BmOsi9a基因在家蠶胚胎細胞周期中的功能研究

劉雪冰 袁雨桐 張然 張基開朗 劉春,2 程廷才,2

[1. 資源昆蟲高效養殖與利用全國重點實驗室(西南大學), 重慶 400716;2. 重慶市蠶絲生物材料與再生醫學工程技術中心, 重慶 400716]

1972年,LINDSLEY等[1]在研究果蠅非整倍體對果蠅生長發育的影響時,發現位于果蠅基因組3號染色體上有1個三倍體致死或單倍體致死位點,簡稱為Tpl(Triplo-lethal Locus)。Tpl基因重復型雜合子和缺失型雜合子與野生型果蠅雜交的后代致死,表現為部分卵無法孵化或在1齡幼蟲期死亡。致死胚胎或幼蟲出現氣管破裂,中腸變成黃棕色,內部器官退化等表型。直到2003年,科學家在Tpl位點發現了由20多個基因組成的基因簇,并將其命名Osiris基因,認為這些表型可能是由Tpl位點的Osiris基因簇所致[2]。

在家蠶基因組中,胡文波等[3-4]研究發現了22個Osiris同源基因,其中有21個位于26號染色體,另1個位于4號染色體。使用SMART網站進行在線預測,家蠶Osiris基因家族蛋白中有20個含有典型的功能未知的DUF1676結構域。此外,家蠶Osiris蛋白中還存在分泌信號肽結構域和跨膜結構域[5]。在線預測家蠶Osiris基因家族編碼蛋白質的結構域,發現家蠶Osiris基因開放閱讀框(ORF)長度為723～882 bp,對應蛋白質分子量在26～31 kDa之間[6]。劉春等[7]對包括家蠶、黑脈金斑蝶、小菜蛾、紅帶袖蝶、蜜蜂和果蠅等多種昆蟲的Osiris基因進行系統進化分析,發現Osi9亞家族基因成員之間的相似性約為60%,并且Osi9亞家族的多基因拷貝只存在于鱗翅目昆蟲中。家蠶中部絲腺高量表達Sericin-1(Ser1)基因[8],而Osi9a基因呈現出與Ser1基因相似的表達譜。Osi9a在家蠶胚胎發育期4～7 d表達,與家蠶胚胎絲腺的形成時間相一致。Osi9a蛋白也存在于除絲腺以外的繭殼中,并且在多種鱗翅目泌絲昆蟲中都被檢測到。特別是在家蠶的繭殼中,Osi9a蛋白的豐度僅次于絲素和絲膠蛋白[9]。程廷才等[10]用在家蠶中過表達Osi9a蛋白的方式,發現Osi9a過表達使得繭絲的力學性能發生改變,繭絲彈性模量增強,繭絲強度減弱,繭絲二級結構中的β-折疊含量減少,結晶度下降。

已有研究表明Osiris基因可能參與到昆蟲的防御系統中,在幾丁質和角質層的形成中起著重要作用[11-13],但具體的分子機制并不清楚。因此,本研究為了揭示BmOsi9a基因的生物學功能,通過在家蠶胚胎細胞系中過表達和下調該基因的表達,對其分子機制進行初步探索,為進一步揭示Osiris基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究使用的BmE細胞系為家蠶胚胎起源細胞系,由本實驗室保存使用。大腸埃希菌T1購于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BmE細胞RNA提取及RT-PCR和RT-qPCR

根據Triozl試劑盒實驗方案提取家蠶胚胎細胞BmE細胞系的RNA,根據Promega公司的反轉錄試劑盒(A5001)說明書制備家蠶胚胎細胞BmE cDNA。同時,利用Primer Premier 5.0軟件設計BmOsi9a基因的引物進行擴增,RT-PCR和RT-qPCR所使用的引物見表1。

表1 BmOsi9a的RT-PCR和RT-qPCR引物序列

RT-PCR反應體系的總體積為10 μL,包括:2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL,10×PCR Buffer 1 μL,2 μmol/L正向引物/反向引物各1 μL,250 U r-Taq酶0.1 μL,Milli-Q水5.1 μL。反應程序為:94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸50 s,共30個循環;72 ℃延伸7 min后16 ℃保存。

RT-qPCR實驗采用Promega的熒光定量試劑盒進行,以BmRpl3基因為內參(表1),20 μL的反應體系中含SYBR染料10 μL、2 μmol/L正向引物/反向引物各2 μL、cDNA模板2 μL,Milli-Q水4 μL。反應程序為:95 ℃ 30 s; 95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,共40個循環;60 ℃ 1 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s。利用2-△Ct法計算目標基因的相對表達量。

