不同更新方式下亞熱帶森林土壤病毒群落結構與功能特征

林秋沙，嚴雨亭，袁程昱，李帥軍，賀紀正，于丹婷

(1.福建師范大學地理科學學院，福建 福州 350117；2.福建師范大學濕潤亞熱帶山地生態國家重點實驗室培育基地，福建 福州 350117)

異常的自然災害和過度的人為干擾已經造成了森林大面積退化、生態系統服務功能喪失等嚴重問題[1]。全球各國正在擴大森林恢復規模，以提供關鍵的生態系統服務功能和提高生物多樣性效益，如碳儲存、土壤侵蝕控制、供水和木材生產等[2]。了解森林受到干擾之后的恢復過程是森林生態系統可持續發展的重要需求。自然恢復與人工造林是全球森林恢復的兩種主要模式[1]，有研究指出，人工純林可能會導致土壤衰退、生態系統穩定性下降等問題[3]，而自然恢復往往被認為具有更高的生態系統服務功能[4]。通過對不同更新方式下森林土壤微生物相關指標進行測定比較，能夠及時有效地監測土壤微生物群落及功能變化，這對揭示森林管理方式下土壤質量演變的微生物學機理具有重要意義。特別是天然林轉換為人工林使得微生物生物量[5]、真細菌比[6]等都顯著降低，且土壤微生物群落由K-策略占主導轉變為R-策略的微生物占主導[7]，這使得微生物群落結構趨于不穩定。目前相關研究多集中于真菌和細菌，卻很少關注到土壤病毒。

土壤微生物能夠改善表層土的物理化學性質，保持土壤有機質含量，在森林生態系統的碳氮循環中發揮關鍵作用[8]。病毒作為地球上最豐富的生物實體[9]，通過調節微生物群落動態[10]、在感染期間重新編程宿主代謝[11]以及作為水平基因轉移的載體[12]，在影響土壤微生物群落和功能方面發揮著至關重要的作用。陸地生態系統中76% ～ 98%的有機碳存儲于森林生態系統，森林是調節全球碳循環的巨大“生物泵”[13]。研究發現土壤病毒可以作為重要因子調節土壤中的碳損失[14]，而森林土壤病毒豐度高達109VLP·g-1干土[15]，且土壤病毒能夠通過感染土壤微生物群對森林生態系統碳動力學產生重大影響[16]。例如，在紅樹林土壤病毒中鑒定出的參與復雜多糖生物分解的輔助碳水化合物活性酶，就證明了土壤病毒可能通過復雜多糖的生物分解直接操縱碳循環[17]。

為比較不同更新方式下次生林土壤病毒群落及其潛在功能差異，本文選擇了白砂國有林場皆伐后自然恢復和人工種植杉木兩種更新方式的林地(林齡為40年)為研究對象，以及林齡大于100年的次生林作為對照，利用宏病毒組學，探討不同更新方式對亞熱帶森林土壤病毒群落組成與功能的影響，以期為森林經營管理和森林恢復提供關鍵基礎數據。

