關中奶山羊發情期不同時段宮頸陰道粘液非靶向代謝組學比較分析研究

冉本康,李 宇,賢 明,郭松茂,王立強,孟智利,李延華,王軍寧,李芳娥,杜燁青,胡建宏*

(1.西北農林科技大學 動物科技學院,陜西 楊凌 712100;2.富平縣華拓畜牧科技有限公司,陜西 富平 711700;3.陜西關中奶山羊專業合作社,陜西 富平 711700;4.陜西澳尼克奶山羊育種有限公司,陜西 富平 711700)

在規?；?、現代化畜牧業中,人工授精是常見的輔助生殖技術。奶山羊發情鑒定普遍采用公羊試情和外部觀察的傳統方法,極大程度上增加了養殖企業的勞動成本且鑒定準確率低,較難達到適時輸精的目的,加之奶山羊子宮頸口復雜結構的先天限制,導致奶山羊人工授精受胎率偏低[1-2]。在其它哺乳動物的研究上發現,一些物質可作為潛在的發情標志物。Pluta等[3]借助固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術檢測奶牛發情周期不同階段宮頸陰道粘液中的差異物質,篩選出奶牛發情的可能標志物是2-戊酮和4-甲基-2-戊酮。喬征磊[4]對圈養東北虎發情期尿液中的揮發物與非繁殖期做了對比,結果獲得了雌雄虎之間用于傳遞發情信息的信息素各1種,分別是苯酚和2-苯乙胺,以及可能用于性別識別的雄性信息素3種和雌性信息素7種。Mozūraitis等[5]檢測了奶牛發情不同時間段糞便的揮發性有機化合物,結果表明乙酸和丙酸的豐度顯示出了可重復的時間模式。Sankar等[6]采用氣相色譜-質譜檢測奶牛發情各階段糞便中的揮發性物質,發現乙酸、丙酸等物質特異性地存在于奶牛發情期,說明這些物質可作為奶牛發情及排卵的指示物質。因此,篩選關中奶山羊發情期不同時間段差異代謝產物能夠從分子層面幫助研究關中奶山羊的發情規律,進而開發基于靶向目標代謝物的發情鑒定新技術。非靶向代謝組學手段由于其高通量、高靈敏度的優勢可對生物體組織、體液、細胞培養物等的代謝狀態進行分析,進而篩選出不同生理狀態下的差異代謝物[7-9]。

基于此,本研究利用GC-MS探索關中奶山羊發情期特有的宮頸陰道分泌物中的代謝物隨發情期不同時間段的變化,為關中奶山羊發情鑒定技術提供新的思路和理論資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養管理

本試驗用羊由富平縣某關中奶山羊育種有限公司提供,3只體重在40～50 kg,2～3歲經產、體質健康的母羊。試驗場地為半開放附帶活動場式羊舍。試驗時間為2021年8月中旬,試驗期定期投喂常規日糧,自由飲水。

1.2 發情鑒定及樣品采集

試驗期間每天密切監視母羊發情跡象(搖尾、鳴叫、外陰分泌物),早晚兩次牽引公羊,掛試情布進行試情。公羊開始爬跨即確定發情,于每只母羊發情0～12 h(A組),12～24 h(B組),24～36 h(C組)使用開膣器,注射器連接一次性細管抽取發情母羊宮頸陰道粘液,-20 ℃保存待測,粘液采集順序為母羊發情順序。

1.3 宮頸陰道粘液代謝物提取

精確移取樣本50 μL于2 mL EP管中,準確加入1 mL乙腈:異丙醇:純水(3∶3∶2)混合溶液(-20 ℃),渦旋震蕩 30 s,室溫超聲5 min,12 000 rpm離心2 min,取上清液500 μL加入到一新的2 mL EP管中,真空濃縮儀濃縮至盡干(8～10 h),剩余上清液放置-80 ℃冰箱備份,在濃縮盡干的樣品中,加入80 μL的20 mg/mL 的甲氧胺吡啶溶液復溶,渦旋震蕩30 s,60 ℃孵育60 min,再最后加入100 μL BSTFA-TMCS (99∶1)衍生化試劑,渦旋震蕩30 s,70 ℃孵育90 min,14 000 rpm離心3 min,取上清液90～100 μL加入到檢測瓶中,樣品放置于密封盅內暫存待測,并于24 h內完成GC-TOF上機檢測。

