UPLC-QQQ-MS/MS法用于粉防己根雙芐基異喹啉生物堿合成途徑中12種化合物的定量檢測*

申潤艷,陳衍熾,李檢秀,蒙麗鈞,嚴 興,李堅斌**,謝能中

(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530003;2.廣西科學院大健康所,非糧生物質酶解國家重點實驗室,國家非糧生物質能源工程技術研究中心,廣西生物質工程技術研究中心,廣西生物煉制重點實驗室,廣西南寧 530007;3.中國科學院分子植物科學卓越創新中心,中國科學院合成生物學重點實驗室,上海 200032)

粉防己(StephaniatetrandraS.Moore)是防己科(Menispermaceae)千金藤屬(Stephania)植物,屬常年生落葉纏繞草質藤本,野生態根莖常外露,葉紙質,呈闊三角形或近圓形,生長于陰濕的低山區或丘陵,主要分布在皖南、江西、廣西等地[1]。粉防己根作為一味重要的中藥材已有近2000 年的臨床應用歷史。傳統中藥學記載,防己具有祛風止痛、利尿、消腫等功效,可用于治療類風濕關節炎、濕疹和高血壓等疾病。近年來,隨著對粉防己主要活性成分的提取、結構鑒定和藥理作用等的深入研究,粉防己眾多寶貴的藥用價值逐漸得到挖掘和開發[2,3]。目前,研究已發現粉防己具有抗癌[4,5]、抗心律失常和心肌缺血[6]、抗肺纖維化[7]、抗炎鎮痛[8]和抗菌[9,10]等藥理作用。

研究表明,粉防己的活性成分主要有原小檗堿類、阿樸菲類和芐基異喹啉類等生物堿[11],其中以芐基異喹啉類生物堿的含量較為豐富,尤其是漢防己甲素(Tetrandrine)、漢防己乙素(Fangchinoline)、小檗胺(Berbamine)和千金藤素(Cepharanthine)等的含量最高[12]。雖然芐基異喹啉類生物堿的類群龐大且復雜,但是它們的生物合成途徑都起始于L-酪氨酸(L-tyrosine)[13]。L-酪氨酸經過間位羥基化、脫羧或轉氨基等多步反應,生成前體物質多巴胺(Dopamine)和對羥基苯乙醛(4-hydroxyphenylacetaldehyde)[14]。二者經過去甲烏藥堿合成酶(NCS)催化合成(S)-去甲烏藥堿[(S)-Norcoclaurine][15]。(S)-去甲烏藥堿在6-O-甲基轉移酶(6OMT)和N-甲基轉移酶(CNMT)的催化下依次生成烏藥堿[(S)-Coclaurine]和N-甲基烏藥堿[(S)-N-Methylcoclaurine][16-18]。而以N-甲基烏藥堿為底物,在各種酶的催化下,可生成黃蘆木堿(Berbamunine)、小檗胺、千金藤素、(S)-金黃紫堇堿[(S)-Scoulerine]、漢防己乙素和漢防己甲素等多種芐基異喹啉類生物堿[19-21](圖1)。

圖1 粉防己雙芐基異喹啉生物堿的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of dibenzylisoquinoline alkaloids in S.tetrandra

液質聯用技術是中藥質量研究領域的重要分析手段,以其強大的分離能力、極高的靈敏度,以及能夠提供化合物定性和定量信息能力的優勢,在植物代謝研究中起到非常重要的作用,具有廣闊的應用前景[22,23]。本研究利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜(UPLC-QQQ-MS/MS)技術,在多反應監測(MRM)模式下,建立1種快速檢測不同時空條件下粉防己根部樣本中雙芐基異喹啉生物堿代謝途徑中系列化合物含量的方法,為解析漢防己甲素等雙芐基異喹啉生物堿化合物分子合成機理提供代謝數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

原產地為云南省昆明市,移植栽培于廣西科學院實驗大棚的粉防己。選取長勢一致并具有良好代表性的粉防己植株,取其根部,用液氮速凍后放置于-80℃冰箱備用。

1.2 試劑

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純,Themo Fisher公司,美國),甲酸銨(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司,中國),對照品:L-酪氨酸、L-多巴、酪胺、對羥基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate)、鹽酸多巴胺、去甲烏藥堿、烏藥堿、N-甲基烏藥堿、小檗胺、漢防己甲素和漢防己乙素[分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司],千金藤素(色譜純,成都普瑞法科技開發有限公司)。

