太湖常見3種沉水植物附著生物的生物量及潛在反硝化速率*

任天一,徐向華,2,宋玉芝,2,3**,郭 婧

(1:南京信息工程大學應用氣象學院,南京 210044) (2:中國氣象局生態系統碳源匯開放重點實驗室,南京 210044) (3:南京信息工程大學,固碳減排與全球變化研究中心,南京 210044)

湖泊富營養化是當前最突出的水環境問題之一,水體氮素增加是導致水體富營養化主要原因之一,降低氮負荷有利于減輕富營養化程度[1]。已有研究表明,反硝化作用是水體去除氮素的重要途徑之一[2],通過反硝化作用去除氮的總量約占湖泊生態系統氮輸入的1%～36%[3]。由此可見,反硝化脫氮對于自然湖泊氮的去除具有重要的作用。

目前研究表明,自然水體中參與反硝化的微生物多是兼性厭氧反硝化菌,水體中沉積物和附著生物復雜的結構為反硝化微生物提供了厭氧環境,因此反硝化作用主要發生在沉積物以及附著生物中[4]。已有的研究多集中在湖泊沉積物反硝化作用[5],而對附著生物的反硝化作用關注比較少。事實上,附著生物的生物群落是由細菌、真菌、微藻以及有機、無機碎屑等構成的內部環境復雜的微型復合群落,生長在浸沒于水中的各種基質表面[6]。淺水湖泊有利于沉水植物的發展,其莖葉為附著生物提供大量附著面積,附著生物附著在沉水植物表面,形成了特殊的生物-水微界面。隨著水體富營養化的加劇,沉水植物上附著生物的生物量逐漸增加,附著生物群落中附著藻類及微生物的代謝活動增加了附著層的厚度,減緩氧氣的擴散速率,附著生物內部發生光合作用及呼吸作用也造成莖葉表面富氧-微氧的微環境,有利于反硝化作用的發生[7-8]。研究發現,沉水植物附著層反硝化細菌豐度較沉積物反硝化細菌豐度高[9-10],且附著生物的反硝化速率與沉積物反硝化速率相當,甚至超過沉積物[4]。

附著生物的生物量及反硝化作用受到諸多因素影響,如溫度、pH、可利用的有機碳、氮磷濃度、水力條件等環境因素[11-12]。氮是反硝化作用的主要底物,水體中氮的濃度被認為是反硝化作用的主要影響因素,當水體氮充足時,反硝化作用會受到有機碳、pH、溶解氧、溫度、沉水植物分布及類型等因素的限制[13-14]。不同湖泊水體氮磷濃度、沉水植物分布及其他環境條件存在差異,有必要針對具體的湖泊進行沉水植物附著生物生物量及反硝化作用的研究。太湖是中國第三大淡水湖泊,流域內經濟發達,人口密集。受到人類活動的影響,太湖藍藻水華頻發,富營養化嚴重,成為國內外重點關注的熱點問題[15]。針對太湖富營養化內源治理,沿湖濱帶實施了以恢復水生植物為核心的生態系統修復等工程措施[16-17]。在沉水植被大量恢復的情況下,太湖沉水植物附著生物的生物量存在怎樣的變化?事實上,太湖營養鹽含量空間異質性明顯,不同湖區營養鹽濃度、沉水植物分布情況等存在明顯差異。已有研究表明,太湖水體中的反硝化作用每年可以去除接近54%的外源氮負荷[18]。有關太湖生態系統中反硝化過程的研究主要集中于沉積物[19-21],針對太湖沉水植物表面附著生物生態作用的報道較少。太湖沉水植物附著生物膜是否是湖泊生態系統反硝化作用的重要場所?太湖常見沉水植物附著生物的潛在反硝化速率(DNP)有多大?影響太湖沉水植物附著生物的生物量及潛在反硝化速率的因素有哪些?基于以上問題,本研究在沉水植物生長盛期將太湖東部沉水植物主要分布湖區作為采樣區域,對太湖常見的3種沉水植物的附著生物生物量進行研究,并利用乙炔抑制法測定了沉水植物上附著生物的潛在反硝化速率,分析了太湖沉水植物附著生物的生物量及其潛在反硝化速率的主要影響因素,以期為太湖水體氮污染治理及沉水植物的科學管理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與分析

