多個過程,其核心在于抗炎、抗凋亡以及抗氧化應激效應。低溫可以使興奮性氨基酸釋放減少、谷氨酸反向轉運體表達下調、一氧化氮和自由基產生受抑以及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體激活減少;同時低溫抑制乙酰輔酶A增加細胞的乙?；?抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase酶)和小膠質細胞活性,發揮抗興奮性毒性作用,減少炎癥因子表達,增加抗炎細胞因子的合成,從而發揮神經保護作用。

1.臨床前證據:早產兒因腦特異性成熟障礙在缺氧缺血損傷(hypoxic-ischemic injury,HI)中表現出更復雜的病理生理過程,有必要對治療的有效性和安全性進行探討。Bennet等人在HI模型中進行持續72h的HT,結果顯示神經元和未成熟少突膠質細胞損失顯著減少、腦白質和腦灰質的損傷減輕,證實了亞低溫治療在早產兒中的生物學合理性[4]。

2.臨床證據:早產兒HIE亞低溫治療已經開展了小范圍的臨床研究。Rao等人的研究發現,早產兒HT治療后死亡率和不良反應發生率更高,MRI結果顯示腦損傷更嚴重,但研究中患兒腦損傷和多器官損傷程度較重可能導致了研究結局的差異[5]。Hanne等人隨后發現晚期早產兒HT治療后,中度HIE患兒的智力和精神運動發育與年齡相符,證實了早產兒HIE應用HT的有效性[6]。另一項隨機對照研究于2022年12月底完成,尚未發布結果[NCT:01793129]。

3.安全性:亞低溫治療安全性良好,治療期間具有在良性生理效應,如竇性心動過緩、輕度血小板減少癥和頭皮水腫,但Herrera等人的研究發現早產HIE患兒HT治療后具有不良結局發生風險,如死亡或中重度神經發育障礙、凝血障礙、低血壓、持續肺動脈高壓、血小板減少、顱內出血等[7]。因此,早產兒亞低溫治療可能存在不同的安全性特征,需要重新評估。這一問題也許能在國際兒童和人類健康發展中心牽頭的研究中得到解答[NCT:01793129]。

二、促紅細胞生成素

促紅細胞生成素(erythropoietin,Epo)是胎兒肝臟中合成的內源性蛋白質,與刺激紅細胞生成、抗炎、抗興奮性、抗氧化和抗凋亡作用以及促神經發生和血管生成密切相關。Epo受體在中樞神經系統的多種細胞類型中廣泛表達。當機體經歷HI時,血腦屏障通透性增加,Epo及其受體表達上調,腦脊液中Epo濃度增加,從而減少細胞凋亡、減輕興奮性毒性損傷,最終導致細胞增殖、生存和分化的改變。

1.臨床前證據:早期的動物實驗為Epo的神經保護作用提供了一致的有利證據。Epo的神經保護高度依賴于HI后開始治療的時間,窒息后早期(30分鐘)開啟Epo治療能顯著減少組織學損傷、改善電生理及促腦血管恢復[8]。但臨床中早期開始治療有時很難做到,Oorshcot等人進一步探索了延遲給藥的神經保護作用,HI后48 h給予Epo治療仍能改善神經發育預后[9]。隨后Pang等人在新生仔豬中證實HT聯合Epo治療的神經保護作用,表現為25～30 h時振幅整合腦電圖恢復更快,促進少突膠質細胞存活方面最有效,這些獲益可能與最終的運動和認知水平改善相關[10]。

2.臨床證據: Zhu等人基于有益的理論基礎和大量臨床前試驗開展了第一項臨床研究,證實Epo治療對于中度HIE患兒長期預后的改善作用[11]。Malla等人進一步對比了5劑重組Epo治療(隔日給藥)與生理鹽水注射的效果,治療組死亡率、殘疾率及腦癱發生風險更低,MRI顯示的神經系統異常更少[12]。關于聯合治療作用及機制的探索,Wang等人[13]在34名治療組新生兒應用Epo、維生素C聯合HT治療,對照組接受常規治療加維生素C,結果發現治療組氧化應激水平更低,抗氧化酶和抗凋亡因子水平較高,該研究支持低溫聯合Epo的神經保護作用并初步證實其具體機制,包括抑制細胞凋亡、減少氧自由基和增強抗氧化能力。隨后III期早產Epo神經保護試驗和大劑量促紅細胞生成素治療窒息和腦病試驗均報道,聯合HT和Epo治療不能降低神經發育障礙或2～3歲死亡的風險[14,15]。這些結局的差異提示我們謹慎解讀臨床前研究以便更好的進行臨床轉化,HT和Epo的聯合治療方面有待進一步探索。