1.4 上機檢測

氣相色譜采用DB-5MS毛細管柱(30 m × 250 μm i.d.,0.25 μm film thickness,Agilent J &W Scientific,Folsom,CA,USA)以1 mL/min的恒流氦氣來分離衍生化物質,1 μL樣品以分流比1∶10的方式通過自動進樣器注入。進樣口溫度為280 ℃,傳輸線和離子源溫度分別為320 ℃和230 ℃。升溫程序以50 ℃為初始溫度,持續0.5 min,以15 ℃/min的速率上升到320 ℃,并在320 ℃停留9 min。質譜采用的是全掃描方法,掃描速率是 10 spec/s,Electron Energy是-70 V,溶劑延時3 min。

1.5 質量控制

由圖1可知,紅色QC樣本聚集,重復性良好,說明系統穩定。

圖1 QC樣本PCA得分圖

1.6 數據統計分析

使用ABF Converter軟件將儀器檢測得到的“mzML”格式數據轉化成“abf”格式,再使用MS DIAL軟件對質譜數據進行了峰提取、基線過濾、校正、解卷積、峰對齊,采用Fiehn氣質數據庫對代謝物進行鑒定,并進行相對定量分析。

2 結果與分析

2.1 發情期不同時段宮頸陰道粘液組間代謝物多元分析

2.1.1 主成分分析(PCA) 如圖2所示,樣本全部處于95%置信區間。此外R2X為判別PCA模型質量可解釋度的主要參數,如表1所示,組間R2X均大于0.5,表明PCA模型可靠。

表1 PCA模型驗證參數

圖2 PCA得分圖

2.1.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA) 由圖3可見,3個時間組完全分離,進一步表明發情期關中奶山羊不同時段宮頸陰道粘液代謝物存在顯著差異。由表2可見,0～12 h vs 24～36 h的OPLS-DA模型參數R2Y(cum)=0.996、Q2(cum)=0.902均大于0.5,表明模型建立較好,所獲得的數據可用于差異代謝物的篩選。

表2 OPLS-DA模型驗證參數

圖3 正交偏最小二乘法判別分析

2.2 發情期宮頸陰道粘液差異代謝物篩選

2.2.1 差異代謝物篩選結果 差異代謝物如表3所示,將0～12 h和12～24 h的宮頸陰道粘液相互比較,篩選出6種差異代謝物;將0～12 h和24～36 h的宮頸陰道粘液相互比較,篩選出14種差異代謝物;將12～24 h和24～36 h的宮頸陰道粘液相互比較,篩選出3種差異代謝物;由倍性變化的log2值可知,0～12 h vs 12～24 h有5種上調的差異代謝物,1種下調的差異代謝物;0～12 h vs 24～36 h有6種差異代謝物上調,8種下調;12～24 h vs 24～36 h無差異代謝物上調,有3種下調。

表3 發情期不同時段關中奶山羊宮頸陰道粘液差異代謝物

2.2.2 典型差異代謝物統計分析 由圖4可見,三個時間段相比較,共有的差異代謝物有2,3-二氨基丙酸、半乳糖基甘油、2-羥基丁酸、亞?；撬?、D-無水葡萄糖、D-半乳糖、鄰苯二甲酸二乙酯。在發情期0～36 h內,2-羥基丁酸、D-無水葡萄糖、D-半乳糖、鄰苯二甲酸二乙酯的含量總體呈現上升趨勢,2,3-二氨基丙酸、半乳糖基甘油、亞?；撬岬暮匡@著下降。