在沉水植物生長盛期(7月底),根據太湖沉水植物分布及環境條件設置5個采樣點(圖1)。在采樣前利用便攜式多參數水質分析儀(YSI 6000,USA)現場測定各采樣點水體溶解氧、pH、水深、溫度等指標,用賽氏盤測定采樣點水體透明度,并按照《湖泊調查技術規程》[22]采集水體及沉水植物樣品,每個采樣點設置3個重復。在5個采樣點共采集3種沉水植物(狐尾藻(Myriophyllumspicatum)、馬來眼子菜(Potamogetonmalaianus)、苦草(Vallisnerianatans))。采集的沉水植物和水樣立即低溫運回實驗室進行處理。

圖1 太湖采樣點分布Fig.1 Location of the sampling sites in Lake Taihu

1.2 水體及附著層理化特征的室內測定

用水輕輕地沖洗采集的沉水植物,用軟毛刷輕輕刷洗沉水植物表面去除沉水植物表面附著物[24],將刷洗的附著液定容后用于分析附著層理化特征。附著生物DW、AFDM、Chl.a及氮磷指標的測定方法與水體相同。

1.3 潛在反硝化速率的測定

使用乙炔抑制法對沉水植物及附著生物的潛在反硝化速率進行測定[25-26]。隨機取各采樣點長勢一致的每種沉水植物約10 g(濕重),分別放入裝有450 mL原位水的1 L容器中。另取一部分沉水植物使用軟毛刷輕輕刷洗沉水植物莖葉,去除附著物[26],再隨機取長勢適中的刷洗后的沉水植物10 g(濕重)左右放入裝有450 mL原位水的容器中。每種植物每個處理設置3個重復。將容器密封,黑暗條件下經過12 h預培養,預培養后向培養容器中注入175 mL氬氣以保持厭氧環境,注入50 mL含硝態氮及有機碳的濃縮液(KNO3:7.21 g/L、葡萄糖:18 g/L)[11]增加底物濃度,并向容器中注入75 mL乙炔氣體(乙炔壓力:C2H2=0.1 atm)[3],混勻,在25℃條件下進行避光培養。開始培養時,用注射器抽取培養容器中12 mL氣體注入12 mL真空頂空瓶中,用于測定N2O濃度,培養4 h后[11],輕輕搖動培養容器,抽取培養容器氣體用于N2O濃度分析。培養結束后,取出沉水植物,使用葉面積儀(Yaxin-1241)對沉水植物葉面積進行測量,沉水植物經過莖葉面積測量后進行烘干,稱量植物干重。

抽取頂空瓶中氣體5 mL推進氣相色譜儀測定N2O濃度。利用單位時間單位沉水植物體表面積N2O生成量表征沉水植物潛在反硝化速率。N2O樣品濃度使用Agilent 7890B氣相色譜儀進行測定,利用標氣N2O濃度對儀器測得結果進行訂正,并根據亨利定律計算水中溶解N2O的濃度[27],利用頂空氣體和水中溶解N2O 濃度之和通過下列公式計算獲得沉水植物或帶有附著生物的沉水植物的潛在反硝化速率:

(1)

式中,DNP為潛在反硝化速率,μmol/(m2·h);ct為培養t時間后頂空N2O濃度,μmol/L;c0為初始容器頂空N2O濃度,μmol/L;cwt為培養t時間后水中溶解N2O濃度,μmol/L;cw0為初始容器水中溶解N2O濃度,μmol/L;v為密閉容器頂空體積,L;vw為密閉容器中水的體積,L;s為容器中沉水植物體表面積,m2;t為培養時間,h。

附著生物潛在反硝化速率計算公式為:

DNPf=DNPc+f-DNPqf

(2)

式中,DNPf為附著生物潛在反硝化速率,μmol/(m2·h);DNPc+f為未除去附著物的沉水植物(沉水植物+附著生物)潛在反硝化速率,μmol/(m2·h);DNPqf為除去附著物后沉水植物(沉水植物)潛在反硝化速率,μmol/(m2·h)。

1.4 統計分析

使用Excel 2019和SPSS 26軟件進行數據分析,利用Origin 2021軟件進行數據繪圖。采用單因素方差分析(ANOVA)對數據差異顯著性進行檢驗,P<0.05作為差異顯著水平。采用Spearman相關系數(P<0.05,顯著相關;P<0.01,極顯著相關)判斷附著生物的生物量和潛在反硝化速率與水體環境因素及附著層理化性質之間的相關關系,并通過逐步回歸方法進一步選取對附著生物的潛在反硝化速率影響最顯著的因子。

2 結果與分析

2.1 采樣點水體理化特征

表1 不同采樣點水體理化性質*Tab.1 Physical and chemical properties of water at different sampling sites

2.2 沉水植物附著層理化指標

表2 單位沉水植物體表面積附著層理化性質*Tab.2 Physical and chemical properties of epiphyton on the submerged plants

2.3 沉水植物附著生物的生物量

附著生物Chl.a含量常用于表征附著生物中附著藻類的生物量[28],附著生物AFDM含量常用于表征附著生物的生物量[29]。從圖2可看出,附著生物的Chl.a含量在不同采樣點不同沉水植物之間存在差異。G1采樣點狐尾藻附著生物的Chl.a含量最高,顯著高于其他沉水植物附著生物的Chl.a含量(P<0.05),其次是G2采樣點的馬來眼子菜附著生物的Chl.a含量,而胥口灣各采樣點不同沉水植物附著生物的Chl.a含量相對較低。在貢湖灣,比較同一采樣點不同沉水植物附著藻類生物量發現,苦草附著生物的Chl.a含量較低,顯著低于相同采樣點其他沉水植物附著生物的Chl.a含量(P<0.05)。進一步分析同種沉水植物不同采樣點的附著生物的Chl.a含量發現,貢湖灣G2采樣點馬來眼子菜附著生物的Chl.a含量顯著高于胥口灣X1、X2采樣點(P<0.05),胥口灣X1采樣點與X2采樣點差異不大;苦草則表現為貢湖灣G2采樣點附著生物的Chl.a含量顯著高于其他3個采樣點苦草附著生物的Chl.a含量,G1采樣點與X3采樣點無顯著差異,但都顯著高于X1采樣點。附著生物的AFDM在不同采樣點不同沉水植物之間均存在著顯著差異(圖2)。G1采樣點狐尾藻附著生物的生物量顯著高于其他沉水植物附著生物的生物量(P<0.05),其次是G2采樣點馬來眼子菜附著生物的生物量,G1采樣點苦草附著生物的生物量也比較高。對相同采樣點而言,苦草附著生物的生物量顯著低于其他沉水植物附著生物的生物量(P<0.05)。進一步分析同種沉水植物不同采樣點附著生物的生物量發現,馬來眼子菜附著生物的生物量表現為G2>X1>X2,苦草附著生物的生物量表現為G1>G2(X3)> X1。

圖2 沉水植物附著生物Chl.a和AFDM含量(不同字母表示不同采樣點間差異顯著(P<0.05))Fig.2 Chl.a and AFDM of epiphyton on the submerged plants (different letters indicate significant differences among different sampling sites (P<0.05))