3.劑量、藥代動力學和安全性:目前對于Epo給藥的最佳劑量、給藥時間和間隔時間尚無一致的結論。臨床前研究發現重復給藥的效用更顯著,且皮下注射3劑5 000 U/kg的Epo顯示出最佳神經保護作用[16]。1 000 U/kg靜脈注射Epo的最大血藥濃度和曲線下面積與臨床前試驗中報道的神經保護水平最相似,曲線下面積為(131 054±17 083 U * h/L)和最大血藥濃度(13 780±2 674 U/L),該劑量下的半衰期為15.0 h[17]。

成人Epo治療的主要不良反應包活高血壓、血栓、紅細胞增多癥、癲癇、死亡,尚未在新生兒中被報道。但最近HEAL試驗提出了質疑,研究指出治療組嬰兒更有可能至少發生一次不良事件,具體原因尚不明確,但這一安全性問題的研究需要引起關注。

三、褪黑素

褪黑素(melatonin,Mel)是松果體分泌的內源性吲哚胺,具有調節晝夜節律、協調能量代謝、保護免受氧化應激和增強免疫的功能。HIE治療中,褪黑素限制潛伏期損傷,減少與二次能量衰竭相關的神經元死亡,減輕第三階段的持續腦損傷,具有獨特的神經保護作用。通過受體介導的信號轉導及非受體途徑,Mel直接中和活性氧和活性氮、刺激抗氧化酶活性,間接調節細胞mRNA濃度,發揮抗興奮性毒性作用。在免疫調節中,Mel減少促炎分子形成,防止磷脂酶A2、脂氧合酶和環氧化酶的炎癥衍生激活、減少白細胞的募集。Mel還具有抗凋亡活性,能顯著減少促凋亡物質產生,維持線粒體通透性,增強多種細胞拯救途徑。

1.臨床前證據:新生兒生后的短暫褪黑素缺乏期,為生命早期褪黑素補充治療提供了理論基礎。小鼠HI模型中應用褪黑素治療后認知表現、學習和記憶、運動功能和協調性明顯改善[18]。Aridas JDS等人[19]在新生羔羊模型中每2 h靜脈注射5 mg Mel聯合HT,發現聯合治療在腦結構、功能和代謝指標上獲益大于Mel或HT單獨治療。一篇關于足月、近足月動物模型研究的Meta分析中,作者通過分層亞組分析發現褪黑素作為單一藥物或HT的輔助治療都具有強大的神經保護作用[20]。上述研究支持了Mel的廣泛地區適用性,在HT治療未能廣泛開展地區,單獨應用也能改善缺氧缺血后的動物模型的神經行為結局。

2.臨床證據:褪黑素治療在臨床研究中顯示出良好的神經保護作用。Ahmad等人報道經腸道單次給予10 mg褪黑素能提高新生兒28日齡的存活率[21]。Antonio等人進一步探索了聯合HT和Mel治療的作用,發現患兒18月齡時Bayley III測試的認知領域表現更好[22],早產兒生后第一天給予口服Mel治療顯示出Mel對脂質過氧化的保護作用[23],48 h后新生兒氧化應激損傷的標志物水平顯著下降。Ahmed進行的meta分析進一步支持褪黑素的神經保護作用[24],并且,作者強調目前研究質量較低,數量有限,未來迫切需要大規模、設計合理、高質量的多中心臨床試驗明確褪黑素在HIE中的神經保護作用。

3.劑量、藥代動力學和安全性:褪黑素的神經保護作用具有劑量依賴性和時間關鍵性,動物實驗的經驗說明Mel在生后3 h內應用達到最佳治療水平,約為15～30 mg/L。但具體轉化至HIE治療的臨床實踐中仍然需要進一步進行藥代動力學研究及藥物水平監測,以確保生物利用度并了解個體間差異和HT的影響。

