幾丁質降解菌的篩選及其降解蝦殼廢棄物的研究*

陳建榮,徐雨茶,陽麗艷,黃艷冰,楊登峰,潘麗霞**

(1.廣西科學院,非糧生物質能技術全國重點實驗室,廣西南寧 530007;2.廣西科學院,廣西海洋科學院(廣西紅樹林研究中心),廣西海洋天然產物與組合生物合成化學重點實驗室,廣西南寧 530007)

蝦蟹是世界漁業生產的重要產品,近年來每年蝦蟹總產量高達1 000萬噸,蝦蟹在剝離可食部分后會產生大量固體廢棄物,包括頭部、殼體和尾部[1],這些固體廢棄物在生產和消費過程中不可避免。然而,這些廢棄物在環境保護和資源利用方面具有巨大的潛力。蝦殼中含有約50%的蛋白質、20%的幾丁質以及天然抗氧化劑蝦青素等有價值的組分,這些組分在蝦殼中相互緊密結合,不能被動物有效消化吸收利用[1,2]。傳統的強酸堿等加工工藝破壞了蝦蟹殼中的蛋白質和其他有價值組分,會造成嚴重的環境污染和生物資源浪費[3]。在一些發達國家,處理蝦蟹殼廢棄物花費了高昂的成本[4]。因此,如何綜合利用蝦蟹殼廢棄物是亟需解決的問題,同時,如何降解動物難以消化吸收的幾丁質為高值的益生幾丁寡糖也是當今研究的熱點之一。

幾丁質,又稱甲殼素,是一種含氮多糖,由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-Nacetyl-D-glucosamine,Glc-NAc) 聚合而成,它是自然界中除纖維素外的第二大生物質,在甲殼類動物的外骨骼和大多數真菌的細胞壁中存在[5]。與纖維素等多糖不同,幾丁質是N-乙酰-D-氨基葡萄糖經β-1,4糖苷鍵聚合形成的含氮多糖,地球上幾丁質的含氮量超過人類通過Haber-Bosch方法(氮肥合成的方法)固定的氮氣總量,其產物N-乙酰-D-氨基葡萄糖及幾丁寡糖具有較好的生理功能。在哺乳動物中,N-乙酰-D-氨基葡萄糖是透明質酸和關節滑液合成的重要前體[6]。近年來的研究還發現蛋白質(包括轉錄因子)存在N-乙酰葡萄糖胺修飾,并調控了眾多的免疫激活、代謝調節等通路,這些機制賦予了幾丁寡糖豐富的生物學活性,包括美顏、緩解關節炎、血糖調節、抗腫瘤和抗炎作用等[7-9]。因此,越來越多的人開始關注幾丁質及其水解產物的價值。

目前工業上對蝦蟹殼廢棄物的利用主要是通過化學法去除蝦蟹殼廢棄物中的礦物質和蛋白質,再生產幾丁質、殼聚糖和幾丁寡糖等物質。Percot等[10]對現有化學法生產幾丁質的條件進行了優化,最終獲得了脫礦度和脫蛋白度都很高的幾丁質,但是處理過程中仍然會大量使用鹽酸和氫氧化鈉,不僅對環境造成嚴重污染,而且導致幾丁質N-乙酰值的變化從而影響產品品質。為了解決化學法降解蝦蟹殼中蛋白質等物質存在的問題,人們開始利用酶法和微生物法降解蝦蟹殼。酶法包括使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和消化酶等,但酶的成本較高、提取效率低。微生物法主要通過發酵過程中微生物產生的蛋白酶和有機酸實現脫蛋白和脫礦,從而使幾丁質暴露出來[3,7,11]。

微生物處理法的優點在于實現資源重新利用的同時不會產生過多對環境有害的物質,這種方法有潛力解決蝦蟹殼廢棄物處理的問題。然而,目前微生物處理法還處在探索階段,限制了其實際應用。此外,微生物降解蝦蟹殼涉及的過程也相對復雜,需要進一步研究和優化[8,12]。因此,本研究旨在尋找能夠高效降解蝦蟹殼的微生物,有效地將蝦蟹殼廢棄物轉化為有用的產物,如生物肥料、動物飼料或生物能源;優化目標微生物降解蝦蟹殼廢棄物的降解條件,實現蝦蟹殼廢棄物的綜合利用,減輕對環境的負荷。因此,研究蝦蟹殼降解微生物對資源利用和環境保護都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑和原料

