磷酸化修飾介導的病原微生物致病機制研究

林念念，甄向凱，歐陽松應，2

(1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.福建師范大學南方生物醫學研究中心，福建 福州 350117)

病原微生物是一類能夠侵染人和動植物并引發疾病甚至死亡的微生物，又稱病原體。病原微生物的侵染嚴重威脅到了人和動植物的健康，并對社會造成巨大經濟損失。在病原菌感染過程中，宿主雖然會識別入侵的病原菌，通過促炎信號通路等先天免疫系統保護自身[1]，然而，病原微生物會通過特殊的注射器樣的分泌系統向宿主釋放一系列效應蛋白，廣泛干擾宿主免疫通路，如 NF-κB信號通路、細胞程序性死亡信號通路等，以此來躲避宿主免疫系統的識別，這一過程即免疫逃逸(Immune evasion)[2]。

近期發現許多新穎的效應蛋白介導的翻譯后修飾，如谷氨酰胺 ADP-核糖基化[3]、腺苷酸化修飾和去腺苷酸化修飾[4]、ADP-核糖脫氨環化(ADPR-deacylization[5-6])、谷氨酸化修飾[7]等。最近研究發現，許多效應蛋白具有保守的絲/蘇氨酸激酶(Serine/Threonine Kinase，STK)結構域，具有激酶活性，通過磷酸化宿主關鍵蛋白，調節宿主的先天免疫反應，進而促進增殖[8]。

磷酸化修飾(Phosphorylation)是一種常見的翻譯后修飾，指在激酶的介導下，將ATPγ位的磷酸基團轉移到特定氨基酸的羥基上[9]，其中絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸最常見[8]。絲/蘇氨酸激酶的結構具有顯著的保守性，結構域中較小的N端主要參與磷酸供體ATP分子的結合與定向，將γ磷酸基團從ATP轉移到底物蛋白磷酸化受體(圖1)，而較大的C端負責與底物蛋白結合并啟動磷酸基團的轉移[10-11]。

(a)小鼠蛋白激酶的晶體結構(蛋白質數據庫PDB登錄號為1ATP)，小鼠蛋白激酶A的N端結構為白色，C端為小麥色；(b)小鼠蛋白激酶A絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結構域的N端和C端葉之間形成的催化裂隙，其中，ATP用綠色棍狀表示，兩個錳離子用紫色球狀表示；(c)結核分枝桿菌效應蛋白PknB和抑制劑肽復合物的晶體結構(PDB登錄號為1MRU)，其中，ATP用黃色棍狀表示，兩個錳離子用青色球狀表示；(d)蛋白激酶A和結核分枝桿菌PknB的三級結構的疊加，蛋白激酶A為白色，PknB為粉色。圖1 絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結構域的結構[8]Fig.1 Structure of the Ser/Thr kinase catalytic domain

蛋白激酶是藥物研究的重要靶標之一，設計針對蛋白激酶的抑制劑一直是人類疾病相關藥物研究和藥物開發方面最活躍的領域之一。激酶在真核細胞中廣泛存在，在人類基因組中已經鑒定出數百種激酶和數千種激酶底物。1995年，日本批準了RHO激酶抑制物——法舒地爾用于治療腦血管痙攣。1999年，美國FDA批準西羅莫司用于預防器官排斥反應[12]，成為第一個進入美國市場的激酶抑制劑，它是雷帕霉素(mTOR)的特異性抑制劑。2001年伊馬替尼獲得FDA批準，被認為是激酶抑制劑開發過程中的一個關鍵里程碑[13]。2019年fedratinib被批準用于治療JAK相關自身免疫疾病，JAK是輔助性T細胞(TH1、TH2和TH17)免疫反應的關鍵成分，因為它們是許多細胞因子的二級信使，包括干擾素和白細胞介素[14]。