1 材料與方法

1.1 研究區域與樣品采集

采樣點位于福建省龍巖市上杭縣白砂國有林場(24°46′-25°28′ N，116°16′-116°57′ E)，屬中亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為20.1 ℃，年降水量1 600 mm，森林總蓄積76×104m3。本研究于2018年6月采集該林場杉木人工林和天然更新次生林長期試驗點土壤。杉木人工林屬人工種植林，林齡約40年，天然更新林和原生林均為杉木砍伐后的自然演替林，前者林齡約40年，后者林齡大于100年。其中，杉木人工林喬木層樹種以杉木(Cunninghamialanceolata)為優勢樹種，胸高斷面積約為43.37 m2·hm-1；林下植被以閩楠(Phoebebournei)、黃絨潤楠(Machilusgrijsii)、粗葉榕(Ficushirta)、地桃花(Urenalobata)、芒萁(Dicranopterisdichotoma)等為主。天然次生林的在演替前期以是杉木(Cunninghamialanceolata)為主，胸高斷面積約為27.69 m2·hm-1，而后期形成以栲樹(Castanopsisfargesii)、木荷(Schimasuperba)等當地優勢樹種為主的闊葉林，胸高斷面積約為56.80 m2·hm-1；林下植被主要包括黃瑞木(Adinandramillettii)、榕葉冬青(Ilexficoidea)、狗脊蕨(Woodwardiajaponica)、長刺帶葉苔(Pallaviciniasubciliata)等。選用梅花布點法布設樣點，樣點之間的間隔大于3 m，每個樣品選取3個樣點，在每個采樣點采集0～10 cm表層土壤。土樣采集后立即使用冰盒運送至實驗室，所有土壤樣品過2 mm篩以去除摻雜的碎石及植物碎屑，并于4 ℃保存用于后續實驗。

1.2 土壤病毒DNA提取及測序

土壤病毒DNA提取流程參考農田土壤病毒的提取方法并進行相應優化[18]，改進方法簡述如下，稱取500 g過2 mm篩的新鮮土樣，與3 L 1%的檸檬酸鉀緩沖液混勻，于150 r·min-1振蕩15 min，隨后以1 500×g離心10 min，并收集上清液。剩余土壤沉淀再次加入緩沖液進行重懸浮、振蕩和離心，重復洗脫3次。隨后采用切向流過濾系統(Tangential Flow Filter System，QuixStand，GE Healthcare Life Sciences，Pittsburgh，PA，USA)、30 ku超濾離心管(Merck Millipore Ltd.，Tullagreen，Ireland)進行濃縮。將所得的病毒濃縮液使用DNase I(Promega，Madison，Wisconsin，USA)于37 ℃孵育30 min(20 units·μL-1)，以去除游離的胞外DNA。隨后利用Power Viral Environmental RNA/DNA Isolation Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取病毒DNA。選取細菌16S rRNA基因對病毒DNA進行PCR檢測(引物27F/1492R)，以確保沒有細菌污染[19]，并將病毒DNA于-80 ℃保存[20]。

利用超聲破碎儀Covaris M220(Covaris，Woburn，MA，USA)對病毒DNA進行隨機打斷(長度約350 bp)，隨后使用Accel-NGS 1S Plus DNA Library Kit(Integrated DNA Technologies(IDT)Ann Arbor(formerly Swift Biosciences)，Michigan，USA)進行宏病毒組文庫構建。利用Nanodrop和Qubit對病毒DNA進行純度和濃度檢測，建庫后質檢合格的樣品進行Illumina HiSeq 2500高通量測序。測序所得宏病毒組原始序列提交至NCBI Sequence Read Archive(SRA)數據庫，獲得數據收錄號。

1.3 宏病毒組數據處理

原始測序數據利用fastp軟件以默認參數去除接頭與低質量序列，獲得clean reads[21]。運用SortMeRNA v2.1去除clean reads中的核糖體序列[22]，利用bbmap與NCBI UniVec數據庫(ftp：∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/UniVec,March2017)進行比對，去除可移動遺傳元件。然后使用metaSPAdes對clean reads進行組裝拼接，得到原始contigs[23]。Clean reads與病毒數據庫進行Blastx比對和物種注釋(EValue<1e-5，score值>50)[24]，病毒數據庫綜合了NCBI non-redundant(NR)database，Refseq virus database和PHAST網站上的噬菌體數據庫(截至2018年8月)[25]。依據病毒物種注釋結果，通過Virus Host DB在線網站進行病毒宿主預測。使用Prodigal v2.6.3以默認參數對比對到的病毒序列進行開放閱讀框(ORFs)預測[26]，并將預測得到的蛋白序列與KEGG蛋白數據庫進行比對(EValue<1e-5)，利用MEGAN 6對病毒功能進行分類[27]，使用dbCAN meta server在線分析網站對病毒contigs進行CAZyme輔助代謝基因注釋[28]。

