黑曲霉尿苷/尿嘧啶營養缺陷型轉化系統的構建及應用

王小平,宋 問,張 霏,劉 燕,王升帆,邵 東,梁玲玲,許新德,鄭建永

(1.浙江可明生物醫藥有限公司,浙江 新昌 312500;2.浙江工業大學 生物工程學院,浙江 杭州 310014;3.浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠,浙江 新昌 312500)

絲狀真菌黑曲霉(Aspergillusniger)廣泛存在于自然界中,它在食品與發酵工業領域有著舉足輕重的位置。黑曲霉具備強大的蛋白分泌表達和結構修飾能力,被稱為制備檸檬酸、抗生素和酶制劑的生物細胞蛋白工廠,目前被廣泛應用于食品、藥品、農業、工業和醫療等行業中[1]。黑曲霉作為一種食品級的安全生產菌株,已得到美國食品和藥品管理局的正式批準[2]。隨著現代生物的發展,黑曲霉領域取得了許多技術進步,轉化效率和目標蛋白的表達量均有一定程度的提高。其中,一個新的基因組標記手段和基因組編輯工具箱CRISPR-Cas9(成簇的規律間隔的短回文重復序列關聯蛋白技術)系統被進一步研究開發[3],實現了黑曲霉基因組中的基因敲除、基因插入、堿基編輯、啟動子替換和基因表達調控等[4-5]。然而,相較于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌,黑曲霉生長周期更長,轉化子的驗證和純化子的穩定遺傳也較為復雜。如果要建立一個良好的黑曲霉遺傳轉化體系,必然離不開一個快速且高效的篩選標記[6-7]。目前,黑曲霉中的常見篩選標記主要有3大類:1) 藥物抗性篩選標記,主要是抗性基因(潮霉素抗性[8]、博來霉素抗性[9]和G-418硫酸鹽抗性等[10]),這是一種根據轉化子耐藥性的篩選方法;2) 功能性篩選標記,較為常見的是營養缺陷互補型篩選標記(尿嘧啶營養缺陷型[11]、色氨酸營養缺陷型[12]等),即構建相應的營養缺陷型宿主,再向其轉入互補基因來恢復野生型表現,從而達到篩選陽性轉化子的目的;3) 可視化篩選標記,通過加入報告基因(紅色熒光蛋白[13]和增強型綠色熒光蛋白[14]等)達到一定的可視化效果,進而實現定性和定量的分析。

筆者利用CRISPR/Cas9技術構建了一株敲除黑曲霉CCTCC 206047乳清酸核苷-5′-單磷酸脫羧酶基因(pyrG)并能穩定遺傳的黑曲霉尿苷/尿嘧啶營養缺陷型菌株。尿苷/尿嘧啶營養缺陷型中pyrG基因編碼乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶,對尿嘧啶核苷的合成起重要作用。誘變劑5-氟乳清酸(5-FOA)通過進入嘧啶合成途徑來抑制細胞增殖,它先被轉化為嘧啶類似物,進而被轉化為尿嘧啶核苷合成中的自殺抑制劑5-氟尿嘧啶(5-FUMP)[15]。當培養基中含有5-FOA和尿嘧啶核苷時,正常菌株優先利用5-FOA,進而轉變成有毒的5-FUMP,導致菌株死亡。若該基因發生突變或被敲除,菌株直接利用培養基中添加的尿嘧啶核苷,因而可以正常生長。利用這一特性,還可以實現培養基的反向篩選,通過不添加尿嘧啶核苷的培養基篩選pyrG基因回補表達菌株。利用流式細胞儀的分選功能,篩選得到表達綠色熒光蛋白基因的工程菌。pyrG遺傳轉化體系的構建極大地簡化了黑曲霉轉化子的篩選流程,彰顯了報告基因和營養缺陷型標記在菌株基因改造中的巨大潛力。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質粒

黑曲霉CCTCC 206047、原核表達載體pET-28a(+)由本實驗室保藏;大腸桿菌感受態細胞E.coliDH5α購自杭州擎科新業生物技術有限公司;質粒pCAS_gpyrG1購自addgene網站(www.addgene.org/)。實驗構建質粒:pyrG敲除質粒P1-pyrGLR;pyrG回補質粒P2-pyrGYS;綠色熒光蛋白表達質粒P3-pyrGYS-gpdA-egfp。