2.4 沉水植物附著生物潛在反硝化速率

從圖3可知,有附著生物的沉水植物潛在反硝化速率在貢湖灣及胥口灣之間變化明顯,其中G1、G2采樣點有附著沉水植物的潛在反硝化速率均高于胥口灣X1采樣點(P<0.05);無附著生物的沉水植物潛在反硝化速率在貢湖灣及胥口灣之間變化不顯著,但同一湖灣內存在點位間差異。從圖3還可以看出,在貢湖灣各采樣點,有附著生物的沉水植物潛在反硝化速率均顯著高于無附著生物的沉水植物潛在反硝化速率(P<0.05)。進一步分析沉水植物附著生物的潛在反硝化速率發現,不同沉水植物的附著生物潛在反硝化速率存在明顯的變化,G1采樣點狐尾藻附著生物的潛在反硝化速率可達(58.80±20.20)μmol/(m2·h),G2采樣點馬來眼子菜附著生物的潛在反硝化速率((51.98±4.91)μmol/(m2·h))也較高,與G1采樣點狐尾藻附著生物的潛在反硝化速率相當,二者均顯著高于其他植物附著生物的潛在反硝化速率(P<0.05)。對于同一采樣點不同沉水植物而言,附著生物潛在反硝化速率存在一定差異,但也因采樣點不同而不同。G1采樣點狐尾藻附著生物的潛在反硝化速率顯著高于同一采樣點苦草附著生物的潛在反硝化速率(P<0.05),但在X1采樣點苦草與馬來眼子菜附著生物的潛在反硝化速率差異不大。進一步分析同種沉水植物在不同采樣點沉水植物上附著生物的潛在反硝化速率發現,苦草附著生物的潛在反硝化速率表現為:G2> G1(X3)>X1。馬來眼子菜附著生物的潛在反硝化速率表現為:G2>X2>X1?？偟膩砜?貢湖灣附著生物潛在反硝化速率較高,而胥口灣各沉水植物上附著生物潛在反硝化速率較低。

2.5 沉水植物上附著生物的生物量及潛在反硝化速率與環境因子的相關分析

圖4 單位沉水植物體表面積附著生物Chl.a和AFDW與環境因素的相關熱圖(n=48)Fig.4 Heat map of theepiphytic algae and epiphyton load on the submerged plants and environmental factors per unit submerged plant body surface area(n=48)

圖5 單位沉水植物體表面積附著生物潛在反硝化速率與水體理化特征(a)和附著層理化特征(b)的相關熱圖(n=48)Fig.5 Heat map of DNP and physicochemical properties of water (a) and physicochemical properties of epiphyton on submerged plant (b) (n=48)

3 討論

3.1 太湖沉水植物附著生物的生物量及影響因素

太湖3種常見沉水植物上附著生物的生物量存在空間差異,Chl.a和AFDM受到生長環境水體理化因子共同作用的影響[30-31]。已有研究表明,水體氮磷濃度對附著生物生物量的影響較大,附著生物生物量與水體氮磷濃度存在顯著正相關關系[32-33]。由表1及圖2可知,G1、G2采樣點水體總氮濃度相對較高,X1、X2、X3采樣點相對較低,沉水植物附著生物生物量的最高值出現在G1采樣點,最低值出現在X1采樣點。進一步分析發現,附著生物生物量與水體氮磷濃度呈顯著正相關(P<0.01)(圖4)。附著生物生物量不僅受水體氮磷濃度的影響,附著藻類是附著生物群落中重要組成成分,其作為淺水湖泊重要的初級生產者,光照是影響其生長的主要因素[34-35]。由表1可知,G1采樣點水體氮磷濃度高于G2采樣點,而G2采樣點苦草附著藻類生物量顯著高于G1采樣點(圖2),主要與光照條件有關。由表1可知,由于G1采樣點水體氮磷濃度高于G2采樣點,G1采樣點浮游藻類生物量高于G2采樣點,進而影響水體透明度, G2采樣點透明度比G1采樣點高(表1)。此外,G1采樣點水深較G2采樣點深(表1),到達G1點葉片表面的光照強度大大降低。本文研究結果表明,附著生物的生物量與水深呈現相關關系(P<0.01)(圖4)。