1.3 儀器

Agilent 1290 型超高效液相色譜儀、Agilent 6470型三重四極桿串聯質譜儀(Agilent Technologies公司,美國),真空冷凍干燥儀(SIM 公司,美國),HGC-12A 氮吹儀(天津市恒奧科技發展有限公司,中國),高通量研磨儀(寧波新芝生物科技股份有限公司,中國),超聲波清洗器(深圳市深華泰超聲洗凈設備有限公司,中國),低溫離心機(Eppendorf Innovation Company,德國),超純水儀(ELGA Lab Water公司,英國),鼓風干燥箱、渦旋混合器、電子天平等。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

分別于2020年3月15日、2020年6月15日、2020年9月15日和2020年12月15日采集粉防己根部樣品,依次編號為3月、6月、9月和12月,每批次3個生物學重復,經液氮速凍后放置于-80℃冰箱備用。參照Qiao等[24]的方法并適當改進,首先將-80℃保藏的樣品放置于真空冷凍干燥儀脫水干燥72 h,然后采用高通量研磨儀進行研磨(頻率60 Hz,時間1 min,批量研磨3次)。準確稱取樣品10 mg于2 m L離心管中,加入0.5 m L 70%(V/V)甲醇的水溶液,渦旋5 min,超聲提取20 min,離心,轉移上清液,重復萃取2次。合并萃取液并用氮吹儀干燥,用0.5 m L 70%(V/V)甲醇的水溶液復溶,用0.22 μm 針式有機過濾器過濾并置于進樣小瓶,上機檢測。

1.4.2 對照品溶液的配制

用電子天平分別精確稱取12個對照品各2 mg,用甲醇溶解,分別配置成濃度為1 mg/m L 的母液。精密移取對照品母液,用70%(V/V)的甲醇水溶液稀釋成1μg/m L 的單標工作液用于UPLC-QQQMS/MS檢測,以便建立化合物離子信息數據庫。精密移取12個對照品母液并混合,用70%(V/V)的甲醇水溶液定容,制成1、5、10、50、100和500μg/L,1、5、10和50 mg/L共10個濃度的混合對照品溶液。

1.4.3 超高效液相色譜條件

色譜柱為Poroshell 120 CS-C18(3.0 mm×150 mm,2.7μm,Agilent),流動相為含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液(A)-乙腈(B),流速為0.3 m L/min,柱溫為35℃,進樣量5μL,液相色譜梯度洗脫條件:0-1 min,95%A;1-10 min,95%A→20%A;12-13 min,20%A→95%A;13-15 min,95%A→95%A。

1.4.4 質譜條件

安捷倫噴射流技術離子源(AJS-ESI),正、負離子模式掃描,多反應監測。鞘氣溫度(Sheath gas temperature)250℃;鞘氣流速(Sheath gas flow)11 L/min;噴嘴電壓(Nozzle voltage)500 V;霧化器(Nebulizer)壓力35 psi;干燥器流速(Gas flow)5 L/min;干燥器溫度(Gas temperature)300℃。

1.5 方法學考察

1.5.1 樣品提取條件的優化

根據1.4.1節的樣品處理方法,對樣品的提取溶劑進行考察和優化。王亞冬等[25]研究表明,超聲溫度對植物總生物堿的提取率具有重要的影響。超聲溫度由室溫逐漸上升至60℃,生物堿類化合物隨著溫度的升高逐漸顯示出不穩定性,甚至發生物質分解;而溫度過高也會加速提取液的揮發,影響化合物的提取[25,26]。因此,本研究的提取溫度設定為30℃,超聲60 min。另外,考察40%、50%、60%、70%、80%和90%等不同比例甲醇水溶液提取劑對粉防己根部樣品主要化合物的提取率。從12種化合物中選擇兩種代表性的物質進行含量測定,其中酸類化合物考察對羥基苯丙酮酸,堿類化合物考察漢防己甲素。