1.1.2 實驗試劑

PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、QuickCutTMDpnⅠ,購自TakaRa公司;2×T5 Super PCR Mix,購自Tsingke公司;EasyPure Plasmid MiniPrep Kit,EasyPure PCR Purification Kit,購自TransGen公司;Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒,購自Sangon公司;其他常規試劑及藥品為國產或進口分裝。

1.1.3 培養基和溶液

DPY培養基:酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖20 g/L,KH2PO45 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L;PDA培養基:稱取200 g已削皮的馬鈴薯,充分煮沸,濾網過濾所得濾液中加入20 g葡萄糖,冷卻后定容至1 L,加入質量分數為2%的瓊脂粉,pH自然,115 ℃滅菌30 min;高滲CD固體培養基:蔗糖350 g/L,KCl 2 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,NaNO33 g/L,瓊脂20 g/L;高滲CD軟瓊脂培養基:成分同上,瓊脂質量濃度為5 g/L。以上培養基需高溫高壓滅菌,不含葡萄糖的培養基在高壓蒸汽鍋中121 ℃條件下滅菌20 min。

STC溶液:山梨醇10.93 g,Tris 0.303 g,無水CaCl20.28 g定容于50 mL超純水,pH自然,過膜除菌,4 ℃儲存;PEG緩沖液:PEG 6000粉末15 g,Tris 0.03 g,無水CaCl20.14 g定容于25 mL超純水,pH自然,過膜除菌,4 ℃條件下儲存;尿嘧啶核苷:10 g尿嘧啶核苷溶于10 mL超純水,過膜除菌,于-20 ℃條件下保存;潮霉素B(hygB):稱取0.5 g hygB溶于10 mL無菌ddH2O,0.22 μm濾膜過濾除菌并分裝,于-20 ℃條件下避光保存;0.8 mol/L NaCl溶液:NaCl 46.8 g,加入ddH2O溶解并定容至1 L;酶解液:0.2 g纖維素酶,0.1 g蝸牛酶,0.1 g溶壁酶,0.05 g溶菌酶,0.468 g NaCl,1 mL上述磷酸鈉緩沖液,加入9 mL ddH2O充分溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌,于4 ℃條件下保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉化質粒和片段的構建

根據表1中的引物,以黑曲霉CCTCC 206047基因組為模板,用引物Up-pyrG-F/Up-pyrG-R,Do-pyrG-F/Do-pyrG-R分別擴增pyrG基因(Gene ID:4985706)帶有同源臂的上游(1 407 bp)和下游(1 410 bp)基因片段。純化后的pyrG上下游片段互為引物和模板進行融合PCR,然后用引物pyrG-F/pyrG-R擴增pyrGLR片段(2 817 bp)。以質粒pET-28a(+)為模板,用引物28ZT-F,28ZT-R反向擴增載體片段(5 356 bp),通過一步克隆試劑盒組裝成質粒P1-pyrGLR;使用引物pET-28a(+)-egfppyrG-F/pyrG-R擴增pyrGYS(包含pyrG基因、上游啟動子和下游終止子片段),與載體pET-28a(+)連接后構建質粒P2-pyrGYS;以含gpdA啟動子(2 132 bp)和egfp基因(714 bp)的質粒為模板,使用引物28ZT-egfp-F/28ZT-R擴增載體片段,然后通過一步克隆試劑盒組裝成回補表達質粒P3-pyrG-gpdA-egfp。以上述3個質粒為模板,分別擴增pyrGLR(2 781 bp),pyrGYS(3 908 bp)和pyrGYS-egfp(4 236 bp)片段,用于后續黑曲霉原生質體的轉化。

表1 本實驗用到的引物

1.2.2 黑曲霉基因組的提取

挑取培養基上新鮮的黑曲霉孢子,加入50 μL緩沖液Buffer digestion后用電動手持研磨器研磨2 min,補足200 μL緩沖液Buffer digestion后加入20 μL Protein K和2 μLβ-巰基乙醇,混勻后56 ℃水浴1 h,使菌體組織充分裂解,然后使用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取轉化子基因組,具體操作詳見試劑盒使用說明。