圖4 典型差異代謝物柱狀圖

2.3 差異代謝物層次聚類分析

聚類分析可以清楚地了解差異代謝物間的相似或互補關系[10],圖5中橫軸表示不同時間組,縱軸表示相應的差異代謝物,紅色和藍色分別表示高和低的表達量。在發情期0～12 h與12～24 h奶山羊宮頸陰道粘液對比中(圖5a),半乳糖基甘油、2,3-二氨基丙酸、N-乙酰己糖胺、亞?；撬?、甘油在0～12 h高表達,在12～24 h低表達。2-羥基丁酸在0～12 h低表達,在12～24 h高表達;在發情期0～12 h與24～36 h奶山羊宮頸陰道粘液對比中(圖5b),1,5-酐-D-山梨糖醇、D-果糖、2,3-二氨基丙酸、半乳糖基甘油、尿素、亞?；撬嵩?～12 h高表達,在24～36 h低表達;D-無水葡萄糖、D-半乳糖、2-羥基丁酸、苯甲醇、尿嘧啶、氨基丙二酸、己醛糖、鄰苯二甲酸二乙酯在0～12 h低表達,在24～36 h高表達;在發情期12～24 h與24～36 h奶山羊宮頸陰道粘液對比中(圖5c),DL-2-羥基丁酸、N-乙酰己糖胺、D-無水葡萄糖在12～24 h低表達,在24～36 h高表達。

圖5 差異代謝物層次聚類分析

2.4 差異代謝物代謝通路分析

對差異代謝物進行KEGG通路富集分析,0～12 h vs 12～24 h的差異代謝物分布于9條代謝通路中(表4),其中6條通路存在顯著差異(P<0.05),分別是半乳糖代謝、甘油酯代謝、脂解的調控、逆行類內信號、?；撬岷蛠喤；撬岽x、熱成因。其中甘油酯代謝通路最為顯著,P值為0.0018648,-log(p)為6.2846,有2個差異代謝物富集于此代謝通路上,分別為甘油和半乳糖基甘油;0～12 h vs 24～36 h的差異代謝物分布于33條代謝通路中(見表5),其中11條通路存在顯著差異(P<0.05),最顯著的通路為半乳糖代謝,有3個差異代謝物富集于此通路,分別為D-無水葡萄糖、D-半乳糖、半乳糖基甘油;12～24 h vs 24～36 h的差異代謝物分布于24條代謝通路中(見表6),其中20條通路存在顯著差異(P<0.05),最顯著的通路為非酒精性脂肪肝病通路,富集于此通路的差異代謝物為D-無水葡萄糖。

表4 0～12 h vs 12～24 h差異代謝物代謝通路分析

表5 0～12h vs 24～36h差異代謝物代謝通路分析

表6 12～24 h vs 24～36 h差異代謝物代謝通路分析

3 討 論

哺乳動物的發情行為是一項復雜的生物學過程,涉及到不同生殖激素內分泌,機體不同代謝途徑的共同調節[11]。本研究首次通過非靶向代謝組學手段檢測發情期關中奶山羊宮頸陰道粘液中的代謝產物,來揭示關中奶山羊發情狀況隨時間變化的代謝特征以及相關的代謝途徑。在發情期關中奶山羊宮頸陰道粘液中共鑒定出221種不同的代謝產物,通過不同時段對比篩選出差異代謝物共16種,這些差異代謝物與關中奶山羊發情期性信息素的形成有關。通過對差異代謝物的分析,可尋找母羊發情期所釋放的特異性化學信號,提示代謝組學手段對生物代謝網絡及生理活動的認識具有重要意義。