蝦殼為溫州洞頭特產蝦殼(購自洞頭特產漁夫之家淘寶店),50℃烘箱烘干剪碎后過40目篩,滅菌烘干備用。

1.2 菌種土樣來源

將新鮮的土樣樣品活化并篩選出能高效降解幾丁質的細菌。這些土樣樣品分別從廣西河池市天峨縣川洞,巴馬瑤族自治縣長壽村,盤陽河流域,都安瑤族自治縣桃花水母天窗、九靈天窗,百色市樂業石圍天坑群等地采集。

1.3 培養基配方

配方中含有糖的培養基滅菌溫度為115℃,時間為持續15 min;而其他培養基的滅菌溫度為121℃,時間為持續20 min。

(1)液體富集培養基1 000 m L:FeSO4·7 H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.6 g,膠體幾丁質10 g,K2HPO40.7 g,KH2PO40.3 g,初始p H 值7.0。

(2)分離培養基1 000 m L:K2HPO40.3 g,NaCl 0.1 g,FeSO4·7 H2O 0.01 g,NH4Cl 0.1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO40.7 g,膠體幾丁質10 g,瓊脂15-20 g,初始p H 值7.0。

(3)種子培養基1 000 m L:葡萄糖4 g,KH2PO40.7 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7 H2O 0.6 g,酵母粉2 g,蛋白胨2 g,p H 值7.0。

(4)發酵培養基1 000 m L:果糖2 g,KH2PO40.7 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.6 g,酵母粉0.5 g,牛肉膏4 g,蛋白胨4 g,初始p H 值8.0。

1.4 富集培養

取1 g土壤樣品加入30 m L 無菌水中,30℃、200 r/min培養6 h,充分混合后,取上清液置于富集培養基中,30℃、150 r/min恒溫搖床下培養3 d,得到富集的菌樣。

1.5 幾丁質降解菌的篩選與純化

平板透明圈法是篩選幾丁質菌的一種高效方法,即在固體培養基中加入溶解性差、可被微生物利用的營養成分,造成渾濁、不透明的培養基背景,待篩選的菌落附近就會形成透明圈,透明圈的大小反映了菌落降解此物質的能力[13,14]。吸取富集菌的培養液按10-3-10-4梯度稀釋后,每個稀釋梯度取100μL 均勻地涂覆在分離培養基中并于30℃恒溫培養箱中倒置培養,定期觀察。挑取菌落周圍出現透明圈較大的菌落進行4區劃線純化。

1.6 菌株的鑒定

以27F 和1492R 作為引物,以菌體作為模板。按表1配制成25μL的體系后進行PCR 反應擴增并對PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳。選出有目的片段的PCR 產物,送至生工生物工程(上海)股份限公司測序,測序結果提交美國國家生物技術信息中心(NCBI)官網上的BLAST 對16S r DNA 序列進行分析,確定菌株的分類地位。實驗使用25μL體系進行PCR 擴增,程序建立如表2所示,反應共30個循環。

表2 PCR 程序Table 2 PCR procedure

1.7 產幾丁質酶菌種直徑比的測定

將篩選到的菌種接種于種子培養基中,25℃、180 r/min培養12 h,用牙簽蘸取少量菌液接種于分離培養基中并于30℃恒溫培養箱中倒置培養,定期測量透明圈和菌株的大小,并通過兩者的比值確定該菌株的直徑比。

1.8 幾丁質粗酶活力測定

1.9 產幾丁質酶菌株降解蝦殼條件的優化

取蝦殼烘干并剪碎后過40目篩,滅菌后烘干備用。將C.aquatilegxas1菌種接種于種子培養基中,25℃、180 r/min培養12 h,接種于100 m L 發酵培養基中,培養24 h后,按照2%的添加量加入過篩后的蝦殼進行發酵試驗條件優化,通過不同培養條件發酵后蝦殼的損耗量選擇最佳培養條件。