附著生物除受到環境因素影響,附著在沉水植物表面的附著生物生物量還會受到沉水植物形態結構及其特性的影響[36-37]。在本研究中,相同條件下不同沉水植物附著生物的生物量存在差異,狐尾藻和馬來眼子菜附著生物的生物量均高于苦草,這可能與沉水植物形態結構及生活習性有關。狐尾藻葉片呈羽狀,形態結構比較復雜,相對而言,馬來眼子菜與苦草形態結構簡單,呈條狀或帶狀,但前者更有利于附著生物的附著。在相同的采樣點,苦草附著生物的生物量與馬來眼子菜上的也存在明顯差異,這可能是由于苦草屬于底層性沉水植物,而馬來眼子菜屬于冠層性沉水植物,底層性沉水植物上的附著生物受光的限制。此外,沉水植物上附著生物的發展也可能受宿主植物分泌物的影響。研究表明,不同沉水植物分泌物存在差異,進而可能影響附著生物群落中異養生物的生長[38]。

3.2 太湖沉水植物附著生物潛在反硝化速率的影響因素

太湖常見的3種沉水植物附著生物潛在反硝化速率存在一定的空間差異。相比較而言,貢湖灣沉水植物附著生物潛在反硝化速率相對較高,而胥口灣相對較低(圖3)。相關分析表明,附著生物潛在反硝化速率與水體及附著生物的理化指標密切相關(圖5)。事實上, 反硝化作用是由反硝化微生物介導的在厭氧條件下以硝態氮作為代謝底物的氮代謝過程,附著生物潛在反硝化速率與附著生物生物量及附著層群落結構密切相關。附著藻類生物量的增加有利于反硝化作用的進行[13,39],沉水植物及附著藻類進行光合作用,引起微環境溶氧濃度、氧化還原電位、pH等發生變化[30,40],附著生物膜內部形成厭氧區,有利于反硝化作用的進行。同時附著生物膜內部的反硝化細菌生長代謝所需碳源依賴于自養微生物(如藻類)分泌有機產物或死亡分解提供[11,39],附著生物內部的調節作用影響微生物群落的活性[41],附著生物潛在反硝化速率與附著生物的生物量存在線性相關關系[24,41]。這些與本文研究結果中沉水植物附著生物的潛在反硝化速率與附著層附著藻類生物量(Chl.a)及附著生物生物量(AFDM)具有顯著的正相關關系是一致的(P<0.01)(圖5b)。

附著生物的潛在反硝化速率除受到附著生物生物量及附著藻類生物量影響外,還受水環境營養條件的影響[11-14]。由表1及圖3可知,貢湖灣采樣點水體總氮濃度相對較高,而胥口灣采樣點相對較低。貢湖灣各采樣點附著生物的潛在反硝化速率較高,而胥口灣相對較低(圖3)。相關研究也表明,不同營養狀態水體中附著生物的潛在反硝化作用存在差異[13],適應高營養負荷的沉水植物附著生物潛在反硝化速率較適應低營養負荷的高100倍左右[14],這與在不同營養條件下反硝化微生物豐度發生變化進而影響潛在反硝化速率相關[40]。附著生物的潛在反硝化速率不僅受水體氮濃度的影響,與水體DOC濃度、pH等多種生態因子也密切相關。由圖2可知,X1采樣點馬來眼子菜附著生物生物量顯著高于X2采樣點,但X2采樣點馬來眼子菜附著層的潛在反硝化速率卻顯著高于X1采樣點(圖3),究其原因可能受到水體DOC濃度影響。水體DOC在反硝化過程擔任電子供體的來源,同時還在反硝化細菌生長代謝過程中提供能量,是影響反硝化作用的重要因素[42-43]。相關分析也表明,附著生物的潛在反硝化速率與水體DOC濃度呈顯著正相關(P<0.01)(圖5a)。pH通過對附著微生物活性產生影響進而影響附著生物的潛在反硝化速率[44]。由圖2可知,G1采樣點苦草附著生物生物量顯著高于G2采樣點,但G2采樣點苦草附著層潛在反硝化速率高于G1采樣點,究其原因可能受到水體pH影響。相關分析結果表明,附著生物的潛在反硝化速率與水體pH呈顯著負相關(P<0.01)(圖5a)。通過逐步回歸分析可知,附著藻類生物量(Chl.a)、水體pH和DOC的變異可以解釋81.2%的太湖沉水植物附著生物的潛在反硝化速率變化。

