不同轉染方法應用于體細胞轉基因效率的研究

趙廣偉,楊小玲,張孟奇,蘇勤智,陳 鳳*

(1.河南牧業經濟學院 動物科技學院,河南 鄭州 450046;2.中山大學附屬第七醫院 消化醫學中心,廣東 深圳518107)

采用基因轉染技術將目的基因片段導入到受體細胞中,是探索基因功能、生產基因編輯動物等重要的技術環節。高效的基因轉染效率與轉染方法和所轉染的供體細胞密切相關,適宜的轉染方法和恰當的供體細胞對提高基因轉染效率具有重要意義。增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)常用作報告基因來反映轉染效率的高低[1]。目前報道用于導入外源基因的轉染方法包括磷酸鈣法、脂質體法、病毒載體法、電穿孔法、顯微注射法和羅氏轉染試劑等[2-3],這些方法都有各自的優點和局限性,其中應用最為廣泛的是具有用時短、操作容易、適用范圍廣特性的脂質體、羅氏轉染試劑和電穿孔法。

基因編輯豬的生產具有重要的研究價值,可用于人源化器官培養、器官移植和人類疾病模型等生物醫學領域中[4]。廣西巴馬小型豬不僅在生理結構、新陳代謝和解剖學等方面與人類相近,而且其體型矮小更便于試驗操作,被認為是生物醫學研究領域的理想的模型動物[5]。豬體細胞克隆基因編輯手段是醫學模型研發中的主要工具之一,通常易獲得且培養和操作簡單的豬成纖維細胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs),被用作基因編輯豬的供體細胞。另外,研究顯示間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有易于導入和穩定高效表達外源基因的優點[6-7]。多項研究已證實MSCs作為供體細胞用于核移植以形成重構胚時,其囊胚率和克隆后代的出生率均明顯高于PFFs[8-9]?？紤]到轉染方法對不同細胞的轉染效果影響較大,因此在實驗室以往研究的基礎上[10],本研究選取EGFP作為報告基因,通過比較分析脂質體、羅氏轉染試劑和電穿孔法轉染PFFs、脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)和骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的效果,以期篩選更優的轉染方法和供體細胞,為生產基因編輯巴馬小型豬奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 選取來自廣西大學扶綏實驗基地的廣西巴馬小型豬的骨髓、脂肪和耳源組織;pEGFP-N1質粒載體(4.7 kb)購自北京啟研生物有限公司;電轉核轉染液購自碧云天生物公司;去內毒素質粒提取試劑盒來源于Qiagen公司;膠原酶購自Sigma公司;Lipofectamine TM 2 000脂質體轉染試劑盒和羅氏X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑分別購自Invitrogen公司和Roche公司;高糖DMEM培養基、Opti-MEM培養基購自Gibco公司,胎牛血清(FBS,OriCell)購自廣州賽業、0.25%胰蛋白酶-EDTA購自碧云天。

1.2 方法

1.2.1 質粒提取 將保存在-80 ℃冰箱中的載體菌種取出置于冰上,取10 μL接種到含有氨芐青霉素抗性的10 mL液體LB培養基中,放置在37 ℃、200 r/min 條件下的震蕩培養8～12 h。然后按照1∶1000的比例取相應量活化后的載體菌液轉接到液體LB培養基中,在相同條件下繼續震蕩培養8～12 h后按照Qiagen去內毒素的質粒大提試劑盒說明書進行質粒提取,最后采用分光光度計測定質粒濃度,放置在-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 細胞分離培養 參照實驗室已報道的細胞培養方法[5,11],分別采用膠原酶消化法、骨髓抽取法和組織塊貼壁法獲得ADSCs、BMSCs和PFFs的原代細胞。采用細胞完全培養液(高糖DMEM培養基+10%FBS+1%雙抗)在細胞生長到80%～90%匯合度時進行傳代培養。選取P3～P4的體細胞匯合度為70%～80%進行后續轉染試驗。

1.2.3 電穿孔法轉染 胰酶消化后,離心收集各備轉細胞加入少量培養液進行重懸,經細胞計數后將密度調整為每毫升106個細胞。離心棄上清后加入200 μL核轉染液,混勻后再向其中加入6 μg pEGFP-N1質粒,于室溫靜置5 min,最后將混合物轉移至2 mm電擊杯中。電轉參數參照本實驗室前期摸索的條件,設定為:180 v、10 ms、2 mm、1次電擊[10-11]。電擊完成后將細胞轉移到培養皿中,12 h后更換為完全培養液繼續培養36～48 h。