1.5.2 色譜條件的優化

采用Poroshell 120 CS-C18色譜柱,正、負離子多反應監測模式進行分離和測定,考察含0.1%甲酸的水-甲醇、含0.1%甲酸的水-乙腈和含0.1%甲酸的甲酸銨水溶液-乙腈3種不同流動相的分離效果。

1.5.3 質譜條件考察

通過一級全掃(Full scan)及不同碰撞能下的二級數據,優化AJS-ESI參數。在全掃模式下確定適合的離子模式和母離子信息;在選擇性離子監測(SIM)掃描模式下尋找母離子最優的電壓;在子離子(Product ion)掃描模式下尋找子離子的信息。通過MRM 掃描確定定性和定量的母離子-子離子最優的碰撞能,以獲得最好的質譜響應。

1.5.4 線性關系考察取1.4.2節配制的混合對照品,在優化后的液相色譜/質譜檢測條件下進行測定,以峰面積(y)為縱坐標,質量濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線,樣品平行進樣3次,峰面積取平均值進行計算,繪制12種化合物的標準曲線,得到每個化合物的線性回歸方程和相關系數。實驗以70%的甲醇作為空白對照。

1.5.5 檢出限、定量限、精密度、穩定性、重復性考察

以3倍信噪比檢測得到的樣品化合物最低濃度或者最小量作為方法的檢出限(LOD);以10倍信噪比檢測得到的樣品化合物最低濃度或最小量作為方法的定量限(LOQ)[27,28]。

精密吸取1.4.2節配制的混合對照品,按照優化后的液相色譜/質譜檢測條件連續進樣6次,記錄12個物質對應的定量子離子總離子流圖的峰面積,計算各自的相對標準偏差(RSD),考察儀器的精密度。

按1.4.1節的方法配制粉防己根部樣品提取液,按照優化后的液相色譜/質譜檢測條件,每隔3 h進樣一次(0、3、6、9、12、15、18、21、24 h),記錄各化合物定量子離子總離子流圖的峰面積,計算各個化合物的RSD,考察儀器的穩定性[29]。

按1.4.1節的方法配制粉防己根部樣品提取液,共10份,按照優化后的液相色譜/質譜檢測條件進樣測定,記錄各化合物定量子離子總離子流圖的峰面積,計算各個化合物的RSD 以考察儀器的重復性。

1.6 樣品測定

按1.4.1節的方法配制3月、6月、9月和12月4個批次的粉防己根部樣品提取液,按照優化后的液相色譜/質譜檢測條件進樣測試。

2 結果與分析

2.1 樣品提取條件優化結果

兩類化合物的提取率如圖2所示,結果表明,采用70%的甲醇水溶液作為提取劑,兩類化合物均獲得最好的提取率。因此,本研究選取70%的甲醇水溶液作為提取劑。

圖2 不同比例的甲醇水溶液對對羥基苯丙酮酸和漢防己甲素提取率的影響Fig.2 Effect of different proportions of methanol water on the content of 4-hydroxyphenylpyruvate and tetrandrine

2.2 色譜條件優化結果

實驗結果顯示,以含0.1%甲酸的水-甲醇作為流動相,洗脫能力差,出現信號峰粘連分不開的現象;以含0.1%甲酸的水-乙腈作為流動相,分離效果有所改善,但峰型較寬;而以含0.1%甲酸的甲酸銨水溶液-乙腈作為流動相,分離效果最好,峰型更加尖銳。本研究最終使用含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸銨水溶液-乙腈作為流動相,按照1.4.3節的梯度洗脫條件進行洗脫。12種化合物的混合對照品的總離子色譜圖如圖3所示。

圖3 12種化合物的混合對照品的總離子色譜圖Fig.3 Total Ion Chromatogarms(TIC)of the mixed reference substances of 12 compounds

2.3 質譜條件考察結果

12個對照品的子離子信息如圖4所示。MRM掃描結果表明對羥基苯丙酮酸在負離子模式下的響應較好,其他11種化合物在正離子模式下信號較好,因此選擇電噴霧正、負離子模式檢測。優化后對照品的質譜條件信息如表1所示。

表1 12個對照品分析的質譜條件Table 1 Mass spectrum conditions for analysis of 12 reference substances