最近研究發現原核生物中普遍存在絲/蘇氨酸活性的蛋白激酶[15]。細菌中發現的第一個具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白是黃色粘球菌蛋白Pkn1，研究者發現，當Pkn1在大腸桿菌中過表達時，其絲氨酸/蘇氨酸殘基會進行自我磷酸化修飾[16]。隨著原核生物基因組測序數據的日益龐大，在越來越多致病菌屬鑒定出了具有絲/蘇氨酸激酶活性的效應激酶，如肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[17]、假單胞菌(Pseudomonasspp.)[18]、大腸桿菌鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)[19-20]、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)[21]、肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)[22]、單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)[23]、嗜熱菌(Thermusthermophiles)[24]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[25]和結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)[26]等。

介紹病原菌中有絲/蘇氨酸激酶活性的效應蛋白，討論其逃避宿主免疫系統的作用機制，這些效應蛋白可以作為病原微生物感染潛在靶標，更好地幫助推進病原菌的防治研究。

1 耶爾森氏菌YpkA通過磷酸化宿主Gɑq影響細胞骨架調控

耶爾森氏菌(Yersinia)是引起人類腸道疾病、遠東星紅熱等疾病的致病菌，可引發嚴重鼠疫，包括11種菌種，其中對人體具有致病性的包括鼠疫桿菌(Yersiniapestis)、假結核桿菌(Yersiniapseudotuberculosis)和小腸結腸炎菌(Yersiniaenterocolitica)，它們均通過T3SS分泌系統轉運效應蛋白侵染宿主細胞[27]。YpkA是耶爾森氏菌Ⅲ型蛋白系統分泌的效應蛋白，在假結核桿菌中也稱為YopO，在耶爾森氏菌發揮毒力的作用過程中不可或缺[28]。YpkA的N端與真核生物絲氨酸/蘇氨酸激酶RhoA具有序列同源性和結構相似性，促進YpkA的轉運和分泌，C端包含一個Rho GTP結合結構域，與宿主細胞中的GTP酶RhoA和Rac相互作用，破壞宿主的細胞骨架組織[29]。YpkA是一個特殊的具有激酶活性的效應蛋白，然而，單獨YpkA并沒有激酶活性，只有當YpkA的C端結合上肌動蛋白actin后，YpkA激酶活性才被活化[30]。研究表明，YpkA的激酶活性對于假結核耶爾森菌侵染小鼠并發揮毒性起到至關重要的作用[31]。具體來說，YpkA作用于宿主細胞RhoA的上游，YpkA磷酸化Gɑq上的絲氨酸殘基，以阻止Gɑq-GTP的相互作用，從而抑制Gɑq的激活[32]；由于G異三聚體蛋白Gɑ12/13和Gɑq是G蛋白偶聯受體(GPCR)介導的肌動蛋白重排中RhoA活性的調節因子，從而對RhoA產生抑制作用，改變宿主細胞中的肌動蛋白絲結構[32]。這些研究結果表明，YpkA通過影響肌動蛋白細胞骨架重排，阻礙宿主對病原菌的吞噬作用[33]。

2 致病性大腸桿菌NIeH磷酸化核糖體S3干擾NF-κB通路并阻止細胞凋亡

NF-κB(nuclear factor-κB)信號通路在對抵抗入侵病原微生物感染過程中發揮重要功能。NF-κB信號通路的激活促使中性粒細胞向胃黏膜的募集和浸潤增強，并引發顯著的炎癥反應；NF-κB是一類通過結合B細胞免疫球蛋白κ親鏈基因的增強子序列來行使調控轉錄功能的細胞核轉錄因子，NF-κB特異結合不同功能靶基因來影響細胞信號轉導[34]。目前發現很多病原微生物效應蛋白可以通過影響NF-κB信號通路而促進其感染。

致病性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli(EHEC)O157：H7)的NIeH家族效應蛋白激酶NIeH1和NIeH2具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，NIeH1通過結合核糖體蛋白S3干擾NF-κB通路并阻止細胞凋亡。核糖體蛋白S3(ribosomal protein S3，RPS3)具有核酸內切酶活性，是NF-κB的共激活因子[35]；它不僅在核糖體組裝和行使功能中起著關鍵作用，在細胞周期、凋亡、炎癥反應和病原體感染等過程中也發揮著重要作用。研究顯示NIeH1與RPS3結合抑制Ikk-β依賴的Ser209磷酸化和RPS3轉位到細胞核，使轉錄激活被抑制。NleH2刺激RPS3的磷酸化并激活NF-κB通路[36]，也有研究報道，當Ikk-β過表達時，NleH1和NleH2都能抑制NF-κB通路。致病性大腸桿菌通過激活或抑制NF-κB這一重要通路[37]，干擾宿主先天免疫通路，幫助實現成功侵染宿主細胞的目的。

