基于TLR4/NF-κB信號通路探討川膝散對腎虛血瘀型膝骨性關節炎的作用機制

周曉成 ,項 杰,張姚萍,吳良金,孫風凡,夏曉斌,穆中杰

(杭州市富陽中醫骨傷醫院·浙江 杭州 311400)

膝骨性關節炎是臨床常見的骨關節疾病,早期主要表現為膝關節負重活動時輕微疼痛,隨著疾病的進展,出現靜息狀態下膝關節疼痛,甚至膝關節畸形、活動受限等癥狀,嚴重影響患者的日常生活[1]。西醫藥物保守治療主要以抗炎炎鎮痛類藥物、關節腔注射等治療為主,難以有效地控制膝骨性關節炎的進展,并且存在一定的副作用[2]。中醫中藥具有安全性高、多靶點治療等優勢,在骨傷科疾病的治療中有廣泛的應用。膝骨性關節炎屬于中醫“痹證”范疇,老年膝骨性關節炎多以腎虛為其本,而痹證日久易致瘀,從而形成腎虛血瘀這一虛實夾雜之證,臨床上較為常見[3]。川膝散是本院張玉柱主任治療膝骨性關節炎的經驗方,臨床應用療效確切,但其作用機制尚不明確。本研究將探討川膝散對腎虛血瘀型膝骨性關節炎TLR4/NF-κB信號通路的影響,為該藥物的進一步開發利用提供依據。

1 臨床資料

1.1 一般資料 納入2021年1月—2022年12月至杭州市富陽中醫骨傷醫院就診的膝骨性關節炎患者90 例。應用隨機數字表法將患者分為對照組和觀察組,每組各45例;其中5例中途主動要求退出,3 例不能按規定治療接受其他治療,3例無法堅持治療,最終共納入79例患者,其中對照組41例,觀察組38例,組間一般資料比較差異無統計學意義,具有可比性(P>0.05),見表1。本研究經過杭州市富陽中醫骨傷醫院倫理委員會批準(廳浙中2020-02A號)。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 診斷標準 西醫診斷標準依據中華醫學會骨科學分會關節外科學組制訂的《骨關節炎診療指南(2018版)》[4],并根據Kellgren-lawrence 分級[5]對膝骨關節炎進行分級。中醫證候診斷依據《中醫骨傷科臨床診療指南·膝痹病(膝骨關節炎)》[6]中腎虛血瘀證標準。

1.3 納入標準 1)符合膝骨性關節炎診斷標準且Kellgren-lawrence 分級為I、II 級;2)VAS疼痛評分≥4 分;3)中醫證候為腎虛血瘀型;4)年齡60～70 歲;5)簽署知情同意書。

1.4 排除標準 1)類風濕、痛風、感染等其他疾病引起的膝關節炎;2)肢體畸形;3)存在神經系統疾病;4)既往膝關節手術史。

1.5 剔除及脫漏標準 1)未按規定治療,無法判斷療效者;2)資料不全者;3)無法堅持治療者;4)主動要求退出者。

2 方法

2.1 治療方法 對照組：由專門醫生對患者進行坐位股四頭肌非負重訓練的指導,每日訓練3組,每組鍛煉20次;應用氟比洛芬凝膠貼膏(北京泰德制藥股份有限公司;批號：J20160090;規格：40 mg/貼×6 貼)外用,每日2次;口服硫酸氨基葡萄糖(浙江海正藥業股份有限公司;批號：H20041316;規格：0.314 g×12?！?板),2粒/次,每日3次。觀察組：在對照組基礎上予以內服川膝散(川牛膝15 g、桃仁10 g、紅花6 g、當歸10 g、赤芍12 g、生地15 g、防己10 g、延胡索10 g、澤蘭10 g、黃柏8 g、赤小豆25 g組成),并辨證加減：腎陽虛加鹿角片10 g、補骨脂10 g;腎陰虛加龜甲10 g、枸杞12 g、女貞子12 g;血虛加阿膠10 g、熟地15 g、制首烏15 g;氣虛加黃芪25 g、黨參15 g;脾虛加黨參15 g、白術15 g、炙甘草6 g;納差加雞內金9 g、焦三仙15 g;每日1 劑,每劑2 煎,均由本院煎藥房統一標準煎制,分2次口服,共服用4 周。

2.2 觀察指標及檢測

2.2.1 膝關節疼痛評分 治療前和治療1個月后采用視覺模擬評分法(visual analogue scale,VAS)[7]評估,分值為0～10 分,0 分表示無痛,10分表示疼痛劇烈。

2.2.2 膝關節功能評分 治療前和治療1 個月后采用JOA評分[8]及WOMAC骨關節炎指數[9]評價。JOA評分包括步行疼痛、爬樓梯疼痛感、膝關節屈曲活動度及腫脹4 個部分,總分為100 分,分值越高代表膝關節功能越好。WOMAC骨關節炎指數評分由疼痛、僵硬程度、關節功能3 個部分組成,共28 個項目,分值越高表示膝關節功能越差。