1.9.1 氮源對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響

以不加蝦殼廢棄物的發酵培養基為對照組,在溫度為30℃、p H 值為7的發酵條件下發酵7 d,選擇牛肉膏(0.8%)、蛋白胨(0.8%)、麥芽提取物(0.8%)以及牛肉膏+蛋白胨(0.4%+0.4%)作為氮源,探究不同氮源對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響,每組設3個平行樣,其他培養基成分為葡萄糖2 g/L,KH2PO40.7 g/L,K2HPO40.3 g/L,MgSO4·7 H2O 0.6 g/L,酵母粉0.5 g/L。

1.9.2 碳源對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響

在溫度為30℃、p H 值為7的發酵條件下發酵7 d,選擇葡萄糖、果糖、蔗糖以及麥芽糖作為碳源探究不同碳源對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響,每組設3個平行樣,其他培養基成分為KH2PO40.7 g/L,K2HPO40.3 g/L,MgSO4·7 H2O 0.6 g/L,酵母粉0.5 g/L,牛肉膏4 g/L,蛋白胨4 g/L。

1.9.3 發酵時間對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響

在溫度為30℃、p H 值為7的發酵條件下,確定最優碳源和氮源后,設置發酵時間分別為3、5、7、9 d,每組設3個平行樣,探究不同發酵時間對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響。

1.9.4 發酵溫度對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響

在p H 值為7、最優碳源和氮源的發酵條件下發酵9 d,設置發酵溫度分別為20、25、30、37℃,每組設3個平行樣,探究發酵溫度對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響。

1.9.5 發酵接種量對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響

在溫度為20℃、p H 值為7、最優碳源和氮源的發酵條件下發酵9 d,設置發酵接種量分別為0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%,每組設3個平行樣,探究發酵接種量對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響。

1.9.6 初始p H 值對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響

在溫度為20℃、最優碳源和氮源、接種量為2.0%的條件下發酵9 d,設置發酵初始p H 值分別為6.0、7.0、7.2、8.0,每組設3個平行樣,探究初始p H值對產幾丁質酶菌株降解蝦殼能力的影響。

1.10 蝦殼降解率的測定

稱取經過發酵處理或未經發酵處理的蝦殼0.2 g,烘干,稱重,得到經過發酵處理或未經發酵處理的干蝦殼的重量,根據公式計算發酵處理后蝦殼的降解率。計算公式如下:

式中,X為蝦殼的降解率,m0為未經發酵處理的干蝦殼的質量,m為經過發酵處理的干蝦殼的質量。

1.11 微生物降解蝦殼過程中的生長曲線及p H 值變化

將C.aquatilegxas1菌種接種于種子培養基中,30℃、160 r/min培養24 h,得到活化菌液。取活化菌液以2.0%接種量接種于100 m L發酵培養基中培養24 h后得到菌液,在所得菌液中加入2 g蝦殼,20℃發酵培養9 d,每12 h 取發酵液,檢測發酵液的OD600和p H 值。

1.12 蛋白質含量測定

在最佳條件下發酵,發酵結束后,離心,棄上清,沉淀為樣品蝦殼。以未經過發酵處理的相同質量的蝦殼為對照,利用凱式定氮法[16]檢測兩種蝦殼中蛋白質的含量。具體檢測方法:將蝦殼(經過發酵處理的樣品蝦殼或未經過發酵處理的蝦殼)分別用15 m L 1 mol/L NaOH處理4 h(攪拌2 h,60℃干燥箱放置2 h)進行脫蛋白處理,處理結束后12 000 r/min離心10 min,取上清液作液體樣品;用等量的1 mol/L NaOH 為空白對照;在實驗組和空白對照組分別加入3 g催化劑(硫酸銅和硫酸鉀)和10 m L 濃硫酸進行消化,然后放入消化爐中,蓋上漏斗蓋子,同時打開水閥循環吸收氣體;冷卻之后將50 m L 水倒入消化管中(加水前先將樣品搖勻),然后每個管加入過量NaOH;打開自動定氮儀,首先用水清洗一遍機子,然后開始過樣品,同時放置裝有硼酸的接收瓶(每個樣5 min),最后在裝有硼酸的接收瓶里加入指示劑進行鹽酸滴定、空白滴定,液體顏色由藍變紅即為滴定終點。計算公式如下:

式中,X為蛋白質含量,V1為空白對照滴定消耗的標準溶液(m L),V2為樣品滴定消耗的標準溶液(m L),c為鹽酸標準溶液的濃度(mol/L),m為樣品質量(g),0.014為氮的毫摩爾質量(g/mmol),F為蛋白質系數,100 為單位換算系數。根據公式計算脫蛋白率。

脫蛋白率(%)=(未經發酵處理的蝦殼中蛋白質的含量-樣品蝦殼中蛋白質的含量)/未經發酵處理的蝦殼中蛋白質的含量×100%。

1.13 幾丁質含量的測定

根據張恒[17]的方法提取幾丁質。分別稱取經過發酵處理或未經發酵處理的蝦殼0.2 g 與15 m L 1 mol/L NaOH 溶液混合后放到攪拌器上攪拌30 min,接著放入干燥箱內干燥2.5 h,重復兩次;然后離心機離心(12 000 r/min、5 min),倒掉上清后用水將蝦殼反復離心清洗至中性;再取15 m L 2 mol/L HCl溶液和蝦殼一起倒入小燒杯中常溫攪拌3 h,結束后離心機12 000 r/min離心5 min,棄上清液并用去離子水反復沖洗并離心,直至p H 為中性,最后放入干燥箱內干燥后稱重,得到經過發酵處理或未經發酵處理的蝦殼中幾丁質的含量。其中用NaOH 和HCl溶液處理的目的是分別去除蝦殼中的蛋白質和鈣離子。計算幾丁質的回收率。

幾丁質的回收率(%)=(未經發酵處理的蝦殼中幾丁質的含量-經發酵處理的蝦殼中幾丁質的含量)/未經發酵處理的蝦殼中幾丁質的含量×100%。

2 結果與分析

2.1 幾丁質降解菌的篩選及其分離純化

樣品經富集培養、分離純化后得到了4株具有降解幾丁質能力的細菌。表3是經過篩選得到的4株菌株的測序鑒定結果,其中粘質沙雷氏菌Serratia marcescensgxas3 與S.marcescensstrain 27F 相似性為98.41%,蠟樣芽孢桿菌B.cereusgxas5與B.cereusstrain NS26相似性為99.36%,嗜麥芽糖窄食單胞菌Stenotrophomonasmaltophiliagxas7與S.maltophiliastrain BF4-4相似性為99.45%,水生幾丁質菌C.aquatilegxas1 與C.aquatilestrain PS4R-81相似性為97.5%。

表3 菌株測序鑒定結果Table 3 Results of sequencing identification of strains

2.2 菌落透明圈及粗酶活力測定

如表4所示,B.cereusgxas5的直徑比最大,為4.8,其次為C.aquatilegxas1 和Serratiamarcescensgxas3,Stenotrophomonasmaltophiliagxas7最小。

表4 菌落透明圈直徑Table 4 Diameter of colony transparent circle

選擇B.cereusgxas5、Serratiamarcescensgxas3和C.aquatilegxas1進行粗酶活力測定,探究不同菌株的產酶情況,結果如圖1所示。這3株菌在不同時期其產酶活力也不同,其中S.marcescensgxas3在發酵72 h時粗酶活力最高,達到0.20 U/m L;B.cereusgxas5 在發酵36 h 時粗酶活力最高,達到0.158 U/m L;C.aquatilegxas1在發酵96 h時粗酶活力最高,達到0.244 U/m L。

圖1 幾丁質高效降解菌株粗酶活力Fig.1 Crude enzyme activity of chitin-degrading strain

2.3 蝦殼最適降解發酵條件優化

2.3.1 氮源的優化

氮源對發酵降解蝦殼廢棄物的降解率如圖2所示。采用菌株C.aquatilegxas1處理蝦殼,培養基以牛肉膏+蛋白胨為氮源時的降解能力最強,為48%,比牛肉膏、蛋白胨和麥芽提取物分別高4%、4%和2%,因此選擇牛肉膏+蛋白胨(0.4%+0.4%)為發酵氮源。