褪黑素在新生兒群體中具有很好的安全性,副作用僅限于其催眠和鎮靜特性。在新生兒呼吸窘迫綜合征的治療中,褪黑素在24 h內高達70 mg/kg,短期內未顯示出嚴重不良反應。

四、稀有氣體療法

醫療氣體目前越來越多的應用于疾病治療的探索中。氬氣、氙氣等稀有氣體通過拮抗 NMDA 受體、激活轉錄因子核因子-紅細胞衍生2等多種途徑發揮強大的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用[25,26]。在進一步的臨床前實驗中,氙氣、氬氣在HIE、缺血性卒中、創傷性腦損傷、神經退行性疾病等的多種疾病模型中均被證實其神經保護作用。在HIE治療領域,稀有氣體與HT的聯合治療顯示出巨大的轉化潛力。

1.氙氣:氙氣(xenon,Xe)是一種惰性氣體,早期在麻醉領域中應用,近年來發現Xe在神經保護方面的巨大潛力。Xe非競爭性抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體,降低興奮性毒性,減少急性細胞損傷,誘導激活抗凋亡因子減少細胞凋亡。并且Xe作為三磷酸腺苷敏感性鉀通道活化劑在神經保護方面也發揮了一定的作用。

(1)臨床前證據:在大鼠模型中評估了Xe治療對相關基因表達產生的影響,受損腦組織中炎癥基因表達下降,健康腦組織中應激基因表達受到誘導,可能有助于減輕損傷,激活腦組織早期代償過程[27],隨后的研究中發現這種神經保護作用具有濃度依賴性。在聯合應用中,Xe與HT聯合在體內模型中表現出神經保護作用,并且延遲治療同樣能改善長期功能(8～10周)。

(2)臨床證據:一項可行性研究中報道了Xe聯合HT抑制癲癇活動的作用,隨后18～20個月的隨訪中,一半研究對象發育正?；騼H有輕度精神、心理發育問題[28]。但英國的一項概念驗證臨床試驗顯示出與先前研究不一致的結論,該研究納入了92例中重度HIE患者,隨機接受HT或HT聯合30%Xe治療,乳酸鹽/N-乙酰天冬氨酸水平和MRI顯示的腦損傷在兩組之間均缺乏顯著差異。這可能提示Xe并不能增強出生窒息后HT的神經保護作用[29],這一結論的差異可能與結局指標的選擇及亞低溫治療時間的延遲有關(治療中位年齡為10 h),且該研究缺乏長期隨訪。另一項在出生時健康狀況不佳的腦損傷嬰兒中應用Xe和HT聯合治療的臨床試驗已經完成,尚未發表最終結果(NCT02071394)。

(3)劑量、安全性:給藥劑量或濃度尚無統一標準,部分研究報道在35%～70%濃度范圍內Xe應用具有神經保護作用,此后開展的研究多在這一范圍內應用。Xe的安全性在早期研究中已經得到認可,麻醉劑量下應用Xe不會導致血流動力學紊亂,無呼吸、肝臟毒性報道,相反Xe具有心臟和腎臟保護作用。

2.氬氣:氬氣(Argon,Ar)的神經保護作用逐漸被大眾所認知。研究顯示,Ar增加細胞外調節蛋白激酶1/2磷酸化,激活轉錄因子核因子-紅細胞衍生2,阻斷凋亡級聯反應,上調Bcl-2的表達;同時,Ar通過激活Toll樣受體2和4,減少半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性,介導與促炎因子、生長因子和細胞生存因子相關的細胞內信號傳導。此外,Ar還可以通過降低白細胞介素-6和高遷移率族蛋白B1水平產生抗炎作用。

(1)臨床前證據:氬氣的神經保護作用在多種體內外模型中被證實,具體表現為細胞死亡和梗死面積的下降,以及腦水腫的減輕。在創傷性腦損傷的小鼠模型中給予70%氬氣/30%O2治療,早期評估顯示小膠質細胞活化降低、腦水腫減輕和神經炎癥改善,1月后感覺運動功能恢復加快、認知缺陷顯著改善。一項試驗模擬了臨床上可能遇到的延遲治療的情景,2h的推遲治療同樣表現出神經學結果的顯著改善[30]。聯合治療的有效性在新生仔豬模型中也得到證實,HI后2h開始氬氣吸入,濃度45%～50%,聯合72h HT,結果顯示聯合治療組18h的振幅整合腦電圖恢復更快,梗死體積較小[31]。

