超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜鑒定三七極細粉中化合物及其口服吸收代謝成分

邱 慧，徐 倩，黃 霞，汪保林

（1.南昌市洪都中醫院 制劑中心，江西 南昌 330008；2.南昌大學第二附屬醫院 藥學部，江西 南昌 330006）

中藥三七為五加科植物三七[Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根和根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，臨床主要用于咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外傷出血，胸腹刺痛，跌撲腫痛[1]。三七在中醫藥中的臨床應用有著十分悠久的歷史，《醫門密旨》、《跌損妙方》及《本草綱目》均有記載[2]，其根、莖、葉、花均可入藥，是我國傳統的珍貴藥材，是云南白藥、片仔癀、復方三七口服液及復方丹參滴丸等常見中成藥中的主要組成藥材。在民間用藥中，三七經常被加工成極細粉，直接以溫水送服，用于治療中老年心腦血管疾病及跌打損傷等。目前，從三七中分離得到的化合物有百余種，主要以皂苷類成分為主，此外還有少量的黃酮、多糖、氨基酸、蛋白質及炔、醇類物質，其中皂苷類成分和三七素為主要活性成分[3-4]。目前關于三七代謝研究僅有少量報道，且主要針對三七中的主要活性物質人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的代謝研究[5-7]，迄今未見有關三七極細粉成分與人體口服吸收代謝的研究報道。本研究基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q Exactive HRMS）定性分析技術，對三七極細粉乙醇提取物、三七極細粉口服吸收入血成分及尿液成分進行定性分析，并初步探討其口服吸收代謝特征。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜儀（美國Dionex公司）；Q-Exactive型四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XS105DU和ME204E電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Vortex-Genie2型渦旋混勻器（德國IKA公司）。

1.2 材料

人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-202034），人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-202129），三七皂苷R1對照品（批號：110745-201921），人參皂苷Re對照品（批號：110754-202129）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸（HPLC級，阿拉?。?；甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck公司）；純凈水（廣州屈臣氏）；其他試劑均為分析純。實驗用藥材三七購自樟樹市慶仁中藥飲片有限公司（批號：20200609，產地：云南），經本院制劑中心制成極細粉（批號：20210527）。

1.3 研究對象

健康男性受試者3名，年齡：30～40歲，體重：50～68 kg，空腹給藥，采集樣本后進食。受試者經病史詢問，并經肝腎功能、尿常規和心電圖檢查證實無異常，無吸煙及嗜酒史，在兩周內未服用其他藥物，且每位受試者在實驗前被告知試驗內容，并經同意后簽署知情同意書。

2 方法

2.1 UHPLC Q-Exactive HRMS條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：0.1 %甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，5 %B；3 min，19 %B；20 min，19 %B；60 min，40 %B；75 min，95 %B；82 min，95 %B；84 min，5 %B；90 min，5 %B）；流速：0.3 ml/min；進樣量：2 μl。

2.1.2 質譜條件 加熱電噴霧離子源（HESI），負離子模式，噴霧電壓：3.0 kV（-），離子傳輸管溫度：320 ℃，S-Lens出口透鏡電壓：60 V；霧化氣流量：30 μl/min，輔助氣：溫度300 ℃，流量10 μl/min。掃描方式選擇全掃/二級質譜掃描模式，Full MS中，分辨率為70 000半峰全寬（FWHM），自動增益控制目標離子數（AGC target）為3×106，允許最大離子注入時間（Maximum IT）為100 ms，離子掃描范圍：m/z150～1500；ddMS2中，分辨率為17 500 FWHM，AGC target為1×105，Maximum IT為50 ms，離子掃描范圍：m/z200～1500。