1.2.2 免疫熒光檢測

在可傳代的細胞上進行目的基因質粒轉染實驗。首先,將細胞均勻鋪于帶有爬片的24孔板中,培養48 h后,將培養基去除,用PBS進行洗滌,棄PBS后加入4%多聚甲醛室溫固定15 min。隨后,在搖床上用1×PBS洗滌3次(每次5 min),洗滌完畢后加入1% Triton X-100室溫靜置打孔15 min,再次用1×PBS洗滌。配制封閉液,1 mL配制體系:羊血清100 μL,1×PBS 900 μL,并將其加入每個孔中(每個孔300 μL),在37 ℃恒溫培養箱中封閉1 h。按1∶200的比例配制一抗,標記好屬源性之后直接加入孔中,在37 ℃恒溫培養箱中孵育1～1.5 h。隨后,回收一抗,進行1～2次PBS清洗。接下來避光按1∶800的比例配制二抗,并在37 ℃恒溫培養箱中孵育1 h,隨后進行1～2次PBS清洗,DAPI染色并進行封片處理。如果共轉染2種質粒,則先孵育1個抗體,然后再孵育另1個抗體,確保2個抗體具有不同的屬性,并且二抗的熒光顏色錯開。最后,使用共聚焦顯微鏡觀察[Olympus corporation(FV1000)]并拍攝圖像。

1.2.3BmOsi9a過表達載體及干涉載體構建

(1)BmOsi9a過表達載體的構建。根據家蠶BmOsi9a基因的ORF序列設計擴增引物(表2),其中,正向引物5′端包含有BamHⅠ酶切位點,反向引物包含有NotⅠ酶切位點,并且在上游和下游引物中均添加入Myc標簽。從5齡第3天幼蟲的絲腺cDNA中擴增回收目的片段并克隆至psL1180載體中。

表2 BmOsi9a細胞過表達檢測引物序列

(2)BmshOsi9a干擾載體構建。設計的干擾載體序列(表3)由深圳華大基因股份有限公司合成。引物退火用超純水溶解使其總濃度為20 μmol/L。將20 μmol/L正向引物/反向引物各5 μL、10×Buffer M 5 μL、Milli-Q水 35 μL,按照上述反應體系配制于1.5 mL離心管中,置于100 ℃水浴鍋中,關閉電源,自然降至室溫,隨后在4 ℃條件下保存。使用AgeⅠ、EcoRⅠ酶切pLKO.1載體,并將上述雙酶切產物與退火產物進行連接,隨后轉化至大腸埃希菌T1,挑選菌落,測序并保存陽性質粒。

表3 BmshOsi9a干擾載體鑒定引物序列

1.2.4 細胞復蘇及轉染

(1)細胞復蘇。從液氮中取出BmE細胞并迅速解凍于27 ℃,然后在超凈工作臺將其轉移至細胞培養瓶并置于恒溫細胞培養箱(27 ℃)中進行培養。(2)細胞培養。BmE細胞在細胞培養瓶中以配制好的培養基培養,培養基一般換3次左右細胞就能長滿,此時需要傳代,傳代步驟同細胞復蘇。(3)細胞轉染。首先,當細胞密度達到80%左右時即準備進行轉染實驗:準備2個10 mL的離心管,并向每個離心管中加入1.5 mL的無抗無血清的Grace培養基;接下來,在一個離心管中添加轉染試劑(轉染試劑與質粒的比例為2∶1),在另一個離心管中分別加入質粒,并靜置5 min;然后將2個離心管中的液體混合到一個離心管中,靜置20 min;接著,取出待轉染的細胞,棄掉舊的培養基,并將之前混合好的轉染試劑加入細胞中,輕輕混勻后將細胞置于恒溫細胞培養箱(27 ℃)中培養;經過6～10 h培養便棄掉舊的培養基,加入有抗血清的Grace培養基繼續培養48 h后,使用熒光顯微鏡[ZEISS(3527001973)]觀察細胞并進行拍照,對結果進行統計分析。