圖4 12個對照品的子離子信息及其對應的結構Fig.4 Product ion information and corresponding structure of 12 reference substances

2.4 線性關系考察結果

12種化合物的線性回歸方程和相關系數(R2)如表2所示。結果表明,12種化合物對應回歸方程的相關系數為0.992 11-0.999 95,在各自的線性范圍內線性關系良好。

表2 12種化合物的線性范圍、線性回歸方程和相關系數Table 2 Linear range,linear regression equation and linear coefficient of 12 compounds

2.5 檢出限、定量限、精密度、穩定性、重復性考察結果

如表3所示,對羥基苯丙酮酸的檢出限和定量限相對較高,分別為44.95 ng/m L 和149.84 ng/m L;而其他11 種化合物的檢出限和定量限分別為0.04-4.38 ng/m L 和0.13-14.60 ng/m L。12種化合物精密度RSD 為0.65%-7.03%,說明測定儀器的精密度良好。粉防己根部各化合物的穩定性RSD為1.55%-6.67%,說明供試品溶液(粉防己根部樣品提取液)在24 h內穩定。12種化合物的重復性RSD 為1.65%-7.47%,說明重復性良好,實驗結果均滿足定量分析要求。

表3 12種化合物的檢出限、定量限、精密度、穩定性、重復性Table 3 Limit of detection,limit of quantitation,precision,stability and repeatability of 12 compounds

2.6 樣品測定結果

對比混合對照品溶液和粉防己根部樣品提取液的UPLC-QQQ-MS/MS色譜圖(圖5),根據液相色譜共有峰并結合質譜數據對粉防己根部樣品提取液中的化學成分進行定性分析。實驗結果表明,粉防己根部樣品提取液中準確包含所研究的12 種化學成分。

圖5 混合對照品溶液和粉防己根部樣品提取液的UPLC-QQQ-MS/MS色譜圖Fig.5 UPLC-QQQ-MS/MS chromatogram of mixed reference solution and extract solution of the root of S.tetrandra

基于相對保留時間和定量子離子總離子流圖的峰面積對粉防己根部樣品提取液的12種化學成分進行含量分析。實驗結果如圖6所示,粉防己根部樣品中酪胺、對羥基苯丙酮酸、漢防己甲素和L-酪氨酸的含量相對較高,均在1 500μg/g 以上;而漢防己乙素、多巴胺、小檗胺和千金藤素的含量次之,它們的含量為100-500μg/g;L-多巴、去甲烏藥堿和烏藥堿的含量相對較低,均在50μg/g以下;在所有測試的化合物中,N-甲基烏藥堿含量最少,在1μg/g以下。N-甲基烏藥堿是合成多種芐基異喹啉生物堿的重要前體物質,其含量較低可能與其較高的生物合成利用率或者代謝速率有關。實驗測試得到的小檗胺、漢防己甲素、漢防己乙素和千金藤素在粉防己根中的含量與吳夢麗等[30]、楊帆等[31]的研究結果基本一致。此外,隨著月份的增加,L-酪氨酸、去甲烏藥堿和漢防己乙素的含量都有明顯的增加趨勢;而酪胺、L-多巴和千金藤素的含量則隨著月份的增加而減少;多巴胺的含量隨著月份的增加出現先增后減的趨勢,而小檗胺的含量隨著月份的增加則顯示出先減后增的趨勢?？傊?研究結果表明,粉防己根部各主要活性成分的含量存在著顯著的差異,同一化學物質的含量在不同的采集月份也有著明顯的差異。

圖6 粉防己根12種化合物在不同采集月份的含量變化Fig.6 Content variations of 12 compounds in root of S.tetrandra from different collection month

3 結論

本研究通過超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀快速測定粉防己在不同采集時期各代謝化合物的含量變化,建立了同時、高效、定量檢測粉防己根中雙芐基異喹啉生物堿代謝途徑中潛在的12種化合物的液相色譜、質譜檢測條件。對3月、6月、9月和12月4個不同批次采集的粉防己根部樣品的主要活性物質的測定結果表明,粉防己根中12種不同化合物的含量具有顯著差異,在不同的采集月份同一活性物質呈現出動態變化規律。