1.2.4 羅氏轉染 轉染開始前先將細胞的培養液換成不含雙抗的細胞正常培養液,然后按照X-tremeGENE HP DNA 試劑盒說明書進行轉染液的配制。6孔板細胞的轉染液用量和配制過程為:在500 μL DMEM培養基中加入3.0 μg pEGFP-N1質粒DNA和9 μL轉染試劑(質量體積比為1∶3),混勻后室溫靜置30 min,最后將轉染復合物逐滴加入到細胞培養液中,輕輕搖晃混勻后放入培養箱中培養36～48 h。

1.2.5 脂質體轉染 轉染開始前先將培養液更換為Opti-MEM轉染培養基,按照LipofectamineTM2 000轉染試劑盒的說明書配制6孔板培養細胞的轉染液,其中液體Ⅰ組分為2.0 μg pEGFP-N1質粒DNA和250 μL Opti-MEM轉染培養基,液體Ⅱ組分為10 μL Lipofectamine TM 2 000 試劑和250 μL Opti-MEM培養基。液體Ⅰ和Ⅱ配制后各自于室溫下靜置5 min后混合在一起,混勻后于室溫靜置20 min。最后將混合液輕輕逐滴加到待轉細胞培養液中,輕微搖晃混勻后繼續培養6 h,之后更換成細胞完全培養液繼續培養42 h。

1.2.6 細胞存活率分析 細胞轉染過程中將未進行轉染的供體細胞作為對照組,并經過細胞計數后確保各孔細胞接種時的數量一致。在轉染48 h時,用胰酶消化收集各組細胞,流式分析前先取少量細胞進行臺盼藍染色,再用血細胞計數板進行計數。細胞相對存活率即為各轉染組與相同細胞未轉染對照組活細胞數量的比值。

1.2.7 轉染效率的檢測 各組細胞在轉染48 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達情況,并拍照記錄。胰酶消化收集各組細胞,用PBS進行重懸,流式細胞儀檢測表達綠色熒光細胞的比例?；趯φ战M的自發熒光水平來設置門控條件標準,對比分析不同轉染方法和不同來源細胞條件下的細胞轉染效率。

1.2.8 統計學分析 細胞相對存活率和轉染效率數據用平均數(Mean)±標準差(SD)來表示,試驗重復3次。試驗采用SPSS26.0統計軟件對數據進行單因素ANOVA檢驗,以P<0.05表示有統計差異,以P<0.01表示差異顯著,P<0.001表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 細胞原代分離培養

3種體細胞的原代分離培養結果如圖1所示。脂肪組織塊經膠原酶消化后進行培養,第5天培養皿底有部分呈成纖維樣的細胞貼壁生長(圖1A);骨髓抽取后接種到培養皿中,24 h后觀察到少許未伸展開的細胞在皿底貼壁生長(圖1B);耳緣組織采用經典的組織塊貼壁法進行分離培養,第6天組織塊周圍有大量細胞往外生長、延伸,形狀呈典型的梭狀(圖1C)。

2.2 細胞轉染效果觀察

電穿孔法、脂質體和羅氏轉染試劑介導EGFP基因轉染豬ADSCs、BMSCs和PFFs 48 h后,在熒光顯微鏡下可觀察到不同程度的綠色熒光表達(圖2),初步表明不同的方法轉染豬不同體細胞效果不同。

圖2 EGFP在轉染48 h的表達情況

2.3 流式分析細胞轉染效率

3種方法轉染細胞48 h后進行流式分析,結果表明(圖3),轉染效率從高到低依次為電穿孔法>羅氏轉染試劑>脂質體,電穿孔法在ADSCs和BMSCs的轉染效率高達80%,轉染PFFs的效率也大于60%,明顯高于羅氏轉染試劑和脂質體在相同細胞中的轉染效率(P<0.001)。此外,羅氏轉染試劑的轉染效率(約20%)也顯著高于脂質體(約10%)(P<0.01)。

圖3 不同方法轉染體細胞的效率比較

相同方法轉染不同體細胞的比較見圖4。由圖4可見,采用羅氏和脂質體試劑分別轉染ADSCs、BMSCs和PFFs的效率無顯著性差異(P>0.05),而電穿孔法轉染MSCs的效率均顯著高于PFFs(P<0.01),但ADSCs和BMSCs間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 細胞存活率分析

3種體細胞采用不同方法進行轉染后的細胞存活率情況如圖5所示。由圖5可見,從高到低依次為羅氏轉染試劑>脂質體>電穿孔法,使用羅氏和脂質體轉染后的細胞存活率未見顯著性差異(P>0.05),但二者均顯著高于采用電穿孔法轉染后的細胞存活率(P<0.001)。