宮頸陰道粘液的分泌是一個連續的過程,其成分、數量、物理和生化特性受雌性動物的發情周期和健康狀況的影響,因此采集宮頸陰道粘液的數量和質量會因采樣時間的不同而有顯著差異[12]。宮頸陰道粘液的生化結構復雜,是由流入陰道腔的宮頸粘液以及陰道壁滲出液、外陰分泌物、脫落的陰道上皮細胞和菌群分泌物組成[13]。其成分受多種變量的影響,如動物機體的內分泌狀態以及pH等。在類固醇激素的控制下,排卵期的宮頸陰道粘液比發情周期的其他時間更具流體性、粘性更小并且具有高的pH[14],與本研究中2,3-二氨基丙酸、2-羥基丁酸、亞?；撬?、氨基丙二酸的含量變化特征一致,具有酸性的代謝產物共同構建了關中奶山羊發情周期生殖道的pH環境。與Causey[15]對母馬的宮頸粘液研究結果一致,關中奶山羊宮頸陰道粘液含水(90%～98%)和無機離子、氨基酸、膽固醇、脂質、葡萄糖、抗壞血酸、多糖、粘蛋白、血漿蛋白、酶和殺菌蛋白。粘液的凝膠特性取決于黏蛋白,黏蛋白是粘液中的主要結構蛋白,是通過二硫鍵連接在一起的大型糖基化聚合物分子[16]。在0～12 h對比24～36 h中,氨基酸代謝物2-羥基丁酸、氨基丙二酸含量顯著升高,與粘液中黏蛋白含量上升,發情后期宮頸陰道粘液粘稠結構的形成有關,由黏蛋白構成的結構特性對后續精子的運動產生重要影響。

本研究中,0～12 h對比24～36 h,2-羥基丁酸、鄰苯二甲酸二乙酯發生上調,與Yeoman等[17]關于人類女性生殖道代謝組學的分析結果有類似之處,2-羥基丁酸是人類細菌性陰道炎癥診斷生物標志物2-甲基-2-羥基丁酸的前體物質,關中奶山羊發情期2-羥基丁酸的顯著上調成因可能是由于陰道菌群結構改變進而產生的次生代謝物產物。鄰苯二甲酸二乙酯是一類芳香族化合物[18],可能為母羊發情期釋放氣味信號的性信息素組成物質。結合2-羥基丁酸、鄰苯二甲酸二乙酯在關中奶山羊發情初期至排卵時間段顯著上升的現象,可推定2-羥基丁酸、鄰苯二甲酸二乙酯為關中奶山羊發情行為可能的特異性化學信號。

關于代謝物注釋,GC-MS分析技術在區分某些異構體的能力方面受到限制,例如D-半乳糖和D-無水葡萄糖,它們具有非常相似的保留時間 (RT) 和質譜碎片模式。另一個困難在于區分一些歸類為碳水化合物及其衍生物的代謝物。在這種情況下,最豐富的特征片段和衍生產物幾乎相同,因此注釋僅限于這些糖的半縮醛構象[19]。本研究中碳水化合物、有機酸類別的相關差異代謝物發現在比較組之間具有區分性,0～12 h對比24～36 h中數據顯示,己醛糖、D-半乳糖、D-無水葡萄糖水平呈現升高趨勢,這支持了碳水化合物消化吸收對于發情及排卵行為啟動的能量支撐作用。

宮頸陰道粘液中差異代謝物富集的代謝途徑眾多,?；撬岷蛠喤；撬岽x、精氨酸生物合成、生物素代謝、甘油酯代謝、嘌呤代謝等通路中相關代謝物發生上調,礦物質吸收、胰島素信號通路、催乳素信號通路、胰島素信號通路、HIF-1信號通路、胰島素阻抗、AMPK信號通路、胰高血糖素信號通路、范素和輔酶a的生物合成、β-丙氨酸代謝、味覺傳導、磷酸戊糖途徑、丙酸鹽代謝、氨基糖與核苷酸糖等代謝通路中相關代謝物發生下調。糖類和脂質相關代謝通路的代謝物差異變化是動物機體為創造排卵期生殖道適宜的精子存活及之后的獲能,受精環境的結果[20]。氨基酸、肽類、能量相關代謝通路的代謝物差異變化與宮頸陰道粘液物理結構的形成以及創造利于精子運動的物理環境和防止病菌感染的屏障作用相關。

4 結 論

本研究通過非靶向代謝組學技術篩選了關中奶山羊發情期不同時段宮頸陰道粘液的差異代謝物,這些差異代謝物參與了能量代謝、物質合成等多個代謝途徑,研究內容反映了關中奶山羊發情期不同階段的代謝差異,為后續新型發情鑒定技術的開發提供理論資料。