2.2.3 血清TLR4、NF-κB p65、IL-1b、TNF-α檢測 治療前和治療1個月后采取患者清晨空腹靜脈血5 mL,以200 g離心力離心10 min,收集血清,采用酶聯免疫吸附法檢測血清TLR4、NF-κB p65、IL-1b、TNF-α水平,試劑盒購自上海達科為生物技術有限公司。

2.3 統計學處理 采用SPSS22.0統計學軟件進行數據統計分析。計量資料經過正態分布檢驗符合正態分布,以均數±標準差表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗,組內比較采用配對樣本t檢驗;計數資料采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 兩組患者治療前后膝關節疼痛和功能評分比較 見表2。

表2 兩組患者治療前后疼痛VAS、JOA及WOMAC評分比較分)

3.3 兩組患者治療前后TLR4/NF-κB 信號通路及炎癥指標比較 見表3～表4。

表3 兩組患者治療前后血清TLR4、NF-κB p65比較

表4 兩組患者治療前后血清IL-1b、TNF-α水平比較

4 討論

隨著我國人口老齡化的加劇,膝骨性關節炎發病率逐年上升,已成為老年人群就診最為常見的骨關節疾病。根據膝骨性關節炎的臨床表現可歸屬于祖國傳統醫學“痹證”范疇。中老年患者腎氣漸衰,先天之精匱乏無源,而腎主骨生髓,骨骼缺乏濡養,同時腎精不足,正氣虧虛,易外感風、寒、濕外邪,閉阻于內,日久阻礙經脈氣血的運行而致瘀,腎虛與血瘀互為交雜,相互影響,導致疾病遷延不愈,故治療上應兼顧補腎益精和化瘀通絡[10]。有學者在臨床上應用補腎活血類中藥治療腎虛血瘀型膝骨性關節炎患者,發現補腎活血類中藥可以起到減輕疼痛、改善膝關節功能的功效[11-12]。

本研究所應用的川膝散為國家非物質文化遺產項目“張氏骨傷診療技術”代表性傳承人張玉柱主任經驗方。方中川牛膝逐瘀通經兼顧補肝腎、強筋骨;桃仁、紅花、延胡索活血化瘀止痛;當歸行血補血;赤芍、生地清熱涼血兼養陰生津;黃柏以瀉火除蒸、解毒;防己、澤蘭、赤小豆以行氣利水為主,輔助活血,水行則血暢,增強活血功能[13]。研究結果顯示川膝散治療腎虛血瘀型膝骨性關節炎患者在治療1個月后膝關節疼痛VAS評分低于對照組,前者的JOA評分高于對照組,WOMAC評分低于對照組;表明川膝散能有效緩解腎虛血瘀型膝骨性關節炎患者疼痛,改善膝關節的功能。

目前較為公認的膝骨性關節炎的發病機制是關節內機械損傷和慢性炎癥相互作用的結果[14]。固有免疫系統的激活是引起關節內持續無菌性低度炎癥反應的重要原因。Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是固有免疫反應中重要的一組跨膜分子,不僅參與了病原體相關分子模式蛋白的識別,其中部分TLRs還參與了損傷相關分子模式DAMPs蛋白的識別,TLRs與相關分子結合后能夠激活下游NF-κB信號通路,誘導TNF-α、IL-6等促炎因子的釋放;而關節內損傷的軟骨碎片會被分解為纖維連接蛋白、透明質酸、二聚糖等物質,這些分解物能夠與TLRs結合,從而激活固有免疫反應,誘發關節內的炎癥反應,促炎因子的增多會促進基質金屬蛋白酶的分泌,抑制膠原蛋白和蛋白聚糖的合成,促進軟骨分解,限制軟骨自我修復能力,導致關節內軟骨進一步損傷[15]。在膝骨性關節炎模型來源的軟骨和滑膜中均發現TLR4表達顯著升高[15-16],相比其他模式識別受體,TLR4對DAMPs蛋白的識別更為敏感,這使得其更容易識別損傷軟骨所分解的物質,誘發下游通路的激活[17]。RNA結合蛋白PUM1可以與TLR4的3’端非編碼區結合,抑制TLR4 mRNA轉錄,Yoon DS等[18]通過過表達PUM1,抑制TLR4的合成,從而降低NF-κB的活性,保護細胞免受炎癥介導的軟骨形成表型的破壞。在IL-1β過表達的情況下,TLR4敲除的模型鼠軟骨損傷程度和滑膜炎癥均要弱于野生型鼠[19]。因此,TLR4對膝骨性關節炎固有免疫反應的激活具有重要意義。既往研究顯示補腎活血類中藥具有抑制炎癥的作用[20-21],本研究結果顯示,川膝散治療的腎虛血瘀型膝骨性關節炎患者血清TLR4、NF-κB p65的表達相比對照組降低更明顯,并且血清促炎因子IL-1b和TNF-α的含量也低于對照組;提示川膝散治療腎虛血瘀型膝骨性關節炎的部分機制是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活,減少促炎因子的釋放,從而起到減輕疼痛癥狀,改善患者膝關節功能的作用。

綜上所述, 川膝散治療可以調節TLR4/NF-κB信號通路,減少炎癥因子產生,起到治療腎虛血瘀型膝骨性關節炎的作用。