2 結果與分析

2.1 土壤病毒群落結構

通過宏病毒組測序，從杉木人工林(S40)、天然更新次生林(T40)和原生林(Y100)土壤樣品中分別獲得20 304 087、25 732 571、32 923 917條clean reads，其中分別有163 339、310 235和468 921條clean reads比對上病毒數據庫。將clean reads進行拼接，在杉木人工林、天然更新次生林和原生林土壤宏病毒組中分別得到2 800、6 521和16 990條contigs(>300 bp)。通過與病毒數據庫進行比對，結果如圖1(a)所示，長尾噬菌體科(Siphoviridae)為原生林和天然更新次生林土壤樣品中的主要病毒類群，分別占比62.60%和31.49%，而其在杉木人工林土壤中僅占比16.72%；其次是肌尾噬菌體科(Myoviridae)，在天然更新次生林土壤中占比22.93%，高于其在原生林和杉木人工林中的占比(10.83%和8.33%)。而杉木人工林土壤樣品中的主要病毒類群為微小噬菌體科(Microviridae)，占比27.89%，遠高于其在原生林和天然更新次生林土壤中的比例(1.52%和1.41%)，其次是長尾噬菌體科(16.72%)。

3種土壤均檢測到擬菌病毒科(Mimiviridae)、Phycodnaviridae、短尾噬菌體科(Podoviridae)、環狀病毒科(Circoviridae)等。此外，小環狀DNA病毒科(Smacoviridae)僅在杉木人工林和天然更新次生林土壤樣品中檢測到。嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)、乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)、Lavidaviridae、嗜鹽紡錘形噬菌體科(Halspiviridae)僅在杉木人工林和原生林土壤樣品中檢測到。古噬菌體科(Rudiviridae)、復層噬菌體科(Tectiviridae)僅在天然更新次生林和原生林土壤樣品中檢測到(圖1(b))。在天然更新次生林、杉木人工林和原生林的土壤中均發現了核質巨大DNA病毒成員，包括痘病毒科(Poxviridae)、 虹膜病毒科(Iridoviridae)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、藻類去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、馬賽病毒科(Marseilleviridae)和擬菌病毒科(Mimiviridae)、潘多拉病毒科(Podoviridae)，NCLDV在原生林、天然更新次生林、原生林中的占比依次為9.77%、20.83%、12.20%。

(a)土壤病毒科水平物種組成，(b)共有和特有的病毒科數目韋恩圖。 圖1 不同更新方式下土壤病毒群落組成Fig.1 Taxonomic compositions of viral communities under different restoration patterns

2.2 病毒宿主分析

圖2 病毒宿主分析Fig.2 Host analysis

選取相對豐度最高的長尾噬菌體科、肌尾噬菌體科、微小噬菌體科和擬菌病毒科在Virus Host DB在線網站上進行已知宿主檢索，結果見圖2，病毒的主要宿主分屬于5個細菌門，其中放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)占比最多(74.52%和17.01%)，其次是厚壁菌門(Firmicutes)和雙環菌門(Bigyra)(5.13%和2.28%)，變形蟲門(Amoebozoa)最少(1.06%)。在屬水平上，戈登氏菌屬(Gordonia)占比最大(44.85%)，紅球菌屬(Rhodococcus)和農桿菌屬(Agrobacterium)次之(15.38%和8.78%)，此外，還發現了部分致病的分枝桿菌屬(Mycolicibacterium)(3.49%)和鏈霉菌屬(Streptomyces)(0.9%)。其中杉木人工林主要宿主為寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)(39.39%)、農桿菌屬(Agrobacterium)(17.49%)，天然更新林為農桿菌屬(Agrobacterium)(23.90%)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(12.00%)，而原生林的主要病毒宿主則為戈登氏菌屬(Gordonia)(61.19%)、紅球菌屬(Rhodococcus)(20.20%)。