1.2.5 BrdU染色

將待處理的細胞收集并進行血球板計數。將細胞用培養基稀釋至2 000個/mL,取500 μL細胞懸液加入24孔細胞培養板中,然后置于恒溫細胞培養箱(27 ℃)中培養24 h。細胞培養24 h后,向每個孔中加入BrdU(終濃度為250 μmol/L),輕輕搖晃混勻,然后繼續在恒溫細胞培養箱(27 ℃)中孵育4 h。棄掉培養基,使用1×PBS進行1～3次洗滌。向每個孔中加入1 mL 4 %多聚甲醛,固定15 min,然后使用1×PBS進行1～3次洗滌。向每個孔中加入500 μL 2 mol/L鹽酸,在37 ℃下孵育15 min,然后使用1×PBS洗滌3次。向每個孔中加入500 μL含有1% Triton X-100的PBS溶液,室溫下孵育15 min,然后使用1×PBS洗滌3次。根據說明書配制Click反應液(碧云天試劑盒C0071L),注意避光操作,并在室溫下避光孵育30 min。吸去孔板中的反應液,使用1×PBS進行洗滌,每次洗滌5 min。向每個孔中加入200 μL DAPI,室溫孵育15 min。棄掉DAPI染色液,使用PBS進行1～2次洗滌。最后在熒光顯微鏡[ZEISS(3527001973)]下采集并保存數據。

1.2.6 流式細胞術檢測

首先,待細胞密度達到70 %時棄掉舊的培養基,加入無抗無血清的Grace培養基,并使用巴氏吸管輕柔吹打細胞,將細胞轉移到一個5 mL離心管中。將離心管以750×g的離心力在4 ℃溫度條件下離心5 min,棄掉上清液,然后用PBS洗滌細胞,并加入1 mL 75%乙醇,在4 ℃下固定至少24 h。再次以750×g的離心力,在4 ℃下離心3 min,棄掉上清液,使用含有RNase的1×PBS洗滌細胞2次。用檢測細胞周期試劑(按照1∶100體積比在含0.005 μg/ μL RNase的PBS中加入1 mg/mL碘化丙啶)重懸細胞,37 ℃室溫避光30 min。隨后,將上述細胞懸液放入流式細胞儀(Sparrow2040)進行檢測,最后使用FlowJo軟件對數據進行分析。

1.2.7 Western blot檢測

(1)制膠后上樣:取適量蛋白質樣品于1.5 mL離心管中,加入適量5×SDS-PAGE Loading Buffer調節終濃度為1×,混勻后經95 ℃金屬浴孵育3～5 min使蛋白質完全變性,瞬時離心后即可上樣,也可在-20 ℃條件下存放。(2)電泳:制備好的樣品每孔上樣10 μL,恒壓電泳,初始為80 V,當樣品電泳至分離膠時,轉至120 V電泳,直至溴酚藍染液到膠板底部停止電泳。(3)轉膜:將PVDF膜浸泡在99.5%甲醇中激活2 min,然后轉至純水中,待膜不再旋轉為止(轉膜條件:25 V,1.2 A,15～20 min)。(4)封閉:將膜轉至5%脫脂奶粉中,4 ℃過夜。(5)孵育一抗:用1%脫脂奶粉配制一抗溶液,一抗Ab-BmOsi9a稀釋比例為1∶10 000,將封閉好的PVDF膜完全浸泡于一抗中,37 ℃搖晃1 h。(6)洗膜后孵育二抗:用1%脫脂奶粉配制山羊抗兔二抗溶液,二抗稀釋比例為1∶20 000,將洗好的膜完全浸泡于二抗溶液中,37 ℃搖床輕搖2 h。(7)洗膜后曝光:將顯影液的A、B液按1∶1比例加入離心管中,顛倒混勻,均勻滴加在膜上,避光放置5 min,按照曝光儀操作說明進行曝光觀察。

2 結果與分析

2.1 BmOsi9a基因 mRNA轉錄及蛋白質表達分析

為了確定BmOsi9a在家蠶胚胎細胞BmE的表達情況,采用RT-PCR、RT-qPCR和Western blot,從基因mRNA轉錄及蛋白質水平進行分析。結果表明:BmOsi9a基因在BmE細胞中有明顯的轉錄表達(圖 1-A、B),證實了BmOsi9a蛋白在BmE細胞中的存在(圖 1-C)。以上結果為進一步的功能分析提供了依據。

(A) RT-PCR (B) RT-qPCR (C) Western blot圖1 BmOsi9a基因在BmE細胞中的表達分析

2.2 BmOsi9a蛋白的亞細胞定位

為了準確確定BmOsi9a基因在家蠶胚胎細胞BmE中的表達定位情況,采用免疫熒光技術,通過抗體來檢測和可視化BmOsi9a蛋白的位置,結果如圖2所示:BmOsi9a定位于細胞質。細胞質是細胞內許多重要的生物過程和活動發生的場所,包括信號傳導、蛋白質合成、代謝調控等。BmOsi9a在細胞質中的定位提示其可能在調節這些生物過程中發揮著功能性的角色。