圖2 氮源對蝦殼降解的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on shrimp shell degradation

2.3.2 碳源的優化

由圖3可知,4種碳源對菌株C.aquatilegxas1的產量和生長狀況的影響存在差異,其中以果糖作為碳源為C.aquatilegxas1提供能量時對蝦殼的降解率最高,為50%,而以麥芽糖和葡萄糖作為碳源時對C.aquatilegxas1的影響較大,其中蔗糖對蝦殼的降解率最低,為37%。因此選擇果糖作為發酵培養基的碳源。

圖3 碳源對蝦殼降解的影響Fig.3 Effects of carbon sources on shrimp shell degradation

2.3.3 發酵時間的優化

發酵時間對蝦殼降解影響較大。如圖4所示,當菌株C.aquatilegxas1對蝦殼發酵到第9 d時,降解能力最優。

圖4 發酵時間對蝦殼降解的影響Fig.4 Effects of fermentation time on shrimp shell degradation

2.3.4 發酵溫度的優化

發酵溫度對蝦殼降解的影響如圖5所示。當溫度為20℃時,菌株C.aquatilegxas1對蝦殼的降解能力最優。

圖5 發酵溫度對蝦殼降解的影響Fig.5 Effects of fermentation temperatures on shrimp shell degradation

2.3.5 發酵接種量的優化

發酵接種量對蝦殼降解的影響如圖6所示。當發酵接種量為2.0%時,菌株C.aquatilegxas1對蝦殼的降解能力最強;當菌液接種量小于2.0%時,C.aquatilegxas1對蝦殼的降解能力有所下降。因此,采用C.aquatilegxas1降解蝦殼時,最佳菌液接種量為2.0%。

圖6 發酵接種量對蝦殼降解的影響Fig.6 Effects of fermentation inoculation amount on shrimp shell degradation

2.3.6 發酵培養基初始p H 值的優化

微生物在生長代謝過程中會引起培養環境p H值的變化,p H 值過高或過低都會影響其進一步的生長。如圖7所示,當發酵培養基初始p H 值分別為6.0、7.0、7.2、8.0時,菌株C.aquatilegxas1對蝦殼的降解能力差別較小。當初始p H 值為8.0 時,C.aquatilegxas1對蝦殼的降解能力最強,為46%。

圖7 發酵培養基初始p H 值對蝦殼降解的影響Fig.7 Effects of initial p H values of fermentation media on shrimp shell degradation

2.4 菌株C.aquatile gxas1降解蝦殼過程中的生長狀況及p H 值變化

如圖8所示,C.aquatilegxas1在降解蝦殼過程中,OD600值在加入蝦殼的第1天至第2天呈快速上升趨勢,第2天至第7天緩慢上升,菌株生長趨于穩定。如圖9所示,p H 值在加入蝦殼的前兩天呈快速上升趨勢,之后呈緩慢上升趨勢。

圖8 菌株C.aquatile gxas1降解蝦殼的生長曲線Fig.8 Growth curve of strain C .aquatile gxas1 in the treatment of shrimp shell

圖9 菌株C.aquatile gxas1降解蝦殼的p H 值變化曲線Fig.9 p H value variation curve of strain C.aquatile gxas1 in the treatment of shrimp shell

2.5 菌株C.aquatile gxas1發酵蝦殼最優試驗

單因素優化試驗得出,C.aquatilegxas1發酵蝦殼試驗最優發酵培養基碳源為果糖、氮源為牛肉膏+蛋白胨,最優發酵條件初始p H 值為8.0、接種量為2.0%、發酵天數為9 d、發酵溫度為20℃。在最優條件下進行菌株降解蝦殼試驗,最終得出C.aquatilegxas1對蝦殼的降解率為60%,其中幾丁質回收率為87%、脫蛋白率為76.77%。

3 討論

與傳統對環境污染嚴重的化學法和能耗高的物理法相比,利用微生物發酵法降解蝦蟹殼廢棄物中的幾丁質和蛋白質是一種更綠色環保、成本更低的方法,可進一步作為未來實現綠色降解蝦蟹殼廢棄物的方向。本研究篩選到一株能夠降解幾丁質的菌株C.aquatilegxas1并探究其降解蝦蟹殼的能力。通過單因素優化試驗確定了培養基的最佳碳源為果糖(0.2%),最佳氮源為牛肉膏+ 蛋白胨(0.4% +0.4%);最優發酵條件初始p H 值為8.0,接種量為2.0%,培養溫度為20℃。在上述最優條件下,菌株C.aquatilegxas1在第9 d時達到蝦殼最大降解率60%,其中,脫蛋白率為76.77%,幾丁質回收率為87%,優于銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa[18]、植物乳桿菌和蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis[19]。表5列舉了近年來微生物降解蝦殼廢棄物的一些研究。Li等[20]利用發酵乳桿菌L.fermuntum使蝦殼脫蛋白率、脫礦率以及幾丁質回收率分別為89.48%、85.11%和16.30%。菌酶連用、連續發酵或共發酵可提高蝦殼的脫蛋白率和脫礦率。Zhang等[21]利用S.marcescensB742 和L.plantarumATCC 8014對蝦殼進行處理,蝦殼的脫礦率和脫蛋白率分別為93%和94.50%。Zhang等[22]采用枯草芽孢桿菌B.subtilis和巴氏醋桿菌A.pasteurianus、Liu等[23]采用鼠李糖乳桿菌L.rhamnoides和戊酸芽孢桿菌B.amyloliquefaciens對蝦殼進行共發酵,蝦殼的脫礦率和脫蛋白率均達到90%以上。影響微生物降解蝦殼的因素主要包括發酵p H 值、接種量、溫度、預處理和發酵時間等。嚴金紅等[26]研究發現,不同有機酸對蝦殼的軟化程度不同。Rao等[27]通過調節發酵初始p H 值以及調節發酵過程中糖的添加量,發現發酵過程中p H 值的變化對蝦殼中灰分和蛋白質的去除有較大影響。

表5 微生物降解蝦殼國內外研究Table 5 Domestic and foreign research on microbial degradation of shrimp shell

本研究只測定了菌株C.aquatilegxas1發酵蝦殼后的蛋白質和幾丁質含量變化,其脫礦率及產物等仍需要進一步分析。除此之外,連續發酵或共發酵也被用于降解蝦殼,未來仍需進一步探究C.aquatilegxas1與其他菌株連續發酵或共發酵對蝦殼降解率的影響,為微生物降解蝦蟹殼提供理論依據。

4 結論

對來源于廣西河池市和百色市的土壤進行富集培養,分離純化后得到4株能夠降解幾丁質的菌株Serratiamarcescensgxas3、B.cereusgxas5、Stenotrophomonasmaltophiliagxas7以及C.aquatilegxas1。對Serratiamarcescensgxas3、B.cereusgxas5以及C.aquatilegxas1 進行粗酶活力測定發現C.aquatilegxas1 的酶活力在96 h 時最高,為0.244 U/m L。

利用C.aquatilegxas1對蝦殼進行降解,通過對比處理前后蝦殼的干重以及蛋白質、幾丁質含量的變化發現C.aquatilegxas1對蝦殼具有較好的降解能力。利用單因素試驗對發酵培養基和發酵條件進行優化,結果顯示C.aquatilegxas1發酵蝦殼的最優條件是以果糖(0.2%)作為碳源、牛肉膏+蛋白胨(0.4%+0.4%)作為氮源,發酵溫度為20℃、培養基初始p H 值為8.0、接種量為2.0%,在此條件下發酵9 d時C.aquatilegxas1 對蝦殼的降解率最大,為60%,其中脫蛋白率為76.77%,幾丁質回收率為87%。研究結果表明,在優化條件下,C.aquatilegxas1對蝦殼具有較好的降解能力,可以用于廢棄蝦蟹殼的資源化利用,為實現綠色降解蝦蟹殼廢棄物提供了研究思路。本研究結果將有助于減少蝦蟹殼廢棄物對環境的污染,促進蝦蟹養殖業的可持續發展。