2.3 土壤病毒功能

使用Prodigal v2.6.3對病毒contigs進行基因預測[26]，并將預測所得基因蛋白序列與KEGG蛋白數據庫進行比對(EValue<1e-5)，利用MEGAN 6對3種土壤病毒進行功能分類(圖3)[27-28]。Level 1水平上，3種土壤均注釋到4種病毒功能，其中“Metabolism”和“Genetic Information Processing”占比較高，“Environmental Information Processing”和“Cellular Processes”次之。Level 2水平共比對到17個病毒功能，其中“Replication and repair”、 “Amino acid metabolism”和“Nucleotide metabolism”豐度最高，這些功能對病毒的繁殖和存活至關重要。值得注意的是，“Carbohydrate Metabolism”在亞熱帶森林土壤病毒功能中所占比例較高。

圖3 病毒功能注釋Fig.3 Functional profile of viromes

為了探究不同更新方式森林土壤病毒在碳循環中的功能，進行了碳水化合物活性酶 (CAZymes)的識別。根據CAZy和NCBI非冗余蛋白(NR)數據庫注釋結果(圖4)，在原生林土壤中注釋到的編碼病毒CAZyme相關基因豐度最高(210個)，遠高于天然次生林(69個)和杉木人工林(4個)，基因注釋結果屬于輔助氧化還原酶(auxiliary activities，AA)、碳水化合物結合模塊(Carbohydrate-binding modules，CBM)、碳水化合物酯酶(Carbohydrate esterases，CE)、糖苷水解酶(Glycoside hydrolases，GH)和糖基轉移酶(Glycosyl transferases，GT)5個CAZyme功能類型，其中糖苷水解酶的比重最高(78.45%)，糖基轉移酶次之(16.25%)，輔助氧化還原酶、碳水化合物酯酶和碳水化合物結合模塊占比最低(2.83%、1.77%和0.71%)?；蛩缴?，GH24、GH23和GH13基因豐度最高(23.67%、19.43%和9.19%)，有152個基因屬于溶菌酶或幾丁質酶，其余基因包括α-淀粉酶、纖維素合成酶等。在原生林和天然更新次生林中主要發現的CAZymes為糖苷水解酶(88.57%、47.83%)，在天然更新次生林中也有相當比例的糖基轉移酶(39.13%)，而在杉木人工林中僅發現CBM50、GH24、GH32、GH73。

3 討論

宏病毒組物種注釋結果表明，原生林、天然更新次生林、杉木人工林土壤病毒群落呈現顯著差異。原生林和天然更新次生林中dsDNA病毒占優勢，而在杉木人工林中占比最高的則為ssDNA病毒。其中有尾噬菌體目長尾噬菌體科在3個森林土壤中均為主要病毒類群。相關研究表明，長尾噬菌體科在紅樹林[17]、馬尾松林[29]、城市森林[30]等不同森林類型中均為優勢分類單元。長尾噬菌體非經典的DNA聚合方式使宿主細菌的免疫系統無法識別該噬菌體基因組，從而增加侵染效率并維持自身基因組的穩定，這種特殊的DNA聚合方式可以解釋其在環境中大量存在的原因[31]。而在杉木人工林中微小噬菌體病毒科的占比顯著增加。微小噬菌體科的宿主主要為腸桿菌科和專性寄生菌[32]，且在感染周期中的潛伏期短、子代釋放量大[33]，從而廣泛分布于環境中，如海洋、污水、人體腸道和沉積物等。杉木林人工林中高比例的微小噬菌體科可能是因為人類的活動為微小噬菌體提供了更豐富的宿主[34]。

NCLDV是一組多樣的真核病毒，感染廣泛的真核生物，特別是原生生物和藻類，最大的巨型病毒在顆粒和基因組大小上都超過了許多細菌和古菌[35]。相關土壤病毒研究挖掘到了高度多樣的巨型病毒，并發現許多NCLDV能夠編碼糖酵解和三羧酸循環的成分，證明NCLDV是全球生物地球化學循環的重要驅動因素[36]。本研究未調查其他微生物分類群，而且并未有相關研究對土壤特征及生態管理實踐如何影響NCLDV組成進行探究，因此無法充分討論不同更新方式下NCLDV相對豐度的差異，但可以肯定的是NCLDV廣泛分布在不同環境土壤中[36-37]。