2.2 三七極細粉供試品溶液的制備

稱取三七極細粉適量，置于錐形瓶中，稱定重量，加入10倍量95 %乙醇，加熱回流提取30 min，冷卻至室溫，稱定重量，用95 %乙醇補足減失的重量，混勻，高速離心（12 000 r/min，10 min），上清用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Re對照品各約5 mg，精密稱定，分別置于50 ml量瓶中，加95 %乙醇定容至刻度，得對照品儲備溶液；精密移取各對照品儲備溶液100 μl，置于同一10 ml量瓶中，加95 %乙醇定容至刻度，即得混合對照品溶液（終濃度約為1 μg/ml）。

2.4 生物樣本采集與前處理

2.4.1 血漿、尿液樣本采集 給藥前，采集空白血漿與尿液。受試者空腹口服三七極細粉2 g，適量溫水送服，分別于0.5，1，1.5，2，4，6，12 h使用采血管于手靜脈處采血2 ml，取血后4000 r/min、4 ℃下離心5 min，取上層血漿。此外，給藥后收集1～4 h、4～8 h、8～12 h尿液，均保存于-80 ℃冰箱中備用。

2.4.2 生物樣本前處理 血漿樣本：取2.4.1項下空白血漿及各時間點含藥血漿各100 μl，加300 μl甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，14 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上層清液，常溫氮氣吹干，加50 %甲醇100 μl復溶，渦旋混勻1 min，14 000 r/min、4 ℃下再次離心10 min，取上清，進樣測定。尿液樣本：取2.4.1項下空白尿液及給藥后各時間段尿液各100 μl，加甲醇300 μl，渦旋2 min，14 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上層清液進樣分析。

3 結果與分析

3.1 UHPLC Q-Exactive HRMS色譜特征分析

三七極細粉主要包含皂苷類成分，此外，尚含少量的黃酮苷類成分，為鑒定其詳細的化學成分及其經人體口服給藥后血液和尿液中吸收的成分及代謝產物，本研究將三七極細粉的提取物、給藥后的血液與尿液3種樣本經前處理后進樣于UHPLC Q-Exactive HRMS系統，按2.1.2項下條件采集數據，最終得到不同樣本的基峰強度（BPI）色譜圖（見圖1）。

圖2 負離子模式下不同雙糖鏈的裂解特征

3.2 三七極細粉提取物成分鑒定

基于UHPLC Q-Exactive HRMS準分子離子和加荷離子等信息，運用Xcalibur定性分析軟件獲得目標化合物的保留時間（tR）、精確相對分子質量及二級裂解碎片等質譜信息，對各色譜峰進行初步推測，并對比已知對照品質譜裂解數據及相關文獻[8-9]，最終確定各色譜峰化合物結構。共鑒定出41各化合物，其中皂苷類成分38個，黃酮苷類成分3個?；衔锛皻w屬信息詳見表1。

表1 三七極細粉醇提物化學成分鑒定結果

質譜分析中，關于糖鏈部分，2個六碳醛糖（如2個葡萄糖）或六碳醛糖與甲基五碳醛糖（如葡萄糖與鼠李糖）或六碳醛糖與五碳醛糖（如葡萄糖與阿拉伯糖或木糖）相連可在負離子模式下相應出現m/z221.07，205.07和191.06的離子峰；此外，葡萄糖主要裂解為m/z161.04，113.02，101.02，179.05等碎片離子。關于苷元部分，由于皂苷類成分的苷元四元環結構穩定，不易裂解產生二級碎片離子，然其C-17支鏈在強電壓下可進行一定程度的裂解形成相應的碎片離子，可進一步確定化合物的結構。關于黃酮苷類成分，由于苷元具有逆迪爾斯-阿爾德（RDA）裂解特點，易于解析。本研究主要根據苷元結構差異進行初步分類，分別解析各色譜峰對應的化合物結構。

峰1：UHPLC Q-Exactive HRMS數據顯示其保留時間為6.28 min，一級準分子離子為m/z625.1412，提示分子式為C27H30O17（[C27H30O17]-：計算值為625.1410）。準分子離子m/z625.1412中性丟失糖基（C12H22O10）產生碎片離子m/z300.0277，提示為二葡萄糖取代。其余碎片離子m/z271.0250，255.0299，243.0298和151.0022與槲皮素裂解碎片一致[8]。因此，推測峰1的結構為槲皮素-3-O-槐糖苷。此外，根據峰2的一級與二級質譜數據，同樣推測出峰2的結構為山奈酚-3-O-β-D-半乳糖（6→1）β-D-葡萄糖苷。