3 沙門氏菌SteC磷酸化宿主MEK1促進SCV形成

沙門氏菌是一類常見的食源性致病菌，可侵染人體并引發一系列病癥，嚴重時甚至導致死亡。沙門氏菌入侵宿主后形成一個含沙門氏菌的液泡(salmonella-containing vacuole，SCV)，在膜包裹的小泡內復制，它的復制也與SCV周圍的F-肌動蛋白網相關[38]。SCV的形成需要沙門氏菌T3SS分泌的效應蛋白，沙門氏菌中有兩套編碼三型分泌系統(T3SS)效應蛋白的基因，分別為沙門氏菌致病島Ⅰ(Salmonellapathogenicity island Ⅰ，SPI-1)和沙門氏菌致病島Ⅱ(Salmonellapathogenicity island Ⅱ，SPI-2)[39]。SteC是沙門氏菌T3SS SPI-2分泌的一個效應蛋白，與人類激酶Raf-1比較發現其序列具有保守的激酶活性結構域，包括在ATP結合中起著關鍵作用的核苷酸定位基序Gly-X-Gly-X-X-Gly等[39]。研究發現，SteC的激酶活性在干擾宿主的免疫防御反應過程中起到重要作用，SteC的表達可以誘導F-肌動蛋白重排[40-41]，使SCV表面富集肌動蛋白[42]。研究報道，SteC能夠磷酸化MEK的第200位絲氨酸，導致第218位和第222位絲氨酸的自磷酸化，從而促進MEK1的激活[41]。這表明，沙門氏菌SteC磷酸化宿主MEK1激活MEK/ERK/MLCK通路，調節肌球蛋白ⅡB介導的F-肌動蛋白重排[43]，促進SCV形成，進而促進沙門氏菌的侵染與增殖。

4 黃單胞菌XopC2磷酸化宿主OSK1抑制植物氣孔關閉

在植物中，病原體主要通過植物氣孔入侵植物組織，而植物通過關閉氣孔以抵御病原體的入侵[44]。黃丹胞菌屬(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)T3SS效應蛋白XopC2屬于絲/蘇氨酸激酶，在水稻中表達XopC2使得水稻對稻瘟病黃單胞菌更敏感，表明具有激酶活性的XopC2在黃單胞菌稻瘟病的發生過程起重要作用[45]。在病原體侵染后表達XopC2的水稻植株中觀察到氣孔無法正常閉合，表明XopC2可以靶向氣孔閉合的調控。研究證實XopC2的底物為SCF(SKP，cullin，and F-box E3 ubiquitin-protein ligase complex)，而SCF復合體可以通過介導茉莉酸信號(jasmonic acid signaling，JA signaling)JAZ的降解，參與調節氣孔關閉[46]，SCF復合物的接頭蛋白OSK1與茉莉酸酮酯受體OsCOI1b結合后，會促進低水平的JAZ泛素化和降解，激活JAZ[46]。而JAZ信號的激活會抑制氣孔關閉，促進細菌的侵入和感染。XopC2增強了JAZ9的泛素化降解途徑[44]，并可以直接磷酸化OSK1 53位絲氨酸，增強OSK1與茉莉酸酮酯受體OsCOI1b的親和力，特異性增強JAZ的泛素化和蛋白酶體降解，激活JAZ信號，抑制氣孔關閉引起侵染植物致病[44]。同時，pull down實驗顯示XopC2也與OSK1相互作用，表明黃丹胞菌屬效應蛋白XopC2利用穩定的相互作用來磷酸化宿主底物[44]。