圖5 不同方法轉染相同體細胞的細胞存活率比較

采用同樣方法轉染豬不同體細胞的細胞存活率比較如圖6所示。由圖6可見,羅氏和脂質體試劑轉染3種體細胞的細胞存活率均在90%左右,而電穿孔法轉染3種體細胞的細胞存活率約為60%,3種體細胞在使用相同方法進行轉染后的細胞存活率差異不顯著(P>0.05)。

圖6 相同方法轉染不同體細胞的細胞存活率比較

3 討 論

基因轉染方法和供體細胞類型的選擇是外源基因最終能否獲得穩定高效表達的關鍵。不同來源的細胞因其生長特性不同,因此接受外源DNA的能力是不相同的。選取適宜的轉染方法將含有目的基因的片段導入到供體細胞中,并在其中高效、穩定的表達是生產基因編輯動物過程的關鍵環節。本研究選用在體細胞克隆中常用的MSCs和PFFs作為供體細胞,利用實驗室前期優化的電穿孔轉染程序以及商品化的脂質體和羅氏試劑,將pEGFP-N1載體分別轉染上述細胞,系統地比較不同方法和不同細胞條件轉染后的細胞相對存活率和轉染效率,為進一步的穩定轉染、篩選基因編輯陽性細胞用于基因編輯克隆豬的生產奠定基礎。

研究者通過優化膠原酶類型(Ⅰ型、Ⅱ型、混合型)濃度(0.075%～0.2%)和作用時間(0.5～2.5 h),建立從脂肪組織獲取ADSCs的方法。BMSCs的分離培養常常使用密度梯度離心法、細胞貼壁法和免疫磁珠法等。而采用抽取骨髓液置于皿內進行細胞貼壁培養的方法分離獲取BMSCs,不僅過程簡單易操作,而且不易受到污染。本研究分別采用經過證實且具有良好效果的膠原酶消化法、骨髓抽取法和組織塊貼壁法分別進行原代細胞分離培養,成功獲得了具備典型形態特征的 ADSCs、BMSCs 和 PFFs[11],它們傳至P5仍具有較快的增殖速度和良好的細胞形態,可用于轉染試驗。本研究結果顯示,3種轉染方法均可實現外源基因EGFP在ADSCs、BMSCs和PFFs的表達。其中,電穿孔法轉染豬體細胞的效率最高,但其細胞相對存活率低于其他兩種方法。前期研究結果顯示,電穿孔轉染中電壓的大小對細胞損傷和存活率影響最大,相對較高的電壓會提高轉染效率,但細胞的存活率隨著轉染效率的升高而降低[12]。另一項研究認為,使細胞的存活率在50%左右時的電轉染參數獲得的轉染效率最佳[13]。本研究采用電穿孔法轉染豬三種體細胞后的存活率均在60%左右,轉染效率在60%～80%之間(MSCs轉染效果最好),高于其他研究采用優化后的電穿孔法轉染成纖維細胞取得的轉染效率[14]。這可能與本研究中使用的核轉染體系有關,通過專門懸浮液配方和針對性的電場脈沖指數有效提高了轉染效率。本研究中,電穿孔轉染MSCs的效率高于PFFs,猜測可能與早期MSCs處于未分化、具備較好的細胞生長狀態以及適用的轉染參數等因素相關。目前,已有許多研究使用低細胞毒性的商業轉染試劑,但對它們轉染效果的評價卻不盡相同。本試驗結果表明,羅氏和脂質體試劑轉染細胞的毒性均較低,羅氏轉染試劑在三種體細胞的轉染效率均比脂質體高出一倍,類似于之前多個文獻報道的結果[15-16]。本試驗脂質體法轉染豬體細胞的轉染效率低于另一篇文獻的報道,采用優化后的脂質體轉染體系在PFFs中獲得了20%左右的轉染效率[17],這種差異可能與多種因素有關。研究認為,基因轉染的過程會受到許多不確定的因素影響,如細胞的生長狀態、質粒片段的長度與純度、質粒與轉染試劑比例、細胞接觸轉染液的時間等[15,18]。因此,對不同來源的細胞進行基因轉染操作時,應盡可能先優化這些因素,以提高轉染效果。

綜上所述,脂質體轉染雖然對細胞存活率的影響不顯著,但獲得的轉染效率較低,因此不建議采用脂質體試劑轉染豬體細胞。而電穿孔法的應用范圍更廣,對于商品化試劑難以轉染的間充質干細胞,也能獲得較高的轉染效率,綜合考慮該方法對轉染后細胞的存活有損傷,建議對于生長狀態較好的豬體細胞可采用經過優化的電穿孔法進行轉染。