向天果HPLC指紋圖譜及特征成分含量測定研究

謝 喆，孫云鵬*，金文芳，劉勁松，王國凱,2*

（1.安徽中醫藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；2.中藥研究與開發安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012）

向天果（FructusSwieteniamacrophylla）為大葉桃花心木（Swieteniamacrophylla）的果實[1]，主要分布在熱帶及亞熱帶地區。果實味苦、澀，具有收斂、解熱等功效，種子主要可用于治療高血糖、高血壓等疾病[2-3]。前期研究表明，向天果中富含檸檬苦素類成分[4-5]。此類化合物不僅結構多樣[6]，還具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8]和抗病毒[9]等生物活性。

目前向天果作為保健品在市場上流通，并無統一的質量標準，不同來源的向天果之間是否存在成分或品質差異是亟待解決的問題。中藥指紋圖譜能體現中藥質量控制的系統性和整體性，被認為是中藥質量控制的有效手段[10-11]。本研究通過建立不同來源的向天果指紋圖譜，并進行含量測定，結合聚類分析[12]，了解各批次向天果之間品質的差異，為向天果的質量控制提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；KQ3200DB型數控超聲清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius）。

1.2 材料

甲醇，乙腈（色譜純，Sigma公司）；磷酸為分析純；蒸餾水（雙蒸水）；對照品3,6-O,O-diacetylswietenolide，swietenolide，swietenine，swietemahonin F，3-O-tigloyl-6-O-acetylswietenolide均由安徽中醫藥大學藥物化學實驗室從大葉桃花心木中分離得到，經薄層色譜（TLC）和高效液相色譜（HPLC）確認其性質與純度，純度均在95 %以上。

向天果樣品（批號：S1～S30）通過電商平臺購得，由安徽中醫藥大學藥學院方成武教授鑒定為楝科植物大葉桃花心木（Swieteniamacrophylla）的果實，商家標示的藥材產地見表1。

表1 30批向天果樣品批號及產地

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：KR100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫（0～15 min，45 %～48 %A；15～35 min，48 %～51 %A；35～36 min,51 %～55 %A；36～47 min，55 %～100 %A；47～54 min，100 %A；54～55 min，100 %～45 %A）；流速1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μl。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取5種檸檬苦素類化合物適量，加入適量甲醇溶解，定容，搖勻，配制成一定濃度的對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定各批次向天果粗粉0.5 g，置25 ml量瓶中，加甲醇20 ml超聲提取30 min，冷卻后定容，靜置，取上清，過微孔濾膜（0.22 μm），備用。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取樣品S1，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，所得色譜圖輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”中進行相似度分析，結果顯示相似度均在0.98以上，且13個共有峰的保留時間RSD值均小于0.16 %，符合指紋圖譜要求。

2.4.2 穩定性試驗 取樣品S1，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別放置0，4，8，12，16，24 h后進樣，所得色譜圖進行相似度分析，結果顯示色譜圖相似度均在0.94以上，且13個共有峰的保留時間RSD值均小于0.16 %，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.3 重復性試驗 取樣品S3，按2.3項下方法制備供試品溶液6份，依次進樣，所得色譜圖進行相似度分析，結果顯示相似度均在0.93以上，且13個共有峰的保留時間RSD值均小于0.18 %，說明該方法具有良好的重復性。

2.5 向天果指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 特征指紋圖譜測定 取30批供試品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件對供試品溶液進行測定。測定結果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，以S1為參照圖譜，經過多點校正，自動匹配，以中位數法得到對照圖譜R，在匹配數據的輸出結果中選擇分離度較好的13個色譜峰作為共有峰，建立30批向天果HPLC指紋圖譜共有模式，并通過自制對照品對其中的5個共有峰進行指認，其中1號峰為swietenolide，6號峰為swietenine，8號峰為3,6-O,O-diacetylswietenolide，10號峰為3-O-tigloyl-6-O-acetylswietenolide，11號峰為swietemahonin F，結果見圖1～2。

圖1 30批向天果的特征指紋圖譜

圖2 向天果HPLC指紋圖譜共有模式和對照品圖譜

2.5.2 特征指紋圖譜的結果分析 經分析計算，30批樣品的共有模式中，所有共有峰保留時間RSD值均小于1 %（見表2）；13個共有峰的峰面積RSD值在11.7 %～37.0 %之間（見表3），表明不同批次向天果中化學成分相差不大，但含量差異較大，不同來源的向天果樣品品質有差異。

表3 向天果共有峰的峰面積

表4 30批向天果相似度評價結果

2.5.3 聚類分析 將上述分析數據輸入到SPSS 23系統中，進行聚類分析，結果見圖3。結果表明30批向天果在閾值為10的情況下被聚為6類，其中有22批樣品被聚為一類，說明國內市場上大部分的向天果來自于相似產地；但根據商家標明的產地，來源相同的樣品并未完全被聚為一類，說明商家標明的信息并不可靠；在閾值為5的情況下，樣品被聚為11類，其中6批樣品被單獨歸為一類，表明不同產地來源的向天果含有的化學成分的含量有顯著差異。

圖3 聚類分析結果

2.5.4 主成分分析 將30批向天果共有峰峰面積作為變量導入SPSS 23軟件，進行主成分分析，計算特征值、累計貢獻率、成分矩陣及綜合得分，具體結果見表5～7。