1.2.3 黑曲霉轉化子的篩選

通過PEG介導原生質體轉化法將pyrG基因的上下游同源臂融合片段轉化到黑曲霉CCTCC 206047原生質體中。轉化實驗組的高滲CD培養基中需要添加尿嘧啶核苷和5-FOA作為篩選條件。30 ℃正置培養3～5 d,挑取平板上長出來的轉化子,轉移至含有5-FOA和尿嘧啶核苷的PDA平板中,獲得第一代轉化子。經基因組驗證正確的轉化子在對應平板傳代數次后,獲得一株穩定遺傳的營養缺陷型宿主。將pyrGYS和pyrGYS-egfp基因片段通過PEG介導原生質體轉化法導入到營養缺陷型宿主菌中,陽性轉化子可恢復野生型表型,使用基礎PDA培養基即可初步篩選。

1.2.4 5-FOA最小抑制濃度的確定

根據pyrG基因反向篩選的特性,通過在培養基中添加5-FOA來篩選野生型黑曲霉。具體的5-FOA用量(即對黑曲霉的最小抑制濃度)仍需考察。用已滅菌的移液器10 μL吸頭將野生型黑曲霉接種在含不同質量濃度5-FOA(0,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0 g/L)的培養基中,30 ℃培養3 d,觀察并記錄其生長抑制情況。

1.2.5 黑曲霉轉化子的遺傳穩定性

將在篩選平板中生長和基因組測序正確的轉化子接種到含5-FOA和尿嘧啶核苷的PDA平板中,在30 ℃恒溫培養箱中正置培養3～5 d,觀察其生長狀況,挑取生長良好的轉化子繼續傳代培養,以觀察其性狀的遺傳穩定性。

1.2.6 黑曲霉轉化子的抗性丟失

結合楊艷坤等[16]報道的菌株質粒丟失的高通量篩選方法,將含有抗性的黑曲霉營養缺陷型菌株進行抗性基因丟失處理。首先,對黑曲霉陽性轉化子進行稀釋涂布,挑取單菌落溶于無菌ddH2O中,經超聲處理后制成相對均一的孢子懸液;然后,接種于含5-FOA和尿嘧啶核苷的DPY培養基中,30 ℃,200 r/min條件下搖床培養4 h;最后,分別稀釋涂布于含hygB和不含hygB的篩選培養基中,30 ℃正置培養3～4 d。在含hygB的篩選培養基中無法生長,而在不含hygB篩選培養基中可以生長的菌株即為黑曲霉營養缺陷型Cas9質粒丟失菌株。

1.2.7 流式細胞儀FCM分選黑曲霉單孢子

將綠色熒光回補表達質粒轉入營養缺陷型宿主后,菌株將恢復合成尿苷能力,即菌株不僅能在基礎PDA培養基中正常生長,而且能表達綠色熒光蛋白,因而可用流式細胞儀分選轉化子。用PBS緩沖鹽溶液洗下在PDA轉化板中生長的黑曲霉孢子,用神奇濾布過濾后收集孢子,洗滌3次,稀釋至OD為0.3～0.5。以黑曲霉營養缺陷菌株的孢子懸液樣品作為陰性對照,樣品由流式細胞儀(BD FACSMelody)FITC-Log通道檢測。預先在48孔板中加入700 μL固體PDA培養基,將熒光信號強的單個孢子分選入單獨的孔中,30 ℃正置培養3～5 d。

1.2.8 轉化子的熒光測定

用EP管加入適量無菌水,挑取PDA培養基中適量的新鮮孢子進行稀釋。以營養缺陷型黑曲霉宿主菌的孢子懸液作為對照。準備干凈的載玻片,用移液器吸取10 μL孢子懸液滴在載玻片上,蓋上蓋玻片,輕輕按壓,擠去氣泡和多余的無菌水。將載玻片放置在熒光顯微鏡(EVOS M5000)的載物臺上,在20倍鏡明場下調節至清晰狀態,切換光源觀察樣品是否激發出綠色熒光。使用熒光成像系統(470/525 nm)進行檢測,以20倍物鏡拍攝熒光圖像。