3.3 太湖沉水植物附著生物反硝化過程在水體脫氮中的作用

通過研究發現,太湖3種常見沉水植物上的附著生物潛在反硝化速率在3.09～51.98 μmol/(m2·h)之間,單位體表面積沉水植物附著生物潛在反硝化速率相對較低,但夏季沉水植物生長旺盛,生物量大且覆蓋大部分水面,單位湖泊面積上沉水植物葉面積較大,已有的研究表明,太湖有沉水植物分布區域單位湖泊面積沉水植物生物量為(101.23±58.23) g/m2[45],根據沉水植物生物量計算單位湖泊面積沉水植物附著生物潛在反硝化速率,其值為(0.81±0.24)～(157.57±33.85) μmol/(m2·h)。Eriksson等[3]對污水池中植被附著生物的反硝化作用進行研究時發現,沉水植物附著生物潛在反硝化速率可達7.5～250 μmol/(m2·h),較同條件的沉積物潛在反硝化速率(168 μmol/(m2·h))高。Bourgues等[4]對城市濕地沉積物和附生生物膜潛在反硝化速率進行研究時發現,受污染最嚴重的濕地具有最高的反硝化潛力,且附生生物膜潛在反硝化速率達到(980±300)～(1860±830) μmol/(m2·h)。與已有的研究相比,本研究測定的附著生物反硝化速率略低。相關的研究表明,不同營養狀態水體中附著生物的潛在反硝化作用存在差異[13],本研究中貢湖灣為草藻過渡型湖區、胥口灣為草型湖區,營養鹽濃度相對較低,與營養鹽濃度較高的環境相比,長期營養鹽濃度較低的環境中,反硝化微生物豐度較低[40],進而可能導致本研究結果略低于前人的研究結果。

結合已有的研究,董彬等[46]的研究表明,菹草暴發生長期附著生物反硝化速率顯著升高,是春季水體重要的脫氮過程。Eriksson[12]的研究表明,夏季沉水植物為反硝化細菌提供附著表面,顯著提高淺層富營養淡水系統中氮的去除率。研究結果說明,沉水植物附著生物反硝化脫氮是水體重要的氮去除過程。同時進一步分析太湖常見沉水植物附著生物反硝化作用在太湖脫氮中的重要性,趙鋒等[21]對于太湖春夏兩季沉積物反硝化空間差異的研究中發現貢湖灣沉積物反硝化速率為(72.78±11.83)μmol/(m2·h)?？蝶惥甑萚20]對太湖主要環湖河道沉積物反硝化潛力的研究中發現太湖環湖河道沉積物反硝化潛力為(0.87±0.62)μmol/(m2·h)。本研究中沉水植物附著生物潛在反硝化速率((0.81±0.24)～(157.57±33.85) μmol/(m2·h))與太湖沉積物潛在反硝化速率相當,甚至高于有些文獻中關于太湖沉積物的潛在反硝化速率,分析結果表明,太湖沉水植物附著生物反硝化脫氮是太湖水體重要的氮去除過程。為有效控制太湖富營養化程度,建議對沉水植物進行人工管理,可將狐尾藻、苦草、馬來眼子菜等沉水植物與春末生根發芽夏初衰亡的菹草交替種植,充分發揮沉水植物附著層的生態功能。本研究對太湖3種常見的沉水植物附著生物的生物量及潛在反硝化速率進行分析,研究結果可為湖泊系統沉水植物的管理提供一定的科學依據。

致謝:感謝中國科學院南京地理與湖泊研究所太湖湖泊生態系統國家野外科學觀測研究站在野外采樣所給予的支持!