(2)臨床證據:目前沒有發表氬氣應用于HIE患兒中的研究。

(3)安全性和劑量:氬氣的應用對于動物模型的血流動力學、腦氧飽和度和血氣分析結果沒有影響,沒有其他不良反應和毒性反應的報道。目前的臨床前試驗中應用的氬氣濃度多在50～70%范圍內,Loetscher等人在50%氬氣濃度下觀察到了最佳神經保護作用[32]。只有少數研究評估了低濃度或更高濃度氬氣的神經保護作用,但目前沒有統一具體的應用濃度。

五、高壓氧治療

高壓氧治療(hyperbaric oxygen therapy, HBOT)可以有效改善組織氧合、增加腦血流量,緩解腦組織缺氧、水腫,但其具體的神經保護機制尚未完全闡明。部分研究認為,HBOT抑制IκBα(核因子-κB抑制因子)降解減輕核因子-κB介導的促炎作用,并通過抑制星形膠質細胞、小膠質細胞的激活減輕缺氧誘導的髓鞘損傷,發揮神經保護作用,同時,通過調節相關細胞因子發揮其促血管生成和神經發生作用,最終改善細胞代謝和神經預后。

1.臨床前證據:HBOT的神經保護作用在早期的體內外模型中得到了證實。Feng等人在新生小鼠模型中對HBOT的作用展開了初步探索,研究表明,HBOT促進HIE新生大鼠腦室下區神經干細胞的增殖,并具有促進腦損傷后神經系統恢復的治療潛力[33]。Xue等人通過水迷宮試驗發現,HBOT治療組的HIE小鼠學習記憶能力較對照組明顯改善,通過對機制的進一步探索,他們發現發現HBOT治療組中IL-1β、IL-6、TNF-α和HIF1-α的表達明顯受抑,SOD水平顯著升高,組織病理學研究同樣顯示,HBOT了降低HI誘導的小膠質細胞和星形膠質細胞活化,促進少突膠質細胞生成和髓鞘發生[34]。

2.臨床證據:目前國內已經開展了HBOT的臨床研究。Zhang等人發表了一項系統評價,表明HBOT能降低新生兒HIE的死亡率和神經后遺癥的發生率。Gong等人進行的Meta分析再次證實了這一觀點,HBOT治療顯著提高總體療效和致殘率,降低新生兒行為神經功能評估評分,進一步的亞組分析發現,每日攝氧時間30～40分鐘,壓力0.04～0.08 mpa,治療持續時間超過30天為最佳治療方案[31]。聯合治療的療效也在探索中。劉瀅等人對比HBOT聯合HT治療和單獨HT治療的療效,通過振幅整合腦電圖、6月齡的發育商和智力指數以及癲癇發病率的評估,發現聯合治療對HIE患兒的預后改善更明顯。時改善更明顯,癲癇發病率更低,6個月時的發育商和智力指數較好[35]。HBOT與Epo及神經節苷脂等藥物聯合應用也能達到預期治療效果。

3.安全性和劑量:長期應用HBOT可能會導致氧中毒,引起全身多器官系統損害,嚴格控制高壓氧治療的壓力和時間能有效避免不良反應的發生。研究表明,壓力控制于1.4～1.6 ATA以內,輔以間歇吸氧的方式安全有效。而Gong等人的meta分析則發現0.04～0.08 mpa的壓力下進行HBOT能達到最佳療效[31]。鑒于目前研究結果的差異性,我們迫切需要更充分、有效的證據探索HBOT具體應用方案和安全性。

六、干細胞治療

干細胞具有我更新和分化為多個細胞系的能力,由于傳統治療的局限性,基于干細胞的療法已成為治療神經系統疾病的理想選擇。干細胞的神經保護涉及多種機制,包括細胞替代作用和旁分泌效應,參與促進神經發生、血管生成、突觸發生,減少腦損傷后瘢痕形成,同時,炎癥基因的下調和抗凋亡因子的參與也是干細胞發揮神經保護的基礎。