2 結果與分析

2.1 利用CRISPR/Cas9技術敲除pyrG

近年來,通過同源重組將外源DNA靶向整合至黑曲霉和其他絲狀真菌基因組中的方法得到廣泛應用[17]。研究表明DNA雙鏈斷裂(DSB)能提高同源重組效率?，F在普遍存在的CRISPR/Cas9便是為快速靶向DSB而設計的[18]。在本研究中,利用質粒pCAS_gpyrG1表達Cas9蛋白和pyrG-SgRNA序列,通過Cas9蛋白引導pyrG-SgRNA序列到黑曲霉基因組pyrG位點[19],實現基因組編輯,從而達到敲除pyrG的目的。利用CRISPR/Cas9技術敲除pyrG的原理如圖1所示。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術敲除黑曲霉pyrG示意圖Fig.1 Schematic diagram of principle of knock out of Aspergillus niger pyrG using CRISPR/Cas9 technology

2.2 pyrG基因敲除菌株的篩選及驗證

參照Boeke等[20]為釀酒酵母開發的突變體的陽性選擇法來篩選黑曲霉的pyrG突變體。該方法基于pyrG缺陷型突變體在尿嘧啶或尿苷存在下對5-FOA的抗性。由于pyrG基因編碼乳清酸核苷-5′-單磷酸脫羧酶,能夠將無毒的5-FOA催化為毒性產物5-FUMP,故尿苷/尿嘧啶營養缺陷型轉化子能在含有5-FOA的培養基中正常生長,而未破壞/敲除pyrG的宿主菌無法生長。黑曲霉轉化子和宿主菌株在篩選培養基中的生長情況如圖2所示。由圖2可知:黑曲霉陽性轉化子(a,b,c區域)可以在含有5-FOA和尿苷的復篩培養基中正常生長,而宿主菌株(d區域)無法生長。

圖2 黑曲霉轉化子和宿主菌株在篩選培養基中的生長情況Fig.2 Growth of Aspergillus niger transformants and host strains in screening medium

提取在篩選培養基上表型正常的黑曲霉轉化子的基因組,用引物YZ-1,YZ-2進行基因驗證,采用核酸電泳檢測。引物YZ-1,YZ-2位于pyrG左右同源臂上,陽性轉化子和陰性轉化子PCR擴增條帶應相差1 127 bp。黑曲霉中熒光缺陷型轉化子基因組PCR電泳結果如圖3所示。圖3中:泳道control為宿主對照菌株對照組;泳道1,2,3,4為敲除pyrG菌株樣品組;泳道M為核酸分子量標準品2K plus Ⅱ Marker;泳道5,6的PCR產物條帶單一且表觀分子質量與理論分子質量相符,將其送去測序。實驗結果表明利用CRISPR/Cas9技術可以實現黑曲霉CCTCC206047中pyrG基因的成功敲除。

圖3 黑曲霉中熒光缺陷型轉化子基因組PCR電泳結果Fig.3 PCR electrophoresis results of transformant genome in Aspergillus niger

2.3 黑曲霉轉化子的抗性基因丟失

對測序正確的黑曲霉營養缺陷型菌株進行抗性丟失處理,結果如圖4所示。在含潮霉素B的篩選培養基中無法生長,而在不含潮霉素B篩選培養基中可以生長的菌株即為黑曲霉營養缺陷型Cas9質粒丟失菌株。將黑曲霉營養缺陷型轉化子命名為PA-1,隨后進行pyrG基因回補表達。

圖4 轉化子在含或者不含hygB篩選培養基中的生長情況Fig.4 Growth of transformants in screening media containing or without hygB

2.4 5-FOA最小抑制質量濃度的確定

5-FOA自身對黑曲霉細胞沒有毒性,然而黑曲霉宿主表達的pyrG酶能夠將5-FOA催化為有毒性的5-FUMP,從而殺害自身細胞。觀察黑曲霉在含有不同質量濃度的5-FOA培養基中的生長情況,從而確定達到抑制效果的5-FOA最小質量濃度。5-FOA最小抑制質量濃度如表2所示。表2中:“+”代表黑曲霉宿主可以生長;“-”代表黑曲霉宿主不可以生長)。由表2可知0.75 g/L的5-FOA不能完全抑制黑曲霉宿主的生長?？紤]到5-FOA的成本和抑制效果,后續實驗選擇5-FOA質量濃度為1.0 g/L。

表2 5-FOA最小抑制質量濃度

2.5 黑曲霉轉化子的遺傳穩定性

挑取測序正確的黑曲霉陽性轉化子PA-1在篩選培養基中進行傳代培養,考察其遺傳穩定性。篩選培養基為含有5-FOA、尿嘧啶核苷的PDA培養基。黑曲霉轉化子的遺傳穩定性如圖5所示。由圖5可知:陽性轉化子經10代遺傳后在篩選培養基中長勢良好,進而驗證了敲除pyrG基因的這一性狀在黑曲霉轉化子中能夠保持穩定的遺傳。