表5 30批向天果的特征值和貢獻率

表6 30批向天果的成分矩陣

表7 主成分得分和綜合得分排序

以特征值≥1為提取標準，提取出4個主成分，累計貢獻率達77.705 %，可代表向天果中大部分化學成分的含量信息。其中主成分1的信息量最大，貢獻率為33.852 %，各色譜峰荷載量代表對應色譜峰的貢獻值，貢獻值前三的色譜峰分別為：1號峰、6號峰、2號峰。通過主成分綜合得分，排名前3位的批號為S4、S17、S7，與聚類分析的結果大體相同，可相互印證。

2.6 指標性成分含量測定

由于目前向天果并無明確的質量標準和含量測定方法，因此根據聚類分析和主成分分析的結果指認共有峰（1號峰：swietenolide和6號峰：swietenine）作為向天果的特征性成分，通過自制對照品對30批樣品進行含量測定，建立向天果特征性成分的含量測定方法。

2.6.1 線性關系考察 吸取對照品溶液，分別吸取1，3，5，10，15，20 μl，定容，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，swietenolide的標準曲線為Y=1104.1X-6.1436（r=1，n=6），線性范圍為0.488～9.79 μg；swietwnine的標準曲線為Y=1456.5X-21.864（r=0.9999，n=6），線性范圍為0.334～6.68 μg。

2.6.2 精密度試驗 取樣品S1，按2.3項下方法制備供試品溶液，重復進樣6次，記錄峰面積。結果顯示swietenolide峰面積的RSD為0.87 %（n=6）；swietwnine峰面積的RSD為1.23 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩定性試驗 取樣品S1，按2.3項下方法制備供試品溶液，放置0，4，8，12，16，24 h后依次進樣，記錄峰面積。結果顯示swietenolide峰面積的RSD為1.97 %（n=6）；swietwnine峰面積的RSD為1.19 %（n=6），表明供試品溶液中成分室溫下24 h內具有良好的穩定性。

2.6.4 重復性試驗 取S3批次樣品0.5 g，按2.3項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，進樣分析。結果顯示swietenolide峰面積的RSD為1.37 %（n=6）；swietwnine峰面積的RSD為0.93 %（n=6），表明本法重復性良好。

2.6.5 加樣回收試驗 取樣品S1，分別精密稱定6份，每份0.25 g，分別加入1.00 mg/ml swietenolide對照品溶液8.55 ml，1.00 mg/ml swietwnine對照品溶液4 ml，按2.3項下方法平行制備供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積，計算回收率，結果見表8。兩對照品的平均回收率分別為99.8 %和101.0 %，RSD分別為1.68 %和3.63 %，符合試驗要求。

表8 加樣回收試驗結果（n=6）

2.6.6 樣品含量測定 取30批次供試品（批號：S1～S30），按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，結果見表9。30批向天果樣品中swietenolide和swietwnine的含量平均值分別為14.28，10.74 mg/g。

表9 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

檸檬苦素類化合物的紫外吸收大部分為末端吸收，對向天果甲醇提取液在190～400 nm進行全波長掃描，最大吸收集中在210 nm左右?？疾炝思状?水，甲醇-0.1 %磷酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1 %磷酸水溶液等多種流動相體系，并對柱溫、流速及進樣量進行考察，分析比較出峰數目、分離度、峰面積和基線情況。結果顯示以乙腈-水、流速1.0 ml/min、柱溫30 ℃、進樣量20 μl的色譜條件測定時，基線較穩定，出峰較多、分離最好、峰形最佳、保留時間適宜，具有較強的耐用性。

3.2 指紋圖譜相似度評價

由本文研究可見，在采用指紋圖譜相似度評價向天果藥材時，不同產地藥材評價的結果會有一定差異，有時不能完全體現批間差異。因此在涉及不同產地藥材時應尤其關注類似問題，建議在采用相似度評價的基礎上，還應增加主要成分色譜峰單位質量峰面積（A/W）的波動范圍，非共有峰個數、共有峰個數及指紋圖譜峰形特征、峰面積等指標，并運用統計學方法進行適當的主成分分析和聚類分析，進而對不同產地的藥材進行更全面的評價。

3.3 聚類分析和主成分分析

本研究通過主成分分析將30批向天果的13個共有峰峰面積轉換成4個相互獨立的主成分，避免了原始信息的重疊及干擾，也使數據具有客觀性和可比性；以共有峰峰面積直接區別歸類的聚類分析，將相關性大的批次優先聚合在一起。兩種分析方法的結果有相似之處，相互佐證，均能較好地反映出不同產地向天果品質的差異性。

4 結論

本文建立了30批向天果樣品的特征指紋圖譜，并確立了13個共有峰，指認出其中5個共有峰為檸檬苦素類化合物，表明檸檬苦素類成分為向天果的主要化學成分。比較共有峰保留時間和峰面積的RSD值，結果顯示不同來源的向天果樣品的化學成分具有一致性，但含量存在一定的差異。后通過聚類分析和主成分分析，深入分析了30批向天果之間品質的差異，并計算出各共有峰的貢獻率，以此為基礎對貢獻率最大的兩個共有峰進行含量測定，發現目前我國市場上流通的向天果存在產地信息不明，不同產地的向天果成分含量差異較大等問題，相似度越高的批次之間含量差異越小，反之則越大，在聚類分析中相似度高的批次也基本被分為一類?？梢姼鞑糠衷囼灲Y果具有一致性，可相互佐證，所建立的指紋圖譜和含量測定方法具有客觀性和科學性，可合理地評價該藥材質量，為制定向天果的質量標準提供參考依據。