峰3：在二級質譜圖中，觀察到甲基取代信號，其他碎片離子與槲皮素裂解碎片一致，再結合mzCloud數據庫，推測出峰3的結構為7-甲基槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2→1）β-D-木糖苷。

峰7～9：高分辨質譜數據顯示其一級準分子離子[M+HCOOH-H]-分別為m/z977.5331，845.4910和991.5501，其二級碎片中均可觀察到中性丟失m/z46.01（HCOOH）的碎片離子，提示為母離子與甲酸的加和離子，因此其對應分子式分別為C47H80O18、C42H72O14和C48H82O18。在二級碎片離子中，均可觀察到苷元離子m/z475.3787及其C-17支鏈斷裂后形成的碎片離子m/z391.2861，提示均為原人參三醇型三萜皂苷。根據糖苷鍵連接位置不同及不同糖分子量差異等信息推測峰7～9的結構分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re。峰7～9的保留時間、一級及二級質譜碎片離子與對照物質三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re相一致，進一步確證了峰7～9的結構。峰4～6、峰10～16、峰19及峰27的二級質譜數據中均存在苷元離子m/z475.38及其C-17支鏈斷裂后形成的碎片離子m/z391.29，表明其苷元均為原人參三醇型三萜皂苷。根據糖苷鍵的裂解信息及文獻數據[8]，推測峰4～6、峰10～16、峰19及峰27的結構見表1。

峰20：在二級質譜圖中，觀察到m/z459.3873和失去C-17支鏈的m/z375.2899碎片離子，提示為原人參二醇型皂苷，其保留時間、一級及二級碎片信息與人參皂苷Rb1對照品一致，因此推測峰20為人參皂苷Rb1。同樣，峰17、18、峰21～24、峰26、峰28～34及峰38～40中均含m/z459.39和375.29的碎片離子，提示可能為原人參二醇型皂苷。再根據糖鏈斷裂所產生的碎片離子并結合文獻數據[8]，分別推測上述不同色譜峰的結構，見表1。

峰25、峰35～37及峰41，首先根據一級質譜中的離子信息推測該分子的元素組成，得分子式，然后以分子式在PubChem網絡數據庫中查詢可能的化學結構，再結合文獻數據最終確定對應化合物的結構，具體結果見表1。

3.3 生物樣本原型及代謝物成分鑒定

通過與空白血漿、尿液進行比對，給藥后在血漿和尿液樣本中均未檢測出各化學成分的原型及代謝產物。

4 結論

本研究通過采用UHPLC Q-Exactive HRMS技術對三七極細粉醇提物中的化學成分進行了系統研究，共鑒定了41個化合物，其中3個為黃酮苷，另38個為皂苷類成分。健康男性口服正常劑量后，在不同時間點或時間段內的尿液中均未檢出原型及代謝物。究其原因，可能與以下三點因素有關：首先，可能由于人體常規口服劑量，吸收入血后不足以被檢測到；其次，由于三七極細粉中的成分主要為皂苷類成分，在腸道上皮細胞及腸道菌群中被水解為極性較低的苷元，然后在肝臟中直接或代謝后經膽汁排出；此外，由于這些代謝后的苷元類成分極性較低，在血液中不能以游離形式存在，可能主要分布于相關組織或臟器之中。以上觀點，后續需開展糞便成分檢測、動物水平的膽汁排放實驗或組織分布實驗加以驗證。

綜上，本試驗對三七極細粉醇提物中的化學成分進行了較為全面系統的質譜定性分析，同時對其人體口服吸收入血及尿液排泄情況進行了初步研究，可為后續全面的活性物質分析及定量指標控制研究奠定基礎。