圖5 黑曲霉轉化子的遺傳穩定性Fig.5 Genetic stability of Aspergillus niger transformants

2.6 黑曲霉營養缺陷型菌株的回補表達

為了考察pyrG基因的有效性,將pyrG基因重新導入尿苷/尿嘧啶營養缺陷型菌株PA-1中,測試轉化后菌株的表型?；匮a表達黑曲霉轉化子的驗證結果如圖6所示。由圖6(a)可知:pyrG回補后的黑曲霉菌株可以在不添加尿嘧啶核苷和5-FOA的基礎PDA培養基中生長。使用引物YZ-3,YZ-4進行PCR,驗證提取轉化子的基因組中是否含有pyrG基因。由圖6(b)可知:泳道2,5,6,7,10的黑曲霉轉化子的表觀分子質量與理論分子質量2 310 bp相符。實驗證明了從黑曲霉CCTCC206047基因組中擴增得到的pyrGYS回補標記可用于pyrG型尿嘧啶/尿嘧啶核苷營養缺陷型黑曲霉恢復突變,同時證明黑曲霉PA-1是一株可進行基因轉化的pyrG缺陷型菌株。

圖6 回補表達黑曲霉轉化子的驗證Fig.6 Validation of complementary expression in Aspergillus niger transformants

2.7 黑曲霉轉化子熒光表達情況

增強型綠色熒光蛋白EGFP是GFP優化后的衍生物,具有更強的熒光信號,已成為評估遺傳轉化系統的重要工具。黑曲霉分生孢子的熒光表達情況如圖7所示。由圖7可知:與沒有熒光的親本菌株PA-1相比,egfp基因回補表達轉化子PG-gpdA的分生孢子有較為明顯的熒光現象。實驗結果表明:黑曲霉回補pyrG基因的同時能實現目標基因egfp的高效表達,可進一步通過流式細胞儀進行定量分析。

圖7 黑曲霉分生孢子的熒光表達情況Fig.7 Fluorescence expression of Aspergillus niger conidia

2.8 流式細胞儀的分選

利用流式細胞儀分析egfp基因回補表達黑曲霉菌株PG-gpdA,通過流式細胞儀的分選功能,將熒光信號強的單孢子分選到48孔板中。流式細胞儀的分選情況如圖8所示。由圖8可知:PDA平板中的10 000個孢子中約有12.4%的孢子能表達egfp;流式細胞儀分選后的單孢子在48孔板上存活率達85.4%;隨機挑選基礎培養基上生長的轉化子到熒光顯微鏡下進行觀察,均能觀察到較為明顯的熒光信號。

圖8 流式細胞儀的分選情況Fig.8 Flow cytometry sorting diagram

3 結 論

以黑曲霉CCTCC 206047基因組為模板,利用CRISPR/Cas9系統實現pyrG基因的重組敲除,在含有5-FOA、尿嘧啶核苷和潮霉素B的培養基上篩選表型正確的轉化子。通過考察黑曲霉轉化子的遺傳穩定性和基因組PCR擴增驗證,進一步獲得一株成功敲除黑曲霉pyrG基因的陽性轉化子,丟失抗性質粒后即為黑曲霉pyrG營養缺陷型菌株PA-1,經10代遺傳后轉化子在篩選培養基中長勢良好,驗證了敲除pyrG基因的這一性狀能夠穩定遺傳。將包含黑曲霉pyrG基因表達框的重組質粒P2-pyrGYS轉化至營養缺陷型菌株PA-1中,恢復其野生型表型,進而驗證該營養缺陷型系統的可行性。利用該遺傳轉化系統可實現egfp基因的重組表達,通過營養篩選和流式細胞術為黑曲霉轉化子提供雙重檢測指標。該篩選辦法簡化了黑曲霉陽性轉化子的篩選流程,建立了一個快速的可視化的高通量篩選模型。然而該檢測辦法仍處于孢子水平,后續目的基因的表達仍受分泌途徑和菌絲形態的調控,仍需建立更加精確的黑曲霉篩選技術。