圖2 免疫熒光實驗觀察BmOsi9a蛋白在BmE中的亞細胞定位

2.3 過表達BmOsi9a對細胞增殖能力的影響

為了探索BmOsi9a在BmE細胞中的功能,通過構建BmOsi9a過表達載體(圖 3-A),使BmOsi9a基因成功在BmE細胞中過表達(圖 3-B),該基因的mRNA水平和蛋白質水平都已經顯著上調。BrdU實驗顯示BmE細胞的BrdU陽性率無明顯變化,表明細胞的DNA合成能力無顯著變化,即過表達BmOsi9a并未對細胞增殖產生顯著影響(圖3-C)。

(A) 1180-BmOsi9a陽性克隆的PCR檢測(B) 蛋白質及mRNA水平檢測BmOsi9a上調表達,“****”示P<0.000 1(C) BrdU實驗檢測上調BmOsi9a后對BmE細胞增殖無影響圖3 上調BmOsi9a表達對BmE細胞增殖的影響觀察

2.4 下調BmOsi9a對BmE細胞增殖能力的影響

通過構建BmOsi9a細胞干涉載體,在BmE細胞中降低了BmOsi9a蛋白的表達水平(圖4-A)。與對照組相比,實驗組細胞的形態發生了明顯的改變,血球計數板顯示的細胞數量也明顯減少,推測下調BmOsi9a抑制了細胞增殖。為了驗證這一猜想,我們進行了BrdU實驗,發現下調BmOsi9a后,DNA復制的細胞數目顯著減少,細胞增殖受到抑制(圖4-B)。

(A) 蛋白質及mRNA水平檢測BmOsi9a下調情況(B) BrdU實驗檢測下調BmOsi9a后BmE細胞增殖受到抑制,“****”示P<0.000 1。圖4 下調BmOsi9a表達抑制BmE細胞增殖的觀察

2.5 下調BmOsi9a對BmE細胞周期的影響

細胞周期是細胞增殖的基礎,我們推測BmOsi9a可能誘導了細胞周期阻滯進而影響了細胞增殖。為此,進一步使用流式細胞技術來檢測細胞周期是否發生改變,結果顯示:下調BmOsi9a后BmE細胞系的細胞周期發生了明顯的變化,與對照組相比,實驗組處于G0期/G1期的細胞顯著增加,而處于S期的細胞則顯著減少(圖5-A),由此表明細胞周期被阻滯在G0期/G1期。為了更加明確地闡釋下調BmOsi9a對細胞周期的影響,通過Western blot實驗從分子水平檢測下調BmOsi9a對細胞周期蛋白的影響,結果表明:與G0期/G1期相關的細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4、CDK2以及細胞周期蛋白CyclinE1的表達水平隨著BmOsi9a的下調也明顯降低(圖5-B)。

(A) 流式細胞術檢測下調BmOsi9a后細胞周期受阻的情況(B) Western blot檢測下調BmOsi9a后細胞周期相關蛋白表達水平, “***”示P<0.001,“*”示P<0.05。圖5 下調BmOsi9a表達阻滯BmE細胞周期的檢測

3 討論

本研究采用多種技術手段,包括RT-PCR、RT-qPCR、Western blot、RNAi以及細胞周期分析等,對BmOsi9a的功能進行了初步探索。研究結果表明,在BmE細胞中,BmOsi9a蛋白主要定位于細胞質。細胞質中有許多其他細胞器和亞細胞結構相互作用,因此BmOsi9a可能參與調節這些結構和器官的功能。進一步做細胞干涉實驗發現,下調BmOsi9a后抑制BmE細胞增殖,并且將細胞周期阻滯在G0期/G1期。這些結果表明BmOsi9a在細胞分裂過程中發揮著重要的作用,并且對細胞增殖具有顯著的影響。

然而,在BmE中過表達BmOsi9a后,對細胞增殖卻無明顯影響,推測可能有如下原因:(1)BmE本身已經處于高增殖狀態,BmOsi9a表達量的增加對細胞的增殖就顯得微不足道;(2)基因劑量效應,過表達BmOsi9a基因后,可能由于基因的過量表達導致細胞內某些調節機制的負向反饋或抑制作用,使得細胞增殖沒有被促進;(3)調節基因的時機和空間表達,BmOsi9a基因的調節可能在細胞生命周期的不同階段和細胞不同區域發揮作用,過表達BmOsi9a基因可能導致其在不適當的時機或空間過量表達,從而未能促進細胞增殖。

未來可以進一步探索BmOsi9a在細胞分裂調控中的作用機制,并且探究其與細胞周期相關蛋白的相互作用關系。此外,可以考慮研究其在其他昆蟲中的作用,并且還可以結合系統生物學的方法,探究BmOsi9a對于細胞生長和分化等生物過程的調控機制,為深入闡釋其生物學功能提供更多的證據和基礎理論。