1.臨床前證據:HI后0～7天給予1.5×104～1×108/kg干細胞治療,在小鼠和大鼠模型中觀察到解剖學和功能學方面的改善[36]。Inês Serrenho 等人對干細胞的臨床前試驗進行了薈萃分析,結果表示干細胞能改善認知、感覺及運動功能,減少腦損傷,支持干細胞治療的潛力及與HT聯合應用的可能性[37]。與前者研究一致,Robertson在新生仔豬中HI后24和48 h,給予2劑3 000萬人臍帶間充質干細胞聯合12 h HT,結果顯示聯合治療能增強HT的腦保護作用[38]。但Herz等人發現聯合治療可能導致腦損傷加重、長期功能缺陷增加[39],該研究選取的HT和干細胞治療的劑量和時間均具有前期研究數據支持,僅在干細胞類型的選擇上有所不同。由于兩種治療方案可能相互影響,聯合治療的具體應用不能單純從前期的單藥研究中摘取,進一步的治療窗、劑量的研究仍必不可少。

2.臨床證據:在腦癱患兒中已經開展了干細胞治療的臨床研究,在原發性和晚期損傷階段應用臍帶血干細胞移植治療均可以加速腦癱患者的功能恢復,減少長期殘疾、提高生活質量。并且重復劑量具有疊加效應,與較早時間點單次給藥相比,在不同時間點多次給予臍帶血細胞更好的改善感覺運動功能及神經元的數量,并減少凋亡和炎癥標記物[40]。Cotten等人報道,HIE患兒生后24、48、72h接受靜脈注射(1～5)×107/kg細胞聯合HT,長期神經系統預后有所改善[41]。

3.給藥途徑、劑量、安全性:干細胞治療的全身應用途徑包括靜脈和腹腔給藥,但由于HI涉及全身多器官組織,全身應用可能導致損耗過多。局部給藥途徑包括顱內、鞘內和鼻內給藥等方式。顱內給藥創傷大,可能增加不良反應的風險,難以廣泛實踐。鞘內給藥曾應用于腦癱的干細胞輸注試驗中。但相較而言,鼻內給藥快速有效、安全無創,有巨大的潛力,研究顯示其有益效果與顱內途徑和腹腔給藥沒有顯著差異,干細胞治療的給藥時間仍在探索,早期研究多選擇HI損傷后24 h作為時間點,以避免急性興奮毒性和炎癥反應,損傷0～7天后的給藥在隨后的研究中仍顯示出解剖學和功能改善,而Uemura等人的研究則顯示腦損傷后24～72 h給藥較腦損傷后24 h內早期給藥的療效更好。

治療劑量需根據具體應用的細胞類型、給藥途徑和時間決定。臨床前研究使用的細胞劑量在1.5×104～1×108/kg之間,1×107/kg細胞是最常見且具有神經保護作用的劑量。

干細胞的安全性在體內外試驗中被廣泛證實,尚無嚴重不良反應的報道,且臍帶血接受者1年的無殘疾生存率明顯高于接受HT的嬰兒。

綜上所述,HT、Epo、Mel、稀有氣體、高壓氧和干細胞治療均顯示出了良好的神經保護作用,在HIE治療中有廣闊的前景。但目前仍然存在研究與臨床應用的差距:首先,這些研究中最常見的問題是缺乏大樣本量、多中心的高質量隨機對照研究;其次部分治療方法盡管顯示出了神經保護潛力,但沒有其具體機制的完整、清晰的研究,這些機制的闡明將是聯合治療的理論基礎;第三,盡管部分治療方法的研究集中于某劑量范圍和時間范圍內,但并沒有在具體的應用時間窗、劑量、給藥途徑、聯合應用等方面達成共識;第四,治療方法應用于疾病的不同程度(輕度HIE)、不同胎齡、體重、甚至是性別,都可能產生療效的差異,這可能是一個新的研究方向;最后,不同經濟/醫療資源環境不僅導致治療方法可及性的差異,還對治療有效性可能產生影響,尤其在亞低溫治療的應用中,目前在中低收入國家內的應用顯示出了不一致的結果。未來的研究需要注重疾病機制的探索,明確治療靶點,為聯合治療和治療適用性提供理論支撐,加強對于治療安全性、有效性的研究,并進一步開展大規模的臨床試驗,確立具體臨床應用方案。