5 志賀氏菌OspG結合宿主E2泛素結合酶干擾宿主免疫反應

志賀氏菌(Shigella)是一種革蘭氏陰性病原菌，可破壞腸道黏膜，引起痢疾。它利用一種特殊的稱為Ⅲ型分泌系統的裝置，向宿主分泌20多種效應蛋白，影響宿主的胞內信號傳遞過程從而促進病原菌的存活與增殖[47]。OspG在志賀氏菌感染的后期發揮作用，它具有一個N端信號肽和激酶結構域。通過酵母雙雜交，發現OspG可與自由的泛素或者多個E2泛素結合酶，如UbcH5b、UbcH5c、UbcH7、UbcH9 和RIG-B等相互作用[48]，研究表明與泛素的結合可以增強OspG的激酶活性[43]；OspG通過結合E2泛素結合酶，影響宿主胞內的泛素化修飾，使其免疫相關信號通路受阻，從而逃逸宿主的免疫系統的監視。

其中，OspG與UbcH7～Ub的親和力最高，OspG通過C端與UbcH7～Ub復合物中Ub的第44位異亮氨酸的疏水區域結合，阻止UbcH7結合E3泛素連接酶，從而干擾UbcH7招募E3連接酶，抑制泛素化途徑[49]。OspG也與Ubc5c～Ub存在相互作用，Ubc5c～Ub結合OspG觸發其激酶活性，與UbcH7～Ub的結合位點不同，Ubc5c通過保守的F62與OspG的L99、P102、F154、Y80形成較強的的疏水相互作用[50]。UbcH5c-Ub復合物中的UbcH5c也與OspG的N端(殘基D47，A78，F79，Y80，G81，E83)和鉸鏈段(殘基L99，R100，P102)殘基相互作用[51]。通過上述相互作用結合宿主內E2泛素結合酶，抑制宿主泛素化過程，使宿主細胞信號轉導網絡受到干擾無法正常進行。

6 嗜肺軍團菌絲/蘇氨酸激酶干擾宿主翻譯后修飾引發疾病

嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila，LP)是一種兼性寄生的病原細菌，可入侵變形蟲或人類的巨噬細胞[52]，最早發現于1976年美國費城退伍軍人的會議，常存在于冷卻塔、空調冷凝水等。該菌借助變形蟲或巨噬細胞的胞吞過程進入細胞，之后存在于LCV(含有LP的囊泡)的吞噬體中，該囊泡不與溶酶體結合。相反，其吞噬體膜很快被改造，并被轉化為在蛋白和脂質組成與內質網膜高度相似的結構，使得其不被細胞介導的免疫體系識別和清除。在這層膜的保護下，細菌大量繁殖，引發“軍團菌病”非典型肺炎[53]。研究發現，軍團菌的致病性取決于一套名為Dot/Icm(細胞器運行缺失/細胞內繁殖)的IV型分泌系統[54]，借助于這一特殊的Dot/Icm分泌系統，軍團菌向宿主細胞注入大量效應蛋白，這些效應蛋白通過干擾寄主的多個細胞過程，癱瘓其對細菌的殺滅能力，從而允許細菌在囊泡內大量增殖，導致組織損傷和炎癥反應，引起疾病的發生。

軍團菌是目前為止發現具有效應蛋白最多的病原菌(約330多個效應蛋白)，這些效應蛋白廣泛參與宿主的免疫反應，特別是翻譯后修飾被證明在其致病過程中發揮重要作用。目前在軍團菌中鑒定了多種效應蛋白介導的翻譯后修飾，例如獨立于E1-E2的泛素化修飾[55]，谷氨酸化修飾[7]、Lot家族去泛素酶介導的去泛素化修飾[56-58]、腺苷酸化修飾[4]、ADP-核糖基化修飾[59]等。研究發現磷酸化修飾在軍團菌感染過程中同樣發揮重要作用(見圖2)，據報道，軍團菌基因組至少編碼13個激酶[60]，其中有6個保守的效應蛋白序列和真核生物絲/蘇氨酸家族激酶具有相似性，如LegK1-4[34，61-64]、LegK7[62，65]、Lpg2370[66]等，并且通過影響宿主不同的生命過程發揮作用。軍團菌中還有一些非典型的激酶，例如Lpg2603，雖然Lpg2603一級序列與激酶沒有相似性，然而其三級結構和激酶類似，并且Lpg2603的激酶活性需要磷脂六磷酸(inositol hexakisphosphate，IP6)的激活，IP6的結合導致Lpg2603活性位點的重排，允許ATP的結合及發揮催化功能[67]；效應蛋白SidJ也具有一個激酶折疊[7，68-69]，在堿性pH時，可以與SidE形成穩定復合物[70]，將SidE mART催化中心的E860谷氨酸化修飾[71]。