噬菌體調控細菌群落結構是一種經典的Top-down調控。近來相關研究發現森林土壤病毒主要對R-策略細菌進行靶向裂解，釋放出細胞內高生物利用度的溶解性有機物，并促進其他異養微生物的增長[38]。本研究匹配到的主要病毒宿主包括放線菌門、變形菌門和厚壁菌門，其均為R-生存對策[39]，因此亞熱帶森林中土壤病毒很可能通過裂解宿主釋放營養物質進而影響碳循環。不同更新方式下亞熱帶森林土壤病毒宿主在門和屬水平均具有差距，但是其宿主都包括相當比例的致病菌如戈登氏菌、紅球菌、分枝桿菌等，因此土壤病毒還可能影響不同更新方式土壤的抑病能力。

亞熱帶森林是北半球相當大的碳匯[40]，在森林生態系統中，很大一部分有機碳以復合碳水化合物的形式儲存在土壤、動植物殘體中，極難降解[41]。因此，土壤和生物碎片中復雜多糖的生物分解對于亞熱帶森林物質循環至關重要。土壤病毒能夠介導基因的水平轉移，這些輔助代謝基因(Auxiliary metabolic genes，AMGs)可以在病毒侵染宿主后在宿主胞內表達，改變宿主代謝過程，從而參與元素的生物地球化學循環[42]?？茖W家在消融的永久凍土[43]、紅樹林土壤[17]、農田土壤[44]的病毒組研究中均發現土壤病毒攜帶大量碳循環相關的AMGs，本研究同樣發現了土壤病毒攜帶編碼CAZymes的碳循環基因，且在不同森林更新方式下差異顯著。天然更新林與單一人工林相比，具有更高的微生物生物量[45]、凋落物質量[46]以及更豐富的植被多樣性[47]和根系分泌物[48]，因此土壤中有機碳組成更為復雜。與碳水化合物轉運和代謝相關的基因在發育成熟的原生林以及天然更新次生林土壤病毒中更為富集，這表明了微生物群落隨環境變化的功能適應，以利用由于植物和其他微生物群落的生長而在土壤中積累的不同C源，如纖維素、半纖維素、淀粉、果膠和幾丁質等。因此，在維持微生物C循環相關功能方面天然更新方式更具優勢。

4 結論

通過宏病毒組學方法分析了不同更新方式下閩西亞熱帶森林土壤病毒的群落組成和功能特征。研究表明不同管理方式下土壤病毒群落組成存在顯著差異，原生林和天然更新次生林主要以長尾噬菌體科、肌尾噬菌體科為主，而杉木人工林中最優勢的病毒科則為微小噬菌體科。3種土壤中均發現了NCLDV，其中在天然更新次生林中占比最大。病毒宿主檢索的結果表明3種土壤中病毒宿主具有差異，變形菌門為杉木人工林和天然更新次生林中最主要的病毒宿主，而原生林則為放線菌門，但不同更新方式土壤病毒宿主都包括相當一部分人和動物的致病菌。這些結果說明土壤病毒群落組成可能受到與不同森林更新方式相關的人類和動物活動的影響。

在不同更新方式森林土壤病毒中鑒定的CAZymes基因豐度具有顯著差異，其中杉木人工林中僅發現4個CAZymes基因，這揭示了土壤病毒具有通過基因的水平轉移影響森林碳循環的潛力以及天然更新方式在恢復微生物C功能多樣性方面更具優勢。未來研究者還需要在天然更新林和人工林不同演替梯度上采集更豐富的樣品，進一步從土壤病毒的角度來剖析不同森林管理方式的優劣勢。