(a)軍團菌效應蛋白LegK1影響NF-kB信號通路；(b)軍團菌效應蛋白LegK2影響肌動蛋白骨架構建；(c)軍團菌效應蛋白LegK4抑制蛋白質折疊能力；(d)軍團菌效應蛋白LegK7影響巨噬細胞基因的表達。圖2 軍團菌中磷酸化蛋白影響信號通路Fig.2 Phosphorylated proteins in Legionella affect the signaling pathway

效應蛋白LegK1能夠磷酸化IkB S32和S36激活其NF-kB信號通路，LegK2 能夠靶向肌動蛋白Actin ARP2/3，引起吞噬體肌動蛋白骨架的重塑，使細菌可躲避晚期吞噬途徑[63]。LegK4具有3個結構域，N端的cap 結構域，中間的激酶結構域和C端4個螺旋束組成的FHB結構域，結合ATP后導致二聚體的形成[61]。LegK4可以直接磷酸化宿主分子伴侶HSP70底物結合結構域保守的T495，LegK4對胞內HSP70的磷酸化降低其ATP酶活性進而抑制蛋白質折疊能力[72]。最近研究發現LegK7能夠模擬宿主Hippo通路中的激酶MST1，將Hippo信號通路中保守的磷酸化支架蛋白MOB1的T12和T35位點磷酸化，首次將病原菌的感染與Hippo信號通路聯系起來。研究發現，LegK7的磷酸化導致MOB1的激活并降解轉錄因子YAP1/TAZ，轉錄組分析發現，LegK7介導的YAP1/TAZ的降解導致巨噬細胞基因表達改變，從而促進細菌的增殖[72]。LegK7的N端具有一個激酶結構域，能夠劫持宿主的Hippo信號通路促進感染[65]。LegK7的底物Mob1A結合在LegK7的激酶結構域，激活LegK7激酶活性[62，64]。效應蛋白Lpg2370[73]曾被認為是一個RING型E3泛素連接酶[74]，最近研究證實Lpg2370同樣屬于典型的絲/蘇氨酸家族激酶，有趣的是它與上游處于相同操縱子的兩個基因lpg2369、lpg2368組成一個毒素-抗毒素系統(toxin antitoxin，TA)，其中具有激酶活性的效應蛋白Lpg2370作為毒素，Lpg2370的表達會抑制軍團菌的生長，抗毒素Lpg2369的結合阻止ATP接近Lpg2370 ATP結合口袋，從而阻止其對底物的磷酸化，然而目前尚不清楚Lpg2370在宿主內的底物[66]。

7 展望

本文總結了近幾年報道的由病原體編碼的具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的幾種特殊的效應蛋白，它們在病原微生物感染過程中通過磷酸化宿主關鍵信號通路中的底物促進感染，這為治療這些病原微生物感染提供了潛在的靶標。目前以抗生素進行病原微生物治療導致的微生物耐藥性問題是人類健康面臨的巨大威脅，而效應蛋白在致病過程中的特異靶標則為治療其感染提供了個性化治療的可能，特別是真核細胞中激酶作為藥物設計積累的重要經驗，為以病原微生物中具有激酶活性的效應蛋白為靶標開發藥物設計提供了重要參考?？傊?，鑒定細菌激酶新的底物以及研究激酶調控觸發的生物學功能將為病原菌感染宿主的適應機制方面的研究提供更多的思路，最終這些基礎研究將為新型藥物